抗克伦特罗单链抗体噬菌体展示文库的构建初步筛选及鉴定

构建抗克伦特罗(CBL)单链抗体噬菌体展示文库(scFv phage displaylibraries),从中筛选CBL特异性噬菌体单链抗体(phage scFv).提取经CBL免疫的小鼠的脾脏总RNA,RT-PCR扩增全套抗体轻链可变区(VL)及重链可变区(VH)基因,重叠延伸法将VL、VH片段拼接为单链抗体(scFv)基因片段.将scFv克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E中,转化感受态大肠杆菌TG1,用辅助噬菌体M13KO7进行超感染,构建噬菌体单链抗体库.对抗体库进行亲合富集后,ELISA法筛选阳性克隆.扩增出抗CBL的VL、VH基因片段并拼接为全长的scFv,抗体库库容约为1.6×104,经4轮"吸附-洗脱-扩增"的富集,ELISA筛选到6个具有CBL结合活性的phage-scFv.成功构建抗CBL单链抗体噬菌体展示库,并初步筛选到具有CBL结合活性的噬菌体scFv,特异性好,为进一步大量表达CBL单链抗体奠定了基础.     

猪圆环病毒Ⅱ型衣壳蛋白片段与T4噬菌体SOC蛋白的融合表达

将PCV2衣壳蛋白片段与T4噬菌体SOC蛋白在大肠杆菌中融合表达。利用PCR技术扩增猪圆环病毒Cap基因。将Cap基因克隆至T4噬菌体表达质粒pSOC的SOC基因（T4噬菌体表面非结构蛋白基因）下游,构建成T4噬菌体SOC位点表达Cap的表达载体pSOC-Cap。将其转化至大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导后表达的目的蛋白SOC-Cap进行SDS-PAGE与Western-blot方法检测。表达的SOC-Cap蛋白相对分子质量约28kD,表达量占菌体总蛋白量的22.31%,并具有与PCV2特异性抗体反应的活性。PCV2衣壳蛋白片段与T4噬菌体SOC蛋白的融合表达后,表达量较高,并具有免疫活性,有望用于猪圆环病毒II型的诊断和预防。     

“基于基因工程单链抗体的植物抗病改良研究”通过福建省科技成果验收

<正>笔者日前从福建农林大学获悉,该校生命科学学院承担的省杰青项目"基于基因工程单链抗体的植物抗病改良研究"(项目编号:2009J06008)通过了福建省科技厅组织的专家验收。项目组通过基因工程抗体技术首次筛选到抗细菌HrpA蛋白高亲和力的单链抗体(scFv),并通过体外分子进化技术进一步提高了scFv的亲和力;率先将该scFv基因插入到植物表达载体并转化模式植物拟南芥,成功表达了抗HrpA蛋白     

噬菌体展示技术在食品科学领域的应用进展

分析概括了噬菌体展示技术在食品科学领域的几个热点应用方向。在食品安全检测领域,噬菌体展示技术可作为一种高效的抗体（或其它亲和配体）制备技术应用于免疫学快速检测技术的建立;也可以用于抗原表位筛选,制备有毒检测对象的替代品,进而建立食品安全无毒检测技术。在食品加工领域,噬菌体展示技术除可以通过制备抗体应用于食品加工干扰物质的检测与消除外,还可以用于酶的定向进化改造,进而为食品工业提供适宜的酶制剂。此外,噬菌体展示技术在食品功能因子制备、新型食品防腐剂生产等领域也同样可以发挥其优势。     

绵羊FecB基因的原核表达及其抗体制备

为了进一步研究FecB基因,利用PCR-RFLP技术筛选出FecB基因,PCR扩增FecB基因编码区序列1509bp,利用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ定向插入原核表达载体pET30a(+),构建原核表达载体pET30a(+)-FecB,诱导表达纯化重组蛋白,免疫小鼠制备多克隆抗体,WesternBlot检测重组蛋白的免疫活性,ELISA检测抗体效价。结果表明,成功的构建了绵羊FecB基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达目的蛋白,经过4次免疫后,获得多克隆抗体,ELISA方法检测小鼠抗体免疫效价达到1∶32000,纯化的蛋白具有免疫活性。为研究绵羊FecB基因蛋白的功能提供参考。     

