一株鸭源H9亚型禽流感病毒分离株生物学特性研究

对分离到的1株鸭源H9N2亚型禽流感病毒(NJ01株)的生物学特性进行了研究。研究结果显示:其静脉致病指数IVPI为0,脑内致病指数ICPI为0.26,血凝解脱时间NHAT为慢,血凝热稳定时间HOT为30 m in。以108.0ELD50/羽的剂量静脉感染26日龄非免疫鸭,可使40%鸭致死,且从攻毒后存活鸭1 d+2 d喉拭子中100%分离到该病毒;而以相同剂量静脉感染1月龄SPF鸡后不出现死亡,但攻毒后4~6 d的泄殖腔拭子中,均可100%再分离到该病毒。毒株血凝素基因的RT-PCR试验结果显示,与1997年香港3个分离株的同源性为94.8%~96.0%,其HA裂解位点处氨基酸序列为-RSSRG-。研究结果表明该NJ01株为低致病性禽流感病毒,属欧亚大陆分支,在SPF鸡及非免疫鸭体内均能很好地复制。     

H9亚型禽流感病毒NJ01株动物回归试验前后生物学特性比较

将鸭源H9亚型禽流感毒株NJ01在SPF鸡胚上所传第四代（E4）,经静脉注射回归8日龄非免疫樱桃谷鸭,取死亡鸭肺组织作为病毒重分离材料,接种SPF鸡胚,收获24～96h死亡鸡胚尿囊液,混合为F1,取F1,按上述方法再次进行回归试验并分离病毒,收获的病毒液记为F2,取E4、F1及F2病毒液,对其生物学特性进行了比较研究。研究结果表明：F2较E4对鸡胚的敏感性增强,其MDT／MLD值减小,对44日龄非免疫樱桃谷鸭静脉攻击的感染性增强,以10^8.5ELD50／羽的剂量攻毒后1d＋2d喉拭子的病毒重分离阳性率由3／5增至4／5。     

一株鸭源H9亚型禽流感病毒的分离及鉴定

从发病雏鸭体内分离到1株具血凝活性病毒,并鉴定为H9亚型禽流感病毒。取发病鸭肺作为病毒分离病料,接种10日龄SPF鸡胚,死亡鸡胚尿囊液具血凝活性,且不能被已知鸡新城疫(ND)阳性血清、产蛋下降综合症EDS-76单克隆抗体、禽流感H5亚型阳性血清抑制,但能被禽流感H9亚型阳性血清抑制,血凝抑制价为211。该毒株经中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室鉴定为H9N2亚型。对分离株进行的研究结果表明,该毒株为低致病力毒株,其ICPI为0.26,IVPI为0。用第三代鸡胚尿囊液原液0.5 m l静脉注射8日龄樱桃谷鸭,雏鸭死亡率达50%。     

