RS基因转化胡萝卜及高白藜芦醇转基因胡萝卜株系筛选

摘要：白藜芦醇是具有抗病及多种保健功能的芪类次生代谢物,胡萝卜则是富含β胡萝卜素等多种营养成分的重要蔬菜。本研究着眼于创建具有白藜芦醇保健功能的胡萝卜新种质资源，在对葡萄白藜芦醇合成酶（Resveratrol synthase 简称RS）基因针对在胡萝卜中表达的密码子优化基础上构建无潮霉素抗性基因的转化载体pCB－RS－hyg-，应用农杆菌介导遗传转化方法将pCB和pCB－RS－hyg-共转化到胡萝卜并获得再生植株。经过T0、T1和T2代的逐代筛选，获得2个白藜芦醇含量较高的转基因胡萝卜株系，为进一步开发利用以及相关代谢途径的分子生物学研究奠定了重要基础。     

胸腺肽基因对胡萝卜的遗传转化

胸腺肽(thymosin)是一种由胸腺分泌的促进淋巴细胞合成和成熟的多肽激素,对于淋巴系统的发育和维持免疫系统的平衡起重要作用(李金屏,1999;张符光和刘佃辛,1996)。市场上广泛使用的胸腺肽主要是从小牛胸腺和猪胸腺中提取制备的。从小牛胸腺和猪胸腺中进行胸腺肽的提取,生产成本     

安祖花Arizona品种遗传转化体系的优化及矮牵牛查尔酮合成