番茄黑环病毒检测方法的建立

通过汁液摩擦接种的方法接种几种鉴别寄主,筛选出检测番茄黑环病毒（TBRV）的一套鉴别寄主.同时建立了免疫学电镜检测方法.根据TBRV外壳蛋白基因的保守序列设计2对引物,应用RT-PCR均能从TBRV的6个分离物中扩增到与预期大小相同的DNA片段.利用抽提的质粒研究了RT-PCR方法检测TBRV的灵敏度.     

侵染番茄的番茄褪绿病毒山东泰安分离物的分子鉴定和序列分析

2012年秋季, 在山东泰安番茄主要种植区中采集到叶片褪绿, 叶脉颜色变深的疑似番茄褪绿病毒病和番茄侵染性褪绿病毒病的番茄样品。利用番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus, ToCV)的特异引物 ToCV1/ToCV2和番茄侵染性褪绿病毒(Tomato infectious chlorosis virus, TICV)的特异引物TICV1/TICV2分别对样品进行扩增, 最后仅得到利用引物 ToCV1/ToCV2 扩增的101 bp 的核苷酸序列, 对该核苷酸序列克隆并测序。序列比对表明, 山东泰安地区分离物与已登录的番茄褪绿病毒(ToCV)分离物相似性都在99%以上。随后, 对山东泰安种植区ToCV番茄分离物进行外壳蛋白(CP)及热激蛋白(HSP70)序列的扩增、克隆和测序(GenBank登录号KC812620/KC812625), 经NCBI BLAST比对发现, 目的序列与番茄褪绿病毒日本番茄分离物ToCV Japan/Tochigi (GenBank登录号AB513442/AB513443)相似性最高为99%, 同属于毛型病毒属的番茄褪绿病毒, 这是首次明确山东地区番茄受到番茄褪绿病毒的侵染。     

番茄褪绿病毒RT-PCR检测技术的优化及河南分离物的鉴定

为获得高效、灵敏和稳定的番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,ToCV)RT-PCR检测体系,选取文献报道的和重新设计的共9套ToCV的RT-PCR引物,经过一系列测试和比较,筛选出了灵敏度、特异性均较高的引物组合,并对反应条件、参数进行了优化,确定了最优反应条件。应用优化的ToCV RT-PCR检测体系对从河南设施蔬菜生产区采集的疑似感病番茄样品进行检测,扩增产物测序后经BLAST比对发现,河南分离物的CP和HSP70基因序列与GenBank上注册的ToCV典型分离物序列的相似性均达94%以上,通过对ToCV病毒粒子的电镜观察而进一步确定ToCV已在河南侵染设施番茄。     

吉林番茄黄化曲叶病毒分离物的检测及其DNA-A全基因组序列分析

从吉林省松原市田间表现黄化曲叶症状的番茄上分离到病毒分离物JLSY,基因组全序列测定结果表明,基因组全长2781 bp,共编码6个ORF。序列比对表明,JLSY基因组与番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）安徽分离物（FN650807）相似性最高,为99.5%,而与其他双生病毒的序列相似性低于89%。经系统进化分析,该病毒分离物属于TYLCV以色列株系（TYLCV-IL）。这是首次在我国吉林省检测到番茄黄化曲叶病毒。     

RT-PCR检测番茄不孕病毒

根据番茄不孕病毒 (TAV)RNA3上外壳蛋白基因序列设计、合成引物 ,以感病组织和健康组织总RNA为模板 ,进行cDNA合成和PCR扩增 ,结果从感病组织中扩增出与预期的6 42bp大小一致的目标片段 ,而健康组织无此扩增产物 ;将PCR产物插入 pGEM T载体克隆并测序 ,序列分析表明与TAV不同株系的序列同源性达到 96 2 %以上 ;将感病组织总RNA以 1 0倍梯度稀释成不同浓度 ,测出RT PCR检测TAV的灵敏度为 1 0 -5 ;PCR产物克隆作为RT -PCR反应的阳性对照 ,解决了毒源保存和传播的问题 ,从而建立了TAV快速、灵敏、准确的RT -PCR鉴定和检测技术     

