猪伪狂犬病毒PCR检测方法的优化

猪伪狂犬病是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的一种疱疹病毒性疾病,在世界大部分地区都是地方性家畜流行病。而且猪伪狂犬病与其他猪传染病不易区分,因此,建立一个特异性强的检测方法对于其诊断具有重要意义。实验是在实验室已经建立伪狂犬病毒单项PCR检测方法的基础上,对扩增条件进行优化后对其特异性进行了验证。结果发现,优化后的方法特异性好,只有猪伪狂犬病毒扩增为阳性,其余DNA病毒:猪细小病毒、猪圆环病毒Ⅰ型(PCV1)、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)均呈现阴性。因此,本研究方法可以为今后实验室检测猪伪狂犬病毒提供参考。     

猪伪狂犬病毒纳米PCR检测方法的建立

[目的 ]快速灵敏检测猪伪狂犬病毒(PRV)[方法 ]根据PRV g B基因设计特异性引物,建立了PRV纳米PCR检测方法。[结果 ]PRV纳米PCR方法的最低检出限为10拷贝/μL,其敏感性比未添加纳米金的对照PCR提高100倍;建立的纳米PCR与猪细小病毒、猪圆环病毒Ⅱ型、猪繁殖与呼吸综合征病毒等常见猪病毒性病原均无交叉反应。应用纳米PCR和PRV国家标准中的PCR方法,对2014—2016年期间采集自17个省市发病猪场的148份临床样品进行平行检测,PRV纳米PCR的阳性检出率为49.3%(73/148),PRV国标PCR方法的阳性检出率为23.6%(35/148),并且PRV纳米PCR检测为阳性,而PRV国标PCR方法检测为阴性的38份样品,测序结果均确认为PRV阳性。[结论 ]本研究建立的纳米PCR检测方法敏感特异,可用于猪伪狂犬病的病原学检测。     

猪伪狂犬病毒PCR检测方法的建立及应用

根据猪伪狂犬病毒（PRV）gE基因序列保守区段,设计一对特异性引物,通过优化反应条件,建立了可区分猪伪狂犬病毒野毒株与基因缺失疫苗株的PCR检测方法,并对该方法的敏感性、特异性和重复性进行了验证。结果显示,该PCR方法可扩增出388 bp的目的片段;对模板的最低检测量为1.1 pg;与猪圆环病毒Ⅱ型、猪细小病毒、猪支原体、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪乙型脑炎病毒、猪流行性腹泻病毒无交叉反应,具有高特异性。采用建立的PCR方法对2014年以来全国不同地区81个猪场421份疑似病料进行检测,发现PRV猪场平均阳性率为35.80%,样品平均阳性率为 25.42%。该方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可用于PRV的临床诊断和流行病学调查。     

伪狂犬病毒荧光定量PCR检测方法的建立

根据猪伪狂犬病毒gD基因的序列,设计和合成了一对特异的可用于检测伪狂犬病毒的PeR引物和一条Taqman荧光探针,采用LightCycle 480荧光定量PCR仪,建立了一种可实时定量检测猪伪狂犬病毒的荧光定量PCR技术。该方法的线性范围为1．0×10^1-1．0×10^10拷贝,灵敏度可达2拷贝,比常规PCR高100倍。该方法检测时间短,速度快,仪器的运行时间仅为1h,特异性明显高于常规PCR。对15株猪伪狂犬病毒进行了检测,结果均为阳性;与猪细小病毒和鸭瘟病毒无非特异性反应。与病毒分离培养和常规PeR相比较,该方法具有快速、灵敏、特异、定量、重复性好的优点,可望用于,临床上伪狂犬病的检测和病毒分布的研究等。     

PCR技术检测猪伪狂犬病毒及其潜伏感染部位的研究

本研究合成了伪狂犬毒糖蛋白ｇｐ５０基因引笺，该引物能够扩增糖蛋白ｇｐ５０基因中４３４－６５１之间的２１７ｂｐＤＮＡ片段，该片段含 ＳａｌＩ酶切位点，应用引物对几种不同的伪狂犬病毒株多聚酶链式反应扩增结果全为阳性。     

猪伪狂犬病毒和猪细小病毒双重PCR方法的建立及初步应用

目的本研究旨在建立一种适用于临床样品和动物源性生物制品中猪伪狂犬病毒和猪细小病毒同时检测的双重PCR技术。方法针对猪伪狂犬病毒(PRV)的gE基因和猪细小病毒(PPV)的VP2基因的保守区域分别设计引物。结果经条件优化后,所建立的双重PCR方法能特异性地检测出样品中的PRV(581bp)和PPV(202bp)。结论本方法具有良好的特异性、敏感性和稳定性,适用于临床样品中对PRV和PPV的同时检测,也可用于猪源性生物制品的检测。     

实时荧光定量PCR法检测猪伪狂犬病毒灭活疫苗抗原含量的研究

本研究根据GenBank公布的猪伪狂犬病毒gB基因保守序列设计引物和TaqMan探针,采用实时荧光定量PCR方法检测猪伪狂犬病毒灭活疫苗的抗原含量,并对方法的特异性和敏感性进行验证.结果显示:该方法灵敏度可达102 TCID50/mL,只对猪伪狂犬病毒有特异性扩增曲线,其他4种对照病毒均为阴性;检测猪伪狂犬病毒灭活疫苗...     