表达H9亚型禽流感病毒HA基因重组鸭肠炎病毒的构建

【背景】H9亚型禽流感病毒（AIV）存在宿主范围扩大、毒力增强的趋势,并为其他亚型AIV重排提供基因,给养禽业和公共卫生造成极大威胁。水禽不仅是流感病毒的宿主,更是其天然储存库,在禽流感病毒的传播和变异中发挥着重要作用。因此有效控制水禽感染对养禽业健康发展、公共卫生安全具有重要意义。鸭肠炎病毒（DEV）属于疱疹病毒,能感染鸭、鹅等雁形目禽类,可引起产蛋下降及高死亡率。DEV基因组大,免疫原性好,具有开发成活疫苗载体的潜力。【目的】构建缺失gE基因、表达H9亚型AIV HA基因的重组病毒rDEV-△gE-HA,探讨重组病毒rDEV-△gE-HA作为防治DEV-AIV的二联重组活载体疫苗的可行性。【方法】以H9N2亚型禽流感病毒HA基因作为靶基因,构建含有HA基因表达盒的转移载体pT-gE-HA,将其与携带绿色荧光蛋白标记的重组rDEV-△gE-GFP共转染CEF细胞后,进行蚀斑筛选、纯化表达HA基因的重组病毒rDEV-△gE-HA;利用PCR、基因测序鉴定重组病毒;在CEF中连续传代重组病毒20次,测定外源基因传代稳定性。以10 ³ TCID₅₀免疫易感鸭,分析重组病毒rDEV-ΔgE-HA对致死性DEV强毒攻毒保护效果;将不同剂量（10 ³-10 ⁶TCID₅₀）rDEV-△gE-HA免疫鸭,免疫后14、21、28 d分别采集血清,测定H9血凝抑制（HI）抗体,并在免疫后28 d,以10 ⁸EID₅₀的剂量静脉注射H9N2 AIV（A/duck/GD/08）,攻毒后2 d,采集喉拭子,进行病毒分离试验。【结果】将构建的转移质粒载体pT-gE-HA与rDEV-△gE-GFP共转染CEF细胞,经过3轮蚀斑筛选,获得纯化的重组病毒rDEV-△gE-HA。PCR鉴定及基因测序结果显示,HA基因成功地插入到DEV基因组中,替换了绿色荧光蛋白。重组病毒在CEF中至少能稳定传代20代。重组病毒rDEV-ΔgE-HA以10 ³ TCID₅₀免疫易感鸭,能抵抗致死性DEV强毒攻击。重组病毒rDEV-ΔgE-HA免疫易感鸭后14 d,各剂量免疫组均能检测到H9 HI抗体效价;免疫后21日,各组抗体效价水平略有上升,10 ³TCID₅₀剂量免疫组HI抗体效价达到1:2 ⁴,而10 ⁴-10 ⁶TCID50剂量免疫组HI抗体效价在1:2 ^2.4-1:2 ³。免疫鸭后28 d,用H9N2 AIV进行攻毒,10 ³、10 ⁴、10 ⁶TCID₅₀免疫组均未从喉拭子分离到病毒H9N2,说明能完全保护,阻止喉头排毒,而10 ⁵TCID₅₀免疫组保护率为80%（4/5）,1/5病毒分离阳性。【结论】成功构建了稳定表达H9亚型AIV HA基因的重组DEV,该重组病毒保留了亲本毒的免疫原性,能抵抗致死性DEV强毒的攻击;免疫鸭后能诱导产生AIV HI抗体,尽管HI抗体滴度不高,但至少80%免疫鸭能阻止排毒。该研究为研制DEV-H9亚型AIV二联重组活载体疫苗奠定了基础。     

不同类型H5亚型禽流感疫苗的免疫保护效力比较研究

为比较以我国首个H5亚型禽流感病毒分离株A/Goose/Guangdong/1/1996(H5N1)\[GS/GD/96\]为基础构建的新型重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型,Re\|1株）、禽流感重组鸡痘病毒载体活疫苗（H5亚型）、禽流感、新城疫重组二联活疫苗（rLH5\|1株）以及禽流感DNA疫苗（H5亚型,pH5\|GD）的免疫保护效力。分别将四种禽流感疫苗以2.8 μg HA/0.3 mL（肌肉注射）、103PFU/100 μL（刺种）、106EID50/100 μL（滴鼻、点眼）、15 μg/200 μL（肌肉注射）等不同剂量和方式免疫3周龄SPF鸡,首次免疫3周后再加强免疫一次,加强免疫2周后用106EID50的高致病力禽流感病毒（HPAIV） GS/GD/96鼻腔途径进行攻击,观察发病与死亡情况。分别于攻毒后第3 d、第5 d、第7 d采集喉头及泄殖腔拭子进行病毒分离、滴定检测排毒情况,同时检测免疫及攻毒后血清HI抗体的动态变化。所有疫苗均可对免疫鸡形成100%完全保护（不发病、不致死、不排毒）;在病毒攻击前,灭活疫苗（H5N1亚型,Re\|1株）、禽流感重组鸡痘病毒载体活疫苗（H5亚型）、禽流感、新城疫重组二联活疫苗（rLH5\|1株）以及禽流感DNA疫苗（H5亚型,pH5\|GD）所诱导的HI抗体平均水平分别为875log2、6.5log2、5.13log2和7.88log2。新型的基因工程疫苗具有良好的免疫保护性,已经或将在H5亚型HPAIV的防治实践中起到有益的补充作用。     

