木霉REMI突变株主要生防酶活性改变及其基因部分序列差异的研究

本文探讨了来源于同一出发菌株木霉T21的不同木霉REMI突变株的主要生防酶活性的改变及其基因部分序列的差异,利用生化技术测定了木霉几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶酶活性,并对这两种酶的基因部分序列进行了分析.结果表明,木霉REMI突变株几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性变化较大;相对于出发菌株T21,菌株Ttrm68和Ttrm31酶活性极显著高于出发菌株T21,而Ttrm94则极显著低于T21.采用简并引物克隆几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶基因的部分序列,发现菌株Ttrm68、Ttrm31在几丁质酶基因中插入了GGTATCGATATCGAC片段,菌株Ttrm94在β-1,3-葡聚糖酶基因中插入了GTC片段.     

盾壳霉对核盘菌的拮抗作用研究

系统研究了菌核重寄生菌盾壳霉对核盘菌的拮抗作用,结果表明:盾壳霉可在核盘菌菌落上寄生,使核盘菌菌丝消解、原生质泄露,并抑制菌核的形成;而且盾壳霉提前6d接种,其分泌的抗生物质还可抑制核盘菌菌丝生长,并产生明显抑菌带。盾壳霉孢子液喷雾处理也证明:盾壳霉分生孢子即可在核盘菌子囊盘(柄)上萌发、寄生,使子囊盘(柄)萎缩枯死,而且还可以在核盘菌菌落上萌发、寄生,消解破坏菌丝体、抑制的菌核形成。     

盾壳霉对油菜长效专用配方肥料的敏感性评价

油菜菌核病是油菜生产中的重要病害,盾壳霉是核盘菌的重寄生真菌,在菌核病防治方面具有重要的生防潜力。为了明确盾壳霉与油菜长效专用配方肥料混合施用的可行性,本文研究了盾壳霉对油菜长效专用配方肥的敏感性。结果发现,低浓度的油菜长效专用配方肥（1.5和7.5 mg/mL）对盾壳霉菌丝生长、菌落及菌丝尖端形态和分生孢子萌发等无明显影响,高浓度的油菜长效专用配方肥对盾壳霉生长和孢子萌发有一定影响,在饱和浓度（560 mg/mL）条件下的油菜长效专用配方肥,24 h盾壳霉孢子的萌发率为0.83%,然而在96 h时萌发率可达到95%;油菜长效专用配方肥对盾壳霉产孢和寄生致腐菌核的能力无明显影响,寄生菌核30 d后,致腐指数均在50以上。研究结果表明,在田间生产中,盾壳霉可以与油菜长效专用配方肥料混合施用,达到轻简化栽培的目的。     

土壤中盾壳霉双标记平板计数法的建立及应用

盾壳霉是一种重要的生防菌,其在土壤中的存活数量直接关系到防治病害的效果。然而目前没有对土壤中盾壳霉直接计数的方法,构建一种简单易行的土壤中盾壳霉计数方法对研究盾壳霉在土壤中的存活动态具有重要意义。本研究利用农杆菌转化法构建了潮霉素基因和绿色荧光蛋白基因标记的双标记盾壳霉菌株,并测定转化子的生长速度、产孢量和菌核致腐能力,初步分析了该方法计数土壤盾壳霉的有效性和可行性。结果显示,潮霉素基因和绿色荧光蛋白基因可以稳定地遗传和表达,并且部分转化子生长速度、产孢量和菌核致腐能力与出发盾壳霉菌株JNCM没有显著差异。加入土壤中的盾壳霉转化子可以在含潮霉素(50μg/mL)、氯霉素(100μg/mL)和链霉素(100μg/mL)的PDA平板培养,杂菌得到充分抑制,呈现绿色荧光的盾壳霉转化子被有效检出,检出限达到2×103个/g土。本研究所构建的计数方法能有效检出施入土壤中的盾壳霉并进行活菌计数,可以用于盾壳霉JN-CM产品在土壤中的定殖、生长、繁殖和存活情况的研究。应用双标记平板计数法研究了不同温度、湿度、接种量和添加菌核等条件下盾壳霉JN-CM在土壤中的存活规律。结果显示,在含有核盘菌菌核的土壤中,盾壳霉JN-CM可以通过重寄生维持一段时间(12周)的数量增长,在长达半年左右(24周)的时间里其存活率仍然可以维持在65%左右。在不含菌核的土壤中,在一般土壤温度(10~20℃)范围内,无论土壤水分含量高低,其半年存活率也可以维持在50%左右。因此,可以预测,连续施用盾壳霉JN-CM生防制剂,可以使其数量在土壤中长期维持在一定的水平范围,达到长效防治效果。     