新疆番茄病毒病检测及南方番茄病毒全基因组序列测定与传播特性分析

为了解新疆番茄上病毒病的发生情况,利用一步法RT-PCR技术检测了南北疆番茄上南方番茄病毒(Southern tomato virus,STV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus,ToMV)以及马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)的感染情况,并利用分段克隆的方法进行全基因组测序,通过RT-PCR方法检测健康植株与携带病毒植株杂交育种的F1代植株带毒率以分析STV的种子传播特性。结果显示,新疆番茄上CMV、STV、ToMV和PVY在北疆的检出率分别为52%、37%、27%和14%;在南疆的检出率分别为79%、60%、69%和0;且以STV、CMV及ToMV的复合侵染为主。从我国加工番茄上首次获得了长3 437 nt的STV SHZ-1核苷酸序列,序列比对分析发现其与已报道STV只有1~9个核苷酸的变异,且序列变异与地域无相关性。分析杂交F1代加工番茄植株上STV的传播特性,发现其除可由种子传播外,也可通过花粉传播。表明STV是侵染新疆番茄的主要病毒之一,且该病毒可通过种子或杂交育种途径进行传播。     

两重RT-PCR同步检测菊花B病毒和番茄不孕病毒

根据已报道的菊花B病毒（CVB）和番茄不孕病毒（TAV）外壳蛋白基因序列合成两条寡核苷酸引物,用RT-PCR的方法对这两种病毒的外壳蛋白基因进行了扩增,得到与预期大小相符的特异扩增条带。将其克隆到pGEM T中,经序列分析表明所克隆的是CVB和TAV的CP基因,与已知的序列相比,CVB的同源性分别为82%、85％,而TAV的同源性为98%。利用两重RT-PCR成功同步检测这两种病毒,从而建立了一种能同时检测两种病毒的快速、简便、灵敏的分子检测方法。     

水稻黑条矮缩病毒江苏玉米分离物全基因组序列及进化分析

 利用RT-PCR从江苏玉米上克隆水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)的全基因组,其基因组10个片段核苷酸数目和蛋白编码情况与已报道的RBSDV分离物基本一致。 基因组的序列一致性分析和系统进化树表明,RBSDV基因组片段间存在频繁的RNA重排现象;江苏玉米分离物(JS)与湖北玉米分离物(HuB)和河北小麦分离物(HeB)的整体亲缘关系较近,而与安徽分离物(AH-MX8)的整体亲缘关系最远。综合本研究及前人对S8 和S10的研究,RBSDV基因组不同片段的进化中RNA重组的作用不同: S1、S2和S4中没有RNA重组;S3、S5、S6、S8和S10中存在低频率重组;S7 和S9存在较高频率重组,其中S7的高频率重组尤为显著。     

江苏菜豆上分离的番茄黄化曲叶病毒基因组序列分析

 2012年,江苏南京菜豆上出现了一种新的病毒病害,病株表现明显的叶片皱缩、植株矮化等症状。根据其症状及介体发生状况,对其伴随的病毒种类进行了研究,结果从中检测到一种粉虱传双生病毒,对其基因组DNA-A组分克隆测序后发现其全长2 781 bp,编码6个ORF,BLAST及聚类分析结果显示该病毒与番茄黄化曲叶病毒同源性最高(99%),是番茄黄化曲叶病毒的一个分离物。这是江苏省番茄黄化曲叶病毒侵染菜豆的首次报道,暗示番茄黄化曲叶病毒可能是我国菜豆种植的重要潜在威胁。     

非洲菊三种病毒的快速检测及其组培脱毒方法

利用感染了番茄黑环病毒、烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒的非洲菊叶片,建立同步检测非洲菊3种病毒的多重RT-PCR和实时荧光RT-PCR,多重RT-PCR可一次性扩增出3种病毒的DNA条带,最低可检测到相当于1μg的带毒叶片;实时荧光RT-PCR可分别检测相当于1 ng、1 ng和100 Pg的带毒叶片.同时采用茎尖、叶片和花托组织培养脱毒并结合培养基添加病毒A的脱毒方法,对接种3种病毒的非洲菊进行外植体脱毒试验,获得非洲菊组培苗脱毒方法.用建立的多重RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测脱毒效果,茎尖脱毒率分别为75.0%和66.7%,花托脱毒率分别为52.0%和54.5%.     

应用IC-RT-PCR方法检测番茄环斑病毒

以番茄环斑病毒阳性样品为研究材料,根据GeneBank(核酸序列数据库)中的序列设计特异性引物进行IC-RTP-CR(免疫反转录聚合酶链式反应,下同)扩增,获得产物克隆到pMD18-T载体中,经测序后与目标序列(ToRSVL19655)比较,核苷酸同源性为87.3%。通过实验建立了检测该病毒的IC-RT-PCR方法。该方法对其他样品核酸提取困难而抗体较容易制备的病毒检测同样具有借鉴意义。     

利用实时荧光RT-PCR方法检测番茄环斑病毒和烟草环斑病毒

根据番茄环斑病毒和烟草环斑病毒各分离物CP基因的保守序列分别设计并合成1对引物和1条TaqMan荧光探针,分别建立了ToRSV和TRSV的实时荧光RT-PCR检测方法。该方法具有更加灵敏、特异、快速和简便的特点,在口岸病害检疫中具有广泛的应用前景。     