重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗免疫商品肉鸭和SPF鸭的效果研究

为了解重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗(H5N1,Re-6株+Re-8株)的免疫效果,为临床上制定合理的禽流感疫苗免疫程序提供依据,试验选取14日龄樱桃谷商品肉鸭30只和SPF鸭30只,注射重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗(Re-6株+Re-8株)0.4 m L/只作为首次免疫,饲养至28日龄时,樱桃谷肉鸭、SPF鸭随机分成A、B和C、D组,每组均为15只,B、D组再次颈部皮下注射该疫苗0.5 m L/只,均从14日龄起每周采集血清一次,直至56日龄,检测H5抗体情况。结果表明:不同品种鸭对同一亚型禽流感疫苗免疫效果存在差异,首次免疫的日龄可以提至7~10日龄,商品肉鸭一次免疫即可满足防疫需要。     

中药制剂SHY对新城疫、禽流感H9、H5亚型病毒的抑制和攻毒保护效果

本试验利用蔷薇科植物提取物（SHY）分别与新城疫、禽流感H9、H5亚型病毒作用后,接种10 d SPF鸡胚,评价SHY对病毒的抑制作用;给21 d SPF鸡连续口服该中药提取物5 d后,分别用新城疫、禽流感病毒攻击,观察对SPF鸡的保护作用.结果表明：SHY测试剂量对SPF鸡胚没有毒性;20、10、5和2.5 mg/mL提取物与一定量的新城疫、禽流感H9亚型病毒作用后,鸡胚全部存活,病毒测定为阴性;与禽流感H5亚型病毒作用后,2.5 mg/mL组不能完全保护鸡胚存活（6/8）,病毒分离阳性.在攻毒试验中,SPF鸡分别按60、50、40和20 mg口服后,用新城疫和禽流感H9亚型攻毒保护分别为5/5、5/5、5/5和4/5.显示SHY不但能显著抑制新城疫、禽流感H9和H5亚型在鸡胚上增殖,而且能保护新城疫、禽流感H9亚型病毒的攻击.对SHY深入的研究,有望开发出有效抗禽流感药物.     

灭活后无血凝价的禽流感H_5亚型病毒的免疫原性研究

0. 4 %甲醛灭活后血凝价为 0的 2株禽流感H5亚型病毒制备的油乳剂疫苗免疫 14 0日龄蛋鸡 ,疫苗免疫 10天后HI抗体水平分别升到 8. 0Log2、6 . 2Log2以上 ,免疫后 17～ 2 4天HI抗体水平升到高峰 (8. 8Log2、7. 8Log2 ) ,免疫 38天后能抵御剂量为 4ELD50 的同种强毒的攻击。结果表明 ,灭活后血凝价为 0的禽流感H5亚型病毒与灭活后血凝价为 5的病毒抗原的免疫原性无显著差异     

鸡新城疫、禽流感(H9亚型)、禽腺病毒(Ⅰ群,4型)三联灭活疫苗(La Sota株+TJ株+HY株)抗体产生期和免疫持续期试验

以实验室制备的3批制品各经颈部皮下接种7日龄和21日龄SPF鸡,7日龄鸡于免疫后7、11、14、21、28 d及1、2和3个月;21日龄鸡于免疫后7、11、14、21、28 d及1、2、3、4和5个月时采血,分离血清,分别测定免疫鸡血清中鸡新城疫病毒、禽流感(H9亚型)病毒和禽腺病毒抗体效价。试验结果表明,实验室3批制品免疫7日龄SPF鸡后,免疫后11 d鸡新城疫病毒、禽流感(H9亚型)产生抗体,21～28 d时3种病毒抗体均达到抗体高峰,高峰期持续至免疫后1个月,免疫后3个月下降到有效保护标准以下。三联疫苗免疫21日龄SPF鸡,免疫后11 d鸡新城疫病毒、禽流感(H9亚型)产生抗体,针对3种病毒的抗体在免疫后21～28 d达到抗体高峰,高峰期持续至免疫后2个月,免疫后3个月开始下降,免疫后5个月下降到有效保护标准以下。因此,鸡新城疫、禽流感(H9亚型)、禽腺病毒(Ⅰ群,4型)三联灭活疫苗(La Sota株+TJ株+HY株)免疫2周龄的鸡免疫持续期为2个月,免疫2周龄的鸡免疫持续期为4个月。     