酵母表面展示系统的改进及其在筛选烟草PMT基因启动子结合蛋白中的应用

筛选DNA结合蛋白常用的酵母单杂交系统在应用中有时会因内源干扰而影响筛选结果。与之相比,酵母表面展示系统(yeast surface display system)将外源蛋白展示在细胞表面,可通过接近体外实验的方法筛选DNA结合蛋白,能在一定程度上避免酵母内源干扰,但是,该系统在DNA结合蛋白筛选研究中的应用还很有限。本研究对酵母表面展示系统常用载体pYD1进行改造,使其与Clontech公司的Smart cDNA文库构建系统相匹配,提高了cDNA酵母表面展示文库的构建效率,并通过比较试验建立了一个以酵母表面展示系统筛选DNA结合蛋白的试验体系。在以酵母单杂交筛选烟草腐胺甲基转移酶基因PMT (putrescine N-methyltransferase)启动子结合蛋白的研究中,其茉莉素信号应答元件GAG片段是一段筛选效率极低的DNA片段。本研究利用改进的酵母表面展示系统对GAG片段的DNA结合蛋白进行了筛选,并获得若干烟草蛋白基因,其中包括2个可能结合GAG片段的ERF (ethylene responsive factor)转录因子。进一步研究发现,这2个ERF转录因子可与GAG片段在体外结合,但不能在酵母单杂交系统中激活由GAG片段操纵的报告基因表达。本研究也证明酵母表面展示系统可有效克服酵母内源干扰,弥补酵母单杂交系统在筛选易受酵母内源干扰DNA结合蛋白方面的不足。     

高效电转化技术在噬菌体抗体库构建中的应用

大肠杆菌的高效电转化技术是构建大容量噬菌体抗体库的关键技术，为了制备高转化效率的大肠杆菌TGI感受态细胞，采用电转化方法探索该菌在对数生长期的不同生长阶段、细胞浓度、噬菌粒DNA含量、电场强度对电转化效率的影响。实验结果表明，在菌株处于对数生长期的0D600值为0．5时，收集细胞制备感受态，感受态细胞浓度为4．0&#215;10m细胞／mL，噬菌粒pCANTAB—ScFvAFBI浓度为100pg/μL，电场强度为20kV／cm，此时制备的大肠杆菌TGI感受态细胞的电转化效率可达2．13&#215;10，cfu／μg DNA。研究结果表明，利用本实验确定的参数，可以制备出大肠杆菌TGI高效电转化感受态细胞，为大容量噬菌体抗体库的构建奠定了坚实的基础。     

噬菌体结合超声波处理有效地导入基因

本试验采用噬菌体（针状结品）和超声波处理相结合的方法（WSS法）向水稻细胞直接导入基因。这利，方法是将悬浮培养细胞及噬菌体、质粒DNA装入试管（1．5ml）内混合，通过超声波处理，让肽酸钾制成的噬菌体刺入水稻细胞，从而导入基因。首先，利用葡萄糖苷酸酶基因（GUS）检测了超声波输出功率条件，结果在输出功率40W（处理时间1分钟）的场合显示出最好的表达。此外，在超声波处理前先进行离心处理似乎可以提高GUS基因表达水平。     

抗体夹心BGT-ELISA方法的建立及在转基因白桦中的应用

以蜘蛛杀虫肽与Bt-toxinC肽融合蛋白基因(bgt基因)的表达产物的定量分析为研究目标,采用原核表达及纯化出融合蛋白His-BGT作为抗原进行兔免疫,得到相应的抗血清,采用ELISA法检测效价在1:10000以上,并对抗血清进行了免疫亲和层析,获得了高纯度的IgG,Westernblot检测具有较好的特异性。采用过碘酸钠法将抗体标记辣根过氧化物酶(HRP),得到第二抗体即酶标抗体,标记率在85%以上。建立起检测BGT杀虫蛋白的快速、灵敏的方法。应用该检测方法,分析了不同转基因白桦(BetulaplatyphyllaSuk.)株系中BGT蛋白含量占叶片可溶性总蛋白含量的0.05%～0.3%,并利用Westernblot验证了此方法是可靠的。说明抗体夹心BGT-ELISA方法能够定量分析转基因植株中BGT蛋白的含量,为转bgt基因植物的检测和应用奠定了基础。     

真菌毒素(mycotoxin)ELISA检测方法新进展

真菌毒素对人类及动物危害严重。人们建立了各种毒素检测方法,酶联免疫吸附试验(ELISA)其中的一种。本文对ELISA结合胶体金标技术检测霉菌毒素,以及与应用噬菌体展示技术产生的毒素模拟表位肽结合检测毒素的优点进行了综述。