家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)与其它微孢子虫及真菌的进化关系

综述了应用分子生物学和生物信息学对家蚕微孢子虫系统发育的研究进展,以及多菌灵等苯并咪唑类杀真菌剂对微孢子虫和真菌的抑制作用,认为研究家蚕微孢子虫和真菌的进化关系对家蚕微粒子病的控制技术研究具有重要参考价值。     

家蚕微孢子虫单克隆抗体的研制

以家蚕(Bombyx mori)微孢子虫(Nosema bombycis)免疫BALB/C小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合后制备杂交瘤细胞,分泌对N.bombycis孢子表面抗原特异性的单克隆抗体。用酶联吸附免疫分析(ELISA)以筛选杂交瘤细胞,经3次有限稀释法克隆后,用包括N.bombycis等6种微孢子虫及正常蚕体组织匀浆作抗原筛选出1株分泌仅对N.bombycis孢子有特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株(LC_2)。小鼠腹水滴度为1:640O,用ELISA最少检出100O个孢子的样本。     

家蚕微孢子虫细菌人工染色体文库的构建

细菌人工染色体(BAC)文库是进行生物基因组学研究的一个重要手段。以家蚕微孢子虫(Nosema bomby-cis)重庆分离株为材料,在前期构建的家蚕微孢子虫基因组框架图数据基础上,对构建家蚕微孢子虫BAC文库过程中的关键技术,如脉冲胶块(plug)的制备与处理、限制性酶的筛选、DNA的部分消化、酶切片段的选择、插入DNA片段与载体的摩尔比值等进行了研究,建立了构建家蚕微孢子虫BAC文库适宜的技术体系。构建的家蚕微孢子虫BAC文库由6 478个克隆构成,克隆片段平均大小约为50 kb,相当于家蚕微孢子虫基因组(15.33 Mb)的20倍,文库空载率较低,有利于深入开展家蚕微孢子虫基因组相关方面的研究。     

家蚕微孢子虫病研究进展

家蚕微孢子虫病是由微孢子虫Microsporidia(微粒子原虫类 )寄生蚕体引起的一种古老的、分布较广的传染性病害,因其经卵传染性而被世界各养蚕国家和地区列为蚕种生产的惟一检疫对象.多年来,广大学者对其病原、检测技术及防治方法等方面进行了大量的研究,取得了较大进展.现综述如下: 1 家蚕微孢子虫病病原的研究     

用RAPD技术检测不同来源微孢子虫基因组DNA多态性

家蚕微粒子病是由微粒子原虫（微孢子虫）类寄生于蚕体引起的病害。微粒子病对蚕丝业生产危害极大,一直被列为蚕种制造检疫对象。许多学者对病原的传播途径、侵染机制及分类地位作了大量研究。其中微孢子虫的分类又以血清学关系、发育增殖方式和孢子超微结构作为主要划分依据,这些表型依据仍然具有局限性。随机扩增多态性ＤＮＡ技术（ＲａｎｄｏｍｌｙＡｍｐｌｉｆｉｅｄＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ,ＲＡＰＤ）因能方便、快速提供ＤＮＡ多态性的丰富信息而被广泛用于动植物和微生物的遗传差异、亲缘关系和进化分类等领域,但应用于微…     

家蚕异形微孢子虫与交叉传染

由于检测手段的改进，七十年代初，在日本蚕种生产过程中，发现了一些与家蚕微粒子虫孢子（Ｎｏｓｅｍａ ｂｏｍｂｙｃｉｓ）形态不同的微孢子虫以来，国内外众多学者开展了异型微孢子虫的分离和鉴定工作，发现了许多异形微孢子虫。且多数研究者和蚕种生产者认为，家蚕中分离到的异形微孢子虫主要来源于野外昆虫的交叉传染，我国家蚕微粒子病发生率的上升与野外昆虫的交叉传染关系密切。本文就有关方面的研究作一综合，期望对家蚕微粒子病的防治有所助益。二 异型徽抱子虫 根据目前分舟到的微抱子虫的形态结构、血清学特点、增殖特点、对家…     