悬浮MDCK细胞的驯化与H5亚型禽流感病毒的培养

【目的】为评估细胞源重组禽流感病毒H5亚型灭活疫苗的有效性提供数据支持。【方法】选取一株来源清楚的贴壁MDCK细胞,通过逐步降低培养基中血清含量及不断调整无血清培养基配方,将其驯化为悬浮MDCK细胞,并以此为基质增殖重组禽流感病毒H5N1 Re-6株、H5N1 Re-7株和H5N1 Re-8株;比较不同毒株在贴壁和悬浮MDCK细胞中增殖的差异。分别将经悬浮MDCK细胞增殖的病毒与经SPF鸡胚增殖的病毒制备成重组禽流感病毒(H5亚型)三价灭活疫苗,免疫商品蛋鸡和商品鸭,通过血清学方法比较细胞源与鸡胚源禽流感灭活疫苗的免疫效果。海兰褐商品蛋鸡:6 050只,分为3组,2组为免疫组,每组3 000只,28日龄免疫0.5 mL/只,80日龄免疫0.5 mL/只;不免疫对照组1组,50只,同等条件下隔离饲养。分别于蛋鸡日龄49、110、210 d(即首免后21 d、82 d、6个月)时采血分离血清,测定禽流感H5亚型Re-6株、Re-7株、Re-8株的HI抗体效价,监测抗体消长。长白飞鸭:220只,分为3组,2组为免疫组,每组100只,10日龄免疫0.5 mL/只,24日龄免疫1.0 mL/只,不免疫对照组20只,同等条件下隔离饲养。分别于鸭日龄24、38、52 d(即首免后14、28、42 d)时采血分离血清,测定禽流感H5亚型Re-6株、Re-7株、Re-8株的HI抗体效价,监测抗体消长。【结果】获得一株可在无血清培养基中悬浮生长的MDCK细胞,摇瓶、5L生物反应器中的培养数据及细胞状态显示,该细胞株适合放大生产。此悬浮MDCK细胞培养48 h细胞密度可由1.5×10~6 cells/mL左右增殖到1.0×10~7 cells/mL左右,状态良好、活率高、单个悬浮于培养基中。以此悬浮MDCK细胞为基质增殖重组禽流感病毒,H5N1 Re-6株的HA效价达1﹕512,TCID_(50) 10~(7.67)/mL,EID_(50) 10~(7.83)/0.1 mL;H5N1 Re-7株的HA效价达1﹕256,TCID_(50)达10~(7.33)/mL,EID_(50)10~(7.17)/0.1 mL;H5N1 Re-8株的HA效价达1﹕1024,TCID_(50) 10~(8.5)/mL,EID_(50) 10~(8.38)/0.1 mL,与经贴壁MDCK细胞增殖的病毒毒价相当。细胞源三价灭活疫苗免疫海兰褐商品蛋鸡,首免后21 d时,禽流感H5亚型Re-6株、Re-7株、Re-8株HI抗体效价几何平均值(GMT)分别为1﹕446、1﹕111、1﹕416,二免后30 d时三者HI抗体效价几何平均值(GMT)分别为1﹕588、1﹕362、1﹕776,6个月时分别为1﹕239、1﹕128、1﹕223,维持了较高的抗体水平;免疫长白飞鸭,首免后14 d时,禽流感H5亚型Re-6株、Re-7株、Re-8株HI抗体效价几何平均值(GMT)分别为1﹕30、1﹕17、1﹕64,28 d时三者HI抗体效价几何平均值(GMT)分别为1﹕194、1﹕91、1﹕137,42 d时分别为1﹕416、1﹕128、1﹕239;以上两组的试验结果与鸡胚源重组禽流感灭活疫苗免疫后诱导产生的HI抗体效价相当。【结论】经驯化获得的可在无血清培养基中悬浮生长的MDCK细胞株,其增殖重组禽流感病毒H5N1 Re-6株、H5N1 Re-7株、H5N1 Re-8株能力强,且病毒被制备成灭活疫苗免疫海兰褐商品蛋鸡和长白飞鸭可产生较高水平的抗体。为大规模工业化生产禽流感疫苗提供技术支持。     