PCR检测猪伪狂犬病病毒方法的研究

根据编码猪伪狂犬病病毒gH基因保守序列，设计合成一对引物，通过改进病毒核酸提取方法和优化PCR反应条件，成功的从猪伪狂犬病毒感染的细胞中扩增出预期的355bp片段。而猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪乙型脑炎病毒和正常细胞均未扩增出相应的片段，经NaeⅠ酶切鉴定，证实了该扩增片段的特异性；敏感性实验表明，该体系可检测到0．48Pg的猪伪狂犬病毒DNA。本方法的建立使猪伪狂犬病病毒的检测更为快速、简便、经济、实用。     

猪伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型TaqMan-MGB双重荧光定量PCR检测方法的建立及应用

参照GenBank中猪伪狂犬病毒(PRV)gE基因以及猪圆环病毒2型(PCV2)中ORF2特异性序列,设计特异引物和TaqMan-MGB探针,通过优化反应条件,建立了同时检测PRV野毒株和猪圆环病毒(PCV2)的双重荧光定量PCR检测方法,并验证该方法的特异性、敏感性、重复性。结果表明,该方法检测PRV和PCV2灵敏度分别可达2.23×101、4.5×102拷贝/μL,均比常规PCR检测方法高100倍;同时检测猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、均为阴性,无交叉反应;对30份疑似病料进行检测并与普通PCR进行比较,结果显示,二者检测PRV的总符合率为96.67%,检测PCV2的总符合率为93.33%。本试验建立的TaqMan-MGB双重荧光定量PCR检测方法可同时对PRV野毒株和PCV2进行早期快速诊断,可应用于病原学监测,流行病学调查等。     

猪圆环病毒、猪细小病毒及猪伪狂犬病毒多重PCR诊断方法的建立

多重PCR技术是在同一PCR体系中放入多对引物,对多种目的基因同时扩增的分子生物学诊断方法,具有快速、敏感、特异等优点.猪圆环病毒(PCV)、伪狂犬病病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV)是引起母猪繁殖障碍的主要病原.为了建立快速敏感的检测上述病毒的方法,特进行如下试验.     

基于猪伪狂犬病毒gE基因的PCR法快速诊断猪伪狂犬病的研究

为了建立一种快速检测猪伪狂犬病毒(PRV)的方法,试验采用PCR法,并以NCBI公布的PRV Min-A株(登录号为AY170318.1)的gE基因序列为参考序列设计1对特异性引物,进行PRV基因的扩增,并对该检测方法的特异性、敏感性、重复性进行验证。结果表明:该PCR检测方法扩增的目的基因长348 bp;应用此方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)进行PCR扩增均未有条带出现;该方法能够检测到的最低DNA模板量为10 pg;重复性良好;应用此法对43份临床样品进行检测,检出率为65.12%(28/43)。说明该PCR检测方法可用于PRV的分离鉴定、临床病料检测和分子流行病学调查等。     

PRV、PCV2与PPV三重PCR检测方法的建立与初步应用

为建立可同时检测猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)与猪细小病毒(PPV)的三重PCR方法,根据Gen Bank登录的病毒相关基因序列,选择保守区域设计引物,经过反应条件的优化,建立了可同时检测以上3种病毒的PCR诊断方法,扩增的目的片段长度分别为192 bp(PRV)、255 bp(PCV2)和759 bp(PPV)。对PRV、PCV2和PPV的核酸检测最低浓度分别为:2.5×10-2,2.2×10-3和3.7×10-2ng,证明该方法具有良好的特异性和较高的敏感性。应用该方法对56份临床样品进行检测发现,PRV、PCV2和PPV的阳性率分别为16.1%、50.0%和19.6%,二重感染率为12.5%,三重感染阳性率为3.6%。该方法的成功建立为快速高效地检测以上3种病毒提供了有效手段。     

猪伪狂犬病PCR诊断方法的建立

根据伪狂犬病病毒(PRV)gB基因的序列,设计并合成了一对引物,以闽A株细胞培养毒为模板,筛选最佳反应条件,建立了检测PRV的PCR方法,应用本方法对分离的病毒进行基因扩增,获得了217bp的特异性DNA片段,证明了对分离病毒检测的特异性和敏感性,为伪狂犬病的快速诊断提供了条件。     

集贸市场肉样中伪狂犬病病毒携带状况的初步调查

从集贸市场随机采集97头份猪肉样本、53头份羊肉样本、50头份牛肉样本,应用双抗体夹心ELISA和PCR方法,平行检测样本可能含有的伪狂犬病病毒。结果97头份猪肉样中,双抗体夹心ELISA方法检出伪狂犬病病毒19份(19.6%),PCR检出25份(25.6%);牛肉样本中ELISA阳性数为0,PCR阳性2份(4%);羊肉样本中两种方法均为阴性。这两种方法均为阳性和阴性的份数为12和170,总符合率为89.2%。结果说明猪伪狂犬病的控制对提高肉食品品质具有重要作用。     