除草剂精禾草克和乙草胺对油菜菌核病生防菌盾壳霉生长和寄生的影响

本文研究了油菜田间常用除草剂精禾草克和乙草胺对油菜菌核病生防菌盾壳霉Conio-thyrium minitans的影响。结果表明它们对盾壳霉菌丝生长和分生孢子萌发均有显著的抑制作用,其中精禾草克对盾壳霉菌丝生长和孢子萌发的抑制中浓度分别为2.95mg/L和7.80mg/L;乙草胺对菌丝生长和孢子萌发的抑制中浓度分别为137.45mg/L和120.90mg/L。精禾草克可以抑制盾壳霉寄生核盘菌Sclerotinia sclerotiorum菌核,当精禾草克的使用量达田间使用浓度时,盾壳霉不能寄生核盘菌菌核;而乙草胺对盾壳霉寄生菌核的影响较小,在田间使用浓度1250mg/L时,盾壳霉仍可寄生菌核;乙草胺和盾壳霉在田间使用浓度条件下混合使用,60d后菌核腐烂指数与单独使用盾壳霉没有显著差异,均大于75。上述结果表明在田间使用量条件下,乙草胺可以和盾壳霉生防制剂混用,而精禾草克不宜和盾壳霉混用。     

利用油菜秸秆培养重寄生菌盾壳霉分生孢子

研究了油菜秸秆作为基质培养植物病原菌核盘菌的重寄生菌盾壳霉分生孢子,并从盾壳霉分生孢子萌发及其抑制核盘菌菌核子囊盘萌发等方面评价了所获得的盾壳霉分生孢子的质量。结果表明:盾壳霉野生菌株Chy-1和Zs-1,以及Chy-1的突变菌株SV-5-2(抗杀菌剂vin-clozolin)可以利用油菜秸秆为基质进行培养,有利于3个菌株的菌丝生长、分生孢子器及分生孢子的产生,分生孢子产量可达2·4×109~3·4×109个孢子/g干秸秆。水分含量和发酵时间影响盾壳霉分生孢子产量。在接种量为5×105个孢子/g干秸秆的条件下,以干秸秆中含水量为3~6ml/g,在20℃下发酵12d较为适宜。水琼脂平板试验表明:在20℃下培养48h,盾壳霉分生孢子的萌发率达到90%以上。将油菜秸秆基质培养的盾壳霉分生孢子接种于土壤中,无论是夏季试验,还是秋季试验,对核盘菌菌核萌发及存活具有显著的抑制作用。2003年夏季,4·0×106个孢子/m处理其核盘菌菌核萌发数比对照减少26·3%;秋季该处理比对照减少57·1%~88·0%。     

重寄生真菌盾壳霉胞外蛋白酶产生条件及酶活影响因子

重寄生真菌盾壳霉Coniothyrium minitans是核盘菌Sclerotinia sclerotiorum的重要生防菌。为了探讨盾壳霉胞外蛋白酶在寄生核盘菌过程中的作用,采用明胶平板法对盾壳霉寄生核盘菌菌核产生的蛋白酶活性进行了检测,并进一步采用福林酚法定量测定蛋白酶活性,研究盾壳霉产生胞外蛋白酶的培养条件及影响蛋白酶活性的因子。试验结果表明,在被盾壳霉寄生的核盘菌菌核中检测到蛋白酶活性,表明蛋白酶可能参与盾壳霉重寄生作用。发现核盘菌菌核浸出液培养基适合盾壳霉产生胞外蛋白酶,摇培(20℃、200r/min)5d时蛋白酶活性最高,达到0.22U/mL。盾壳霉胞外蛋白酶酶促反应的最适温度为60℃,最适pH7.0。当温度不高于40℃时,蛋白酶酶活较稳定。5mmol/L的金属离子Mg²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺、Cu²⁺、Mn²⁺、Li⁺和K⁺等对蛋白酶酶活没有显著影响(P>0.05),而Fe²⁺(5mmol/L)显著(P<0.05)提高了蛋白酶活性。盾壳霉蛋白酶对苯甲基磺酰氟(PMSF)敏感,说明盾壳霉产生的胞外蛋白酶可能主要是丝氨酸蛋白酶。这些结果为盾壳霉胞外蛋白酶的分离纯化和功能研究奠定了基础。     