Correlation Research of the Serological Test (HI) and Challenge Test of Duck Tembusu Virus Inactivated Vaccine

【Objective】The objective of this paper was to evaluate the correlation of the serological test (HI) and challenge test of duck Tembusu virus inactivated vaccine.【Method】Three batches of vaccines ( laboratory trial products) were used to immunize the 51-day-old young ducks and 260-day-old laying ducks by intramuscular injection in 0.15, 0.3, 0.5 and 1.0 mL, respectively. Secondary immunization was proceeded in the same doses and route at 14 day after primary immunization. Ducks were regrouped according to the HI titer and challenged with 0.5 mL (100 DID₅₀) DTMUV at day 28 after secondary immunization. Serum samples were collected at 2 days later for virus isolation and laying ducks were dissected at 8 days later to observe the ovarian lesions. All the results were counted to evaluate the immune potency of vaccines. The correlation of HI titer and immune protection rate was analyzed.【Result】The protection rate of immunized young ducks with HI titer of 1:5 or lower, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640 was 50% (20/40), 43.8% (7/16), 74.3% (26/35), 86.7% (26/30), 96.6% (57/59), 92.7% (51/55), 95% (38/40) and 100% (11/11), respectively. The protection rate was 48.2% with HI titer lower than 1:20, while the rate was 74.3% with HI titer of 1:20 and 93.8% with HI titer of 1:40 or greater. In laying ducks, the protection rate of flocks with HI titer of 1:5 or lower, 1:20, 1:40 and 1:80 was 66.7% (12/18), 83.3% (10/12), 95.2% (20/21) and 100% (15/15), respectively. The protected proportion of ducks with HI titer of 1:10, 1:160, 1:320 and 1:640 was 2/3, 7/7, 1/1 and 2/2, respectively. The protection rate was 66.7% with HI titer of 1:10 or below, while the rate was 83.3% with HI titer of 1:20 and 97.8% with HI titer of 1:40 or greater. There were significant positive correlations between the HI titer and the immune protection rate both in young ducks and laying ducks. The Spearman’s correlation coefficient was 0.905 (P<0.01) and 0.932 (P<0.01), respectively. 【Conclusion】There were positive correlations between the HI titer and the immune protection rate of duck Tembusu virus inactivated vaccine (strain HB). The HI detection could be used to evaluate the efficacy of duck Tembusu virus inactivated vaccine (strain HB) instead of challenge test. The HI titer of 1:20 could be defined as the criteria of protection for the duck Tembusu virus inactivated vaccine after immunization.     

猪源性新城疫病毒的分离与鉴定

从猪身上分离到NDV AS株,其HA和HI效价均为1∶5 124,ELD50/0.1 ml为10-6.0。     

番鸭体内H5亚型禽流感HI抗体与抗感染关系研究

对经过H5N1油苗免疫的50日龄番鸭,按HI抗体水平分组后,进行人工接种HPAIV,通过试验鸭的临床症状、病理变化和排毒情况综合判断HI抗体水平与保护力之间的关系。结果表明,HI抗体水平在5.0log2以下时,番鸭群可感染HPAIV,出现临床症状,表现不同程度的病理变化,并有排毒现象。抗体水平达到3.0log2~5.0log2的免疫番鸭群已具有一定的抵抗力,可以延缓发病时间,降低发病程度。随抗体水平的升高,发病与排毒的程度有所下降。当抗体水平达6.0log2及以上时,番鸭对人工接种HPAIV具有完全抵抗能力,不排毒。因此,番鸭对H5N1亚型HPAIV具完全抵抗力的HI抗体水平的临界保护滴度为6.0log2。     

禽流感灭活疫苗对商品肉鸭免疫效果的评价

为了了解和掌握商品肉鸭高致病性禽流感疫苗的免疫效果,对不同日龄的商品肉鸭进行了免疫试验.结果表明,3～10日龄时(H组)免疫,可以有效地刺激肉鸭产生禽流感HI抗体,并一直持续到40日龄;但由于母源抗体的干扰,在20日龄前后5～7 d,是一段易感染的免疫空白期.建议每年禽流感的免疫预防须提前到10月中上旬进行,以使侯鸟南飞迁徙时,所有家养水禽有充足的时间产生免疫力.     