家蚕微孢子虫表面抗原蛋白对家蚕致病性的影响

家蚕微粒子病是由家蚕微孢子虫通过食下传染和胚种传染引起的,对蚕业生产影响很大,历来是蚕种的检疫对象,为此对家蚕微孢子虫的研究一直是一个重要课题。除Ｐａｓｔｅｕｒ(1870)提出的母蛾检验外,相继出现了双向免疫扩散法,凝集法,荧光抗体法,酶联免疫吸附法,酶标抗体法,免疫过氧化物酶染色法及单克隆抗体法等方法[1],这些方法各有特色。但基本上都是以识别检测微孢子虫的表面抗原蛋白为基础。河原勇[2]根据微孢子虫表面抗原蛋白的不同将家蚕Ｎｏｓｅｍａ属分为3种类型,即Ｂｏｍｂｙｃｉｓ型、Ｍ11型、Ｍ12型。本文以家蚕微孢子虫的表面抗…     

家蚕病原性微孢子虫的超微结构研究

通过光学显微镜和电子显微镜对收集到的８ 种不同来源的对家蚕有病原性的微孢子虫的外部形态和超微结构进行了观察、比较，其结果：（１） 未见外部形态有特征性差异。（２） 超微结构既存在相似性，如孢子壁分层、极丝结构、固定板等；也存在相异性，尤其是极膜结构、后极泡的内部构造、极丝圈数与倾斜角、核糖体的数量及排列方式等方面差别较大。     

用酶标抗体法检测蚕微粒子孢子

用酶标抗体间接法和酶标抗体ＰＡＰ法检测蚕微粒子孢子,二种方法检测结果一致,被检材料与阳性对照中的孢子被染成褐色,从而可以确定为蚕微粒子孢子。二种方法比较,间接法相对简单,ＰＡＰ法敏感性更高,均为重要的蚕微粒子孢子的鉴别诊断方法。     

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)向家蚕BmN细胞接种与增殖的观察

利用DIPA活体荧光染色的方法对家蚕微孢子虫 (Nosemabombycis)的体外发芽、侵染、增殖的过程进行了观察。结果表明 :侵染过程从发芽开始持续到感染后 2 4h ,感染初期的芽体具有二核性 ,随后合二为一 ,感染后 2 4h进入裂殖体增殖阶段形成多核裂殖体 ,感染后 5 4h出现孢子母细胞、短极丝孢子及孢内发芽现象 ,感染后 6 0h出现二次感染体及趋于成熟的孢子 ,感染后 96h开始形成大量的成熟孢子、空孢壳及二次感染体的再分裂 ,此时在感染家蚕BmN细胞中 ,难于明确划分家蚕微孢子虫的各发育阶段。     

一种快速高效制备家蚕微孢子虫基因组DNA和总蛋白的方法

家蚕微孢子虫孢子壁坚厚不易破碎,并对许多化学物质有很强的抵抗性,使用常规的核酸和蛋白抽提方法效果不够理想。研究建立玻璃珠破碎法快速制备家蚕微孢子虫基因组DNA和总蛋白的方法,采用琼脂糖凝胶电泳和SDS-PAGE分析所得DNA的完整性和所得总蛋白的差异性,并对提取蛋白进行双向电泳试验。结果表明:使用玻璃珠破碎法对微孢子虫孢子壁的破碎率可达到90%以上,基因组DNA得率约为7.65 fg/粒,总蛋白得率约为788.3 fg/粒,均显著高于常用的发芽法和液氮冻融研磨法的得率。双向电泳结果显示玻璃珠破碎法能有效提取家蚕微孢子虫总蛋白,经考马斯亮蓝染色可检测到约350个蛋白点,蛋白信息丰富,可进一步用于质谱分析。     

用铬变素2R法对家蚕微孢子虫孢子染色的研究

采用铬变素 2R法 (Chromotrope 2R)染色家蚕微孢子虫 (Nosemabombycis,N .b)孢子和绿僵 (Nomuraearile yi)孢子、曲霉 (Aspergillusflavus)孢子、花粉粒 (Pollengranule)等与N .b孢子形状相似物 ,结果表明 :Chromotrope 2R法特异性地将N .b孢子染成粉红色 ,绿僵孢子、曲霉孢子、花粉粒未被染成红色 ,初步认为Chromotrope 2R法可应用于母蛾镜检的N .b鉴定 ,能明显提高N .b的检出率与准确性 ;染色N .b孢子的最佳时间与温度为 4 0min ,30℃。鉴于本染色法的条件、技术操作简便 ,染色特异性强 ,因而具有良好的应用前景     