紫外光诱导哈茨木霉产生腐霉利抗性菌株的研究

通过紫外光照射结合使用含药培养基培养得到了 3个哈茨木霉腐霉利抗性突变菌株。抗性菌株与亲本菌株相比较 ,其抗药性提高 1 0 0倍以上 ,与异菌脲、菌核净和甲基立枯磷存在交互抗性。抗性菌株在无药培养基上连续转移培养 8次 ,抗性程度未见下降。在适合度上 ,抗性菌株的菌丝生长速率有所下降 ,而在产孢能力、活体抑菌能力上有的抗性菌株要高于亲本菌株。 3个抗性菌株均保持了对灰霉病菌的拮抗能力     

盾壳霉抗杀菌剂vinclozolin的诱变及突变体的生防潜力

采用适应性培养的方法获得了4个抗杀菌剂vinclozolin的盾壳霉突变体。vinclozolin对野生型盾壳霉菌株Chy-1菌丝生长和分生孢子萌发的EC50分别为1．1和140．0μg／ml；而对突变菌株SV．5．1、SV．5．2、SV．10．1和V-250-1菌丝生长的EC50分别为2219．1、2683．9、2222．8和2504．2μg／m1，对分生孢子萌发的EC50分别是710．4、866．0、931．3和609．3μg／ml。在没有杀菌剂存在的情况下，这些突变菌株的转代培养后代和感染核盘菌菌核后产生的分生孢子后代仍具有抗性。用突变菌株与野生菌株接种核盘菌菌核时，突变菌株的大多数接种处理的菌核被寄生率和菌核腐烂指数与野生菌株接种处理没有明显差异。除菌株V-250-1外，其它3个突变菌株在至少1个接种处理的菌核上产生分生孢子的能力显著高于野生菌株或无明显差异。突变菌株与野生菌株在油菜花瓣上对核盘菌子囊孢子侵染油菜叶片具有明显抑制作用。     

番茄叶霉病菌对多菌灵抗药性的诱导及抗性菌株特性研究

采用紫外线诱导及药剂驯化两种方法对番茄叶霉病菌的目标菌株进行多菌灵抗性诱导,分别经7、9代诱导后获得抗性突变体。突变体菌株的EC₅₀均大于500μg／mL,达高抗水平。突变体菌株与自然抗性菌株无药继代培养10代后,抗性程度没有明显变化。与亲本菌株比较,突变体菌株菌落生长速率、产孢量及产毒量有所下降。室内交互抗性测定表明:多菌灵与苯菌灵、菌核净及克霉灵之间具有正交互抗性,与瑞毒霉、扑海因及速克灵无交互抗性。乙霉威对多菌灵的高抗菌株表现负交互抗性或无交互抗性,但对敏感菌株不表现负交互抗性。     

木霉耐盐突变菌株的紫外诱变选育

为了获得高效耐盐木霉突变菌株,以盐碱土中分离的一株深绿木霉T-YM作为原始菌株进行紫外诱变处理,并筛选了突变菌株的最佳诱变条件,利用NaCl溶液模拟盐胁迫条件测定了突变菌株耐盐指标生长速率、产孢量和菌丝生长量。结果表明,与对照(野生型菌株)相比,当诱变时间为3 min时能够显著提高深绿木霉T-YM突变菌株菌落生长速度和产孢量,分别增加17.69%和28.82%;诱变时间为0.5 min和5 min时能够显著提高突变菌株菌丝生长量,分别增加42.22%和46.67%。利用10 mg·mL^-1 NaCl溶液模拟盐胁迫条件时,与对照相比突变菌株菌落生长速度、产孢量和菌丝干重整体高于野生型菌株,尤其当诱变时间为3 min时,不同浓度盐胁迫下其产孢量平均增加51.18%,诱变时间为0.5 min时其菌丝干重平均增加23.65%;NaCl胁迫(10 mg·mL^-1)下,诱变处理0.5 min获得的正突变菌株经传代接种培养后其耐盐性较为稳定。因此,紫外诱变可作为一种选育高效耐盐木霉突变菌株的有效方法。     