H5N1亚型禽流感病毒的鸭致病性研究

 【目的】为了验证H5N1亚型禽流感病毒对鸭是否具有致病作用。【方法】对2003年某地方养鹅场发病鹅群分离的一株H5N1亚型流感病毒A/Goose/HLJ/QFY/2003的生物学特性和致病性进行研究。【结果】动物实验表明该病毒对不仅对鸡具有高致病性（IVPI=3），而且对鸭也具有高致病性。雏鸭人工感染该病毒后临床表现典型的神经症状，剖检可见脑膜点状出血，肝脾肿大并见有坏死灶，肺脏严重充血、出血，消化道粘膜弥散性出血。病理组织学检查发现全身各脏器以出血、充血、细胞变性坏死和炎性细胞浸润为主要特征，并表现为不同程度的损伤。感染鸭死亡集中在感染后的4～6 d，致死率75%。雏鸭在病毒感染后2～4d的气管、泄殖腔及全身各主要器官均可分离到病毒。虽然攻毒后14 d耐过鸭血清中可检测到1∶16的HI抗体；但是此时胰腺中仍然可分离到低水平的病毒。【结论】本研究继从野鸟分离到对鸭具有高致病性禽流感病毒之后，首次证实家禽中也存在对鸭具有高致病性的禽流感病毒流行。     

鸭坦布苏病毒病灭活疫苗（HB株）母源抗体的消长规律

【目的】评价鸭坦布苏病毒病灭活疫苗母源抗体的效力,制定疫苗的最小免疫日龄。【方法】随机采集鸭坦布苏病毒病灭活疫苗（HB株）二免后135日樱桃谷种鸭的种蛋孵化,随机取5、7、10和15日龄免疫种鸭后裔雏鸭10只和相对应日龄非免疫种鸭后裔雏鸭5只,采血,分离血清,测定母源抗体,并以0.1mL/羽（含100DID₅₀）的剂量经腿部肌肉攻毒。观察雏鸭攻毒后的临床表现（采食量、粪便、精神和死亡情况）,观察至攻毒后10d。攻毒后2d经颈静脉采血,分离血清进行病毒分离。每份血清接种5枚6日龄SPF鸡胚,0.1mL/枚,37℃孵化,24h以内死亡鸡胚视为非特异死亡,孵化至168h。只要有1枚及以上鸡胚死亡则判该鸭感染。计算母源抗体雏鸭组的攻毒保护率和无母源抗体组的发病率。攻毒后5d,分别称量雏鸭的体重,计算平均日增重。对成对样本进行T检验,分析母源抗体对雏鸭增重的影响。通过试验鸭中和抗体、增重变化和病毒分离的方法评价母源抗体的效力。【结果】（1）1日龄雏鸭的母源抗体阳性率最高,1、5、7、10和15日龄雏鸭的母源抗体阳性率分别为56.1%（37/66）、40%（4/10）、50%（5/10）、30%（3/10）和0%（0/10）,5-7日龄抗体阳性率处于平台期,15日龄时母源抗体降低至全阴性;（2）攻毒后对照鸭表现精神沉郁（20/20）、仰翻和侧翻等神经症状（6/20）及死亡（2/20）,有母源抗体的雏鸭临床症状明显轻于对照组。（3）5、7、10和15日龄免疫种蛋孵化雏鸭攻毒后5d平均增重115.5、142.8、177.8和162.2g。5、7、10和15日龄非免疫种蛋孵化雏鸭攻毒后5d平均增重54.5、91.0、165.0和118.8g。（4）5、7、10和15日龄免疫种蛋孵化雏鸭的攻毒保护率分别为50%（5/10）、60%（6/10）、20%（2/10）和0%（0/10）; 5、7、10和15日龄非免疫种蛋孵化雏鸭的发病率均为100%。（5）5和7日龄雏鸭平均增重和攻毒保护率最高,分别为50%（5/10）和60%（6/10）,10和15日龄雏鸭的母源抗体尽管低（20%和0%）或阴性,仍然有明显的保护作用。【结论】（1）鸭坦布苏病毒病灭活疫苗母源抗体能够保护10日龄内雏鸭;（2）疫苗首次免疫的时间以7-10日龄为最佳。