家蚕微孢子虫(镇江株)β-微管蛋白基因部分片段的克隆及系统发育分析

设计1对正、反向引物btubf/btubr,对家蚕微孢子虫(镇江株)基因组DNA的β-微管蛋白(beta-tubulin)基因进行扩增,得到部分片段。经PCR鉴定、酶切及测序分析,该片段与Nosema属其它微孢子虫的beta-tubulin同源。采用邻近归并法(Neighbour-Joining)构建系统发育树,结果表明微孢子虫和真菌关系密切。研究结果对于微孢子虫的系统发育研究和家蚕微粒子病的治疗具有积极意义。     

家蚕微孢子虫荧光定量PCR检测方法及诊断试剂盒

基于为蚕种生产与流通贸易提供快速、灵敏、准确检测家蚕微孢子虫的方法,以家蚕微孢子虫小亚单位核糖体RNA基因66 bp片段作为靶标,设计特异性引物和TaqMan探针,用构建的重组质粒制备标准品进行荧光定量PCR扩增,通过优化PCR反应体系,测定线性范围,评价方法的特异性、灵敏度和重复性,成功构建了家蚕微孢子虫的荧光定量PCR检测方法,并研制出诊断试剂盒。该方法的检测线性范围为1×108～1×102拷贝/mL的7个线性梯度,检测家蚕微孢子虫的敏感度达1×102拷贝/mL,特异性高,3次重复性检测应用试验的批内变异系数为3.6%～7.2%,批间变异系数为5.2%～7.8%。结果表明,建立的家蚕微孢子虫荧光定量PCR检测方法具有准确、灵敏、快速、特异性强的特点。     

家蚕微孢子虫单克隆抗体的制备及鉴定

用家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)总蛋白为抗原,采用长程免疫法免疫BALB/c小鼠,取4次免疫后的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞用PEG-1500进行细胞融合,第1次融合率为13.3%,第2次融合率为55.4%。建立间接酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA),用于检测杂交瘤细胞上清中的单克隆抗体。初检阳性率分别为4.68%和5.26%。经3次亚克隆筛选获得了2株能稳定分泌抗家蚕微孢子虫的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为2G10和2B10。间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence test,IFAT)和Western-bloting分析证实所获得的单克隆抗体是特异针对家蚕微孢子虫蛋白的,将在孢子孢壁蛋白的研究中发挥重要作用。     

家蚕微孢子虫(浙江株)α-微管蛋白基因部分片段的克隆及系统发育分析

基于微孢子虫分类学地位的争议,通过克隆家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)的α-Tubulin基因,利用BioEditor将核苷酸序列翻译成氨基酸序列,并从NCBI中收集不同物种的α-Tubulin基因,用CLUSTALX(1.81)、Mega2以及在线生物信息学软件CLUSTALW(1.83)分析序列并构建系统发育树。结果显示:家蚕微孢子虫及其它微孢子虫与真菌聚为一类,且微孢子虫以一个独立群与接合菌(zygomycetes)的噬虫霉属(Entomophaga)、耳霉属(Conidiobolus)关系最近,与子囊菌(ascomycetes)、担子菌(basidiomycetes)、壶菌(chytrids)及其它接合菌互为姐妹群。     

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)染色体DNA的分离纯化

为了获取可供家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)单染色体测序的基础材料,通过脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术分离家蚕微孢子虫CQ1株系的染色体DNA,随后切取含有目的染色体DNA条带的琼脂糖胶块,分别利用电洗脱法、柱式胶回收试剂盒法及玻璃奶胶回收试剂盒法进行染色体DNA的分离纯化实验。结果显示3种方法均能回收到目的染色体DNA,但分离纯化的效率和样品质量存在差异:电洗脱法对胶块中的DNA损失较大,回收的染色体DNA含量低,而柱式胶回收试剂盒回收的染色体DNA断裂严重,因此这2种方法获得的样品质量均达不到染色体建库测序的要求;通过优化后的玻璃奶胶回收试剂盒法获得的染色体DNA相对完整且污染较少,质量检验分析133μL样品中的DNA质量浓度为8.495 ng/μL(DNA总量1.13μg),达到后续构建染色体测序文库的要求。玻璃奶胶回收试剂盒法不仅适用于家蚕微孢子虫染色体DNA的分离纯化,也可供基因组较小的物种制备单染色体建库测序材料参考。