不同培养基继代培养蜡蚧轮枝菌对产孢量和烟粉虱毒力的影响

为了探究不同培养基继代培养的蜡蚧轮枝菌对烟粉虱的作用效果,通过继代培养方法测定JMC-01、JMC-02菌株的产孢量、对烟粉虱的毒力及其几丁质酶活性。结果表明,JMC-01、JMC-02菌株在添加蝉蜕和烟粉虱的PDA培养基中连续培养5代的产孢量、对烟粉虱的毒力、几丁质酶活性均高于无添加的PDA培养基,且JMC-01菌株的各项参数均高于JMC-02菌株。JMC-01菌株在添加蝉蜕的PDA培养基中T_1和T_3代的产孢量最大,均为1.279×10~7个/mL,T_3代对烟粉虱的毒力最大,为88.33%,T_5代的几丁质酶活最高,为0.268 3 U/mL;在添加烟粉虱的PDA培养基中,JMC-01菌株的最大产孢量、对烟粉虱的最高毒力和最高几丁质酶活分别出现在S_2、S_4和S_5代,分别为1.270×10~7个/mL、88.33%和0.325 4 U/mL。回归分析结果显示,JMC-01、JMC-02菌株几丁质酶活性与烟粉虱校正死亡率呈显著的正相关,且拟合优度较好。本试验表明JMC-01、JMC-02菌株均对烟粉虱具有较强的毒力,添加蝉蜕和烟粉虱的培养基可以维持菌株生长特性、增加产孢量、延缓菌株退化、增强菌株的几丁质酶活性,为烟粉虱的生物防治提供了新的菌种资源。     

一株金龟子绿僵菌对茶尺蠖的致病力和胞外酶活性

为明确从茶园腐殖层昆虫尸体上分离的虫生真菌的分类地位及其对茶尺蠖的生防潜力,采用形态学特征观察和rDNA?ITS序列分析方法对该菌株进行鉴定,并测定该菌株对茶尺蠖4龄幼虫的毒力及其胞外酶活性.结果表明,从茶园腐殖层虫尸上分离获得一株金龟子绿僵菌CHMA?005;该菌株侵染茶尺蠖4龄幼虫10 d后,致死率、LC50和LT...     

蝉拟青霉不同来源菌株的生长特性及其对蚜虫的致病性

为了筛选到生防效果好的高效蝉拟青霉菌株,对其12个不同来源菌株的生长速率、产孢量、孢子萌发率、抗紫外线能力、耐热性以及对蚜虫的致病力等进行比较。结果表明,SL和3L菌株菌落生长最快,SL5和FY菌株产孢量最高,FY和3L菌株孢子萌发率最高,FY和FJS菌株抗紫外线能力最强,3L和3716菌株耐热性最强,LB、3L菌株和3716菌株对蚜虫的致病性高,孢子和代谢物对蚜虫的致死率都在80.00%以上。经综合比较,LB菌株在致病力、产孢量、抗紫外线、抗热性等方面表现优良。     

木霉菌REMI转化体对番茄灰霉病的防治及其机理的研究

研究不同木霉菌转化体对番茄灰霉病防治效果及机理,为木霉菌生物防治的合理利用奠定基础。利用限制性内切酶介导基因整合技术(restriction enzyme-mediated integration,REMI),通过插入线性化质粒DNA获得了生物防治番茄灰霉病(Botrytis cinerea)效果优于出发菌T21菌株(出发菌)的3个木霉菌转化体Ttrm31、Ttrm34和Ttrm55,对侵染花器和叶片的灰霉病防效分别比原生物防治木霉菌株提高了16.9%和8%。木霉菌转化体的产孢能力、分生孢子的萌发率、对碳氮源的利用能力及对高温的抵抗能力都有所提高;木霉菌转化体本身产生的几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的活性均比出发菌高,因此通过REMI技术可以获得新的有益木霉菌转化体,在一定程度上提高了生物菌株防治番茄灰霉病的水平。说明REMI技术可以用于改良生防木霉菌株的功能,提高生物防治效果。     