齿兰环斑病毒与建兰花叶病毒分子检测研究

齿兰环斑病毒（Odontoglossum ringspot virus,ORSV）与建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus, CyMV）是严重危害兰科植物的两种主要病毒。本研究根据病毒外壳蛋白基因设计特异性引物,应用ELISA、普通RT-PCR、巢式RT-PCR和免疫捕获RT-PCR4种方法进行了检测研究与比较。结果表明：普通RT-PCR与ELISA方法检测灵敏度相当;巢式RT-PCR检测灵敏度要比普通RT-PCR与ELISA方法高出104倍以上;免疫捕获RT-PCR检测灵敏度介于普通RT-PCR和巢式RT-PCR之间。采用巢式RT-PCR方法对我国台湾进境的蝴蝶兰植株样本检测,1号样本出现与阳性对照一致的特异条带。双向测序分析,扩增产物序列与ORSV外壳蛋白基因具有100％的同源性,表明1号蝴蝶兰样本携带ORSV。     

实时荧光RT-PCR一步法检测番茄环斑病毒

 根据番茄环斑病毒(ToRSV)各株系RNA1聚合酶基因的保守序列,设计并合成1对引物和1条TaqMan荧光探针,建立了对ToRSV的实时荧光RT-PCR检测方法。该方法利用TaqMan荧光探针实时监测目的基因的扩增,实现RT-PCR扩增与探针检测同时进行,不需PCR后处理,消除了PCR产物的污染,不需电泳和EB染色,减少了检测步骤,节省了时间。这个方法具有"灵敏、准确、简便、快速"的特点适合于种传病害的快速诊断和口岸检验检疫运用。     

甘薯病毒病害(SPVD)的多重RT-PCR检测方法及其应用

根据甘薯褪绿矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)热激蛋白(Hsp70)基因和甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)外壳蛋白(CP)基因核苷酸序列的保守区域设计了4对引物,以单-RT-PCR反应体系为基础,分别对影响多重RT-PCR扩增的退火温度、Taq DNA聚合酶浓度、dNTPs浓度、Mg2+浓度、引物浓度等条件进行了优化,建立了能同时检测SPVD两种病原的多重RT-PCR方法.该方法能有效区分SPFMV的主要株系类型.灵敏性试验表明,建立的多重RT-PCR方法对SPFMV-CH2、SPFMV-CH和SPCSV的最低检测浓度分别为1.42×104、1.32×104拷贝/μL和2.47×104拷贝/μL.该方法可用于甘薯叶片和薯块中病毒的检测,为SPVD的监测预警提供了一个有用的工具.     

一种豇豆重花叶病毒RT-PCR检测方法的研究

对一种豇豆重花叶病毒(Cowpeas evere mosaic virus,CPSMV)反转录PCR分子检测方法进行了研究。利用从美国菌种保藏中心和德国微生物毒株保藏中心引进的CPSMV标准毒株,设计了一对特异性简并引物(CPSMVf/CPSMVr),建立了CPSMVRT-PCR检测方法。该方法具有良好的扩增反应及特异性,灵敏度可达1pg的总病叶组织RNA量。CPSMV双抗夹心酶联免疫法(DAS-ELISA)灵敏度为10μg叶组织。该方法适用于豇豆等豆类蔬菜种子及种苗中对豇豆重花叶病毒的快速检测。     

梨褪绿叶斑伴随病毒的RT-PCR和巢式RT-PCR检测技术建立

 梨褪绿叶斑伴随病毒(Pear chlorotic leaf spot-associated virus,PCLSaV)是新近发现的为害梨树的欧洲花楸环斑病毒属(Emaravirus)病毒,该病毒基因组由5条负义单链RNA组成。本研究比较分析了反转录引物pd(N)6、3C和5H及基于该病毒基因组RNA3和RNA5链序列设计的4对引物用于RT-PCR检测梨样品中PCLSaV的效果,结果显示,采用与该病毒基因组RNA链3′末端互补的引物3C用于cDNA合成及基于该病毒RNA5链序列的引物5-F/R用于PCR扩增时,检测PCLSaV的灵敏度相较采用引物pd(N)6和5H合成cDNA为模板时高10~100倍;不同部位和不同发病状况的梨树组织中PCLSaV检测结果差异明显。进一步建立了具有高灵敏度的巢式RT-PCR技术,采用外侧引物5-F/R和内巢引物5-IF/IR结合可用于梨不同组织样品中PCLSaV的检测。本研究为系统分析PCLSaV在我国栽培梨树上的危害状况及无病毒梨种质培育奠定了技术基础。