山羊源伪狂犬病病毒的分离与鉴定

为确诊一例发病山羊是否感染伪狂犬病病毒,采集发病羊体的肺脏和脑组织进行伪狂犬病病毒gE基因PCR检测,并将病料接种至PK-15细胞分离病毒,以及进行小鼠感染试验和gD基因分析。结果表明,PCR检测结果 PRV阳性,病料接种PK-15细胞24h后,细胞开始出现细胞病变;将病毒感染小鼠,36h后小鼠出现局部奇痒、死亡;gD基因序列分析发现,分离毒株与GenBank中的PRV gD基因序列同源性均在98%以上,氨基酸同源性在99%以上;在分离毒株gD基因的808bp~837bp位置上存在缺失与变异、高变重复区。本研究成功分离获得一株羊源伪狂犬病毒,为云南省羊伪狂犬病防控和基础研究提供资料。     

伪狂犬病病毒实时荧光PCR的建立和应用

伪狂犬病是世界范围内严重影响养猪业发展的重要动物疫病,快速检测是有效防控该病的重要措施之一。为了建立该病的快速分子生物学检测方法,根据GenBank中登录的伪狂犬病病毒gD基因序列,选择高度保守区域设计引物和TaqMan荧光探针,通过对实时荧光PCR反应条件进行优化,建立了用于检测伪狂犬病病毒的实时荧光PCR方法。特异性试验结果表明,该检测方法只能检测到目的病毒,表明其具有良好的特异性。灵敏性试验发现,其最低检测限可达1.42pg/μL的总DNA,与PCR方法的灵敏度对比试验表明,其敏感度比PCR至少高10倍。对同一样品进行重复性检测,在组内及组间检测的荧光扩增曲线基本重叠,证实其重复性好。对180份临床样品进行伪狂犬病病毒核酸检测,结果发现有52份阳性样品。结果表明,所建立的实时荧光PCR方法可对伪狂犬病病毒进行准确、快速的检测,具有特异性好、灵敏度高、重复性好的优点,是开展伪狂犬病的临床检测和疫情监测工作的有力工具。     

用于诊断4种猪病毒病的寡核苷酸芯片的研制

制备可同时检测引起集约化养猪业常见4种传染病，病毒（猪流感病毒、口蹄疫病毒、猪伪狂犬病毒、猪蓝耳）的寡核苷酸芯片。根据4种猪疫病病毒特异性基因的保守区域设计合成了60mer寡核苷酸探针，制备寡核苷酸芯片。采用不对称PCR和间接荧光标记技术进行单链DNA扩增和荧光标记，标记样品与寡核苷酸芯片杂交后，进行芯片清洗、扫描及结果分析。杂交结果显示，4种病毒的寡核苷酸检测探针均特异地与相应的标记样品杂交，芯片上呈现较强的阳性杂交信号，而除阳性质控探针外，阴性对照和空白对照均检测不到荧光信号。证明寡核苷酸芯片适用于快速、准确、高通量地诊断影响集约化养猪业的多种猪疫痛病毒。     

PRV、PPV双重PCR检测方法的建立及其应用

为建立一种能够快速诊断猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)的方法,根据GenBank上发表的PRV、PPV核苷酸序列分别设计并合成了两对能特异性扩增PRV、PPV的引物,经过条件优化后,建立检测PRV、PPV的双重PCR方法,扩增两种病毒的片段分别为570bp、748bp。试验证明,该方法具有良好的特异性和敏感性,省时、省力、快速、敏感、高效的特点,为PRV与PPV的快速诊断试剂盒组装及流行病学的研究提供了技术支持。     

2012年—2013年我国集约化猪场猪伪狂犬病病毒感染情况的调查

为研究全国范围内中大型猪场猪伪狂犬病病毒(PRV)感染情况,在2012年—2013年,应用PCR方法及gE-ELISA试剂盒对采集自17个省126个集团或猪场的164份病料、2 212份血清进行猪伪狂犬病(PR)病原及血清野毒gE抗体的检测。结果表明,病料样品中,PRV野毒阳性率为34.1%,PRV野毒阳性猪场占检测猪场总数的38.6%;血清样品中,PRV野毒抗体阳性猪场48个,猪场阳性率为38.1%,总样品阳性率为14.96%;2013年的感染率比2012年的高,且冬、夏两季PRV野毒阳性率较高;保育猪的PRV野毒阳性率最高,为22.34%,种母猪群PRV野毒阳性率为14.32%;华东地区PRV阳性比例最高,南方地区的PRV野毒阳性率高于北方地区。通过本次调查,说明PRV在我国的猪场依然普遍存在,对猪场进行PR的控制和净化是非常必要的。