球孢白僵菌BB-T02生物学特性及对两种检疫性粉蚧的侵染活性

南洋臀纹粉蚧和石蒜绵粉蚧是近年我国新记录的两种检疫性有害生物,目前分别在福建省的番荔枝果园和多肉植物种植基地发生为害严重。为明确球孢白僵菌BB-T02对这2种检疫性粉蚧的生防潜力,本研究在该菌株生物学特性的基础上,测定该菌株对两种检疫性粉蚧的致病力和胞外酶活性。结果表明,球孢白僵菌BB-T02培养最适的温度为28℃、光周期8L:16D、碳源为麦芽糖、氮源为蛋白胨,在此条件下培养10 d菌落直径和产孢量分别可达5.60 cm和4.22×10⁸孢子/cm²。菌株BB-T02侵染南洋臀纹粉蚧和石蒜绵粉蚧10 d后的LC₅₀分别为5.00×10⁵孢子/mL和2.17×10⁵孢子/mL,1.00×10⁸孢子/mL处理的累计致死率分别为85.39%和88.76%、LT₅₀分别为5.78 d和5.19 d。菌株BB-T02蛋白酶活性的变化幅度较大,在第5 d达峰值22.68 U/mL;几丁质酶和脂肪酶活性的变化幅度相对平稳,均在第6 d分别达到峰值13.19 U/mL和9.77 U/mL。综上,球孢白僵菌BB-T02生长速度快、产孢量高,对南洋臀纹粉蚧和石蒜绵粉蚧的侵染活性强,可用于这两种检疫性粉蚧的生物防治。     

苦参内生枯草芽孢杆菌B_（36）抗菌物质对番茄叶霉病菌的作用机制

采用大孔树脂吸附法提取苦参内生细菌B36的抗菌物质,研究其对番茄叶霉病菌的作用机制。结果表明,菌株B36抗菌物质粗提物对番茄叶霉病菌抑菌圈直径达20.5mm;引起菌丝畸形,产生囊泡;抑制分生孢子萌发。当抗菌物质浓度为10.6×10^2μg/ml时,对孢子萌发的抑制率达86.56%;果胶酶和羧甲基纤维素酶的酶活分别为0.5911和0.01757U/ml,显著低于对照。说明B36抗菌物质抑制两种菌丝胞外细胞壁水解酶的合成,通过破坏细胞膜结构产生抑菌作用,而抗菌物质对病菌菌丝细胞壁组成物质几丁质和菌丝蛋白质的浓度没有影响。     

嘧肽霉素高产菌株的选育

以不吸水链霉菌辽宁变种为出发菌株,经紫外线、亚硝酸诱变和紫外线与嘧肽霉素复合诱变,选育出了嘧肽霉素的高产菌株,抑菌圈直径由原来的20.5mm提高到36.4mm。传代培养5代表明,该高产菌株遗传特性稳定。     

不同菌株绿僵菌和白僵菌对刚竹毒蛾幼虫致病力及林间防治试验

刚竹毒蛾(Pantana phyllostachysae Chao)是福建省毛竹林的一种主要害虫,本研究应用5种金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)菌株和1种白僵菌(Beauveria bassiana)菌株,对3龄初幼虫进行感染力测定,旨在筛选出感染该虫的高致病力菌株。结果表明:应用1.45×10 7孢子/mL孢悬液感染12 d后,3龄初幼虫的校正死亡率均达到63.16%以上;其中MaFzzL-01和Ma1291-2两个绿僵菌株对该幼虫的致病力分别为90.93%和84.21%,其LT50值分别为5.97 d和6.67 d,LC50值分别为1.727×10 4孢子/mL和2.029×10 4孢子/mL。结果说明:绿僵菌MaFzzL-01和Ma1291-2两个菌株对该幼虫的致病力强,且致死速度快。应用1.45×10 8孢子/mL孢悬液进行林间防治可以取得良好效果。     

丹皮酚对植物病原真菌的体外抑制作用

为揭示丹皮酚在牡丹体内的抗菌机制,采用生长速率法测定了丹皮酚对供试病菌菌丝生长的抑制作用;用涂布平板法测定了丹皮酚对供试病菌孢子萌发及形成的影响。结果表明,丹皮酚含量与病菌菌落直径线性增长及菌丝生物学产量的相对抑制率呈正相关,在丹皮酚含量0.08、0.4mg/mL培养液中培养禾谷丝核菌和茄病镰刀菌5天,对菌丝干重的抑制率分别为79.81%和55.08%。丹皮酚对供试病菌的孢子萌发无作用,但孢子萌发后,其芽管基部膨大、顶端膨大及中间局部膨大。丹皮酚推迟病菌分生孢子梗的形成时间,降低分生孢子的形成数量,在0.20、0.24mg/mLPSA培养基上培养玉蜀黍赤霉和茄病镰刀菌10天,对分生孢子形成的抑制率分别为100%和33.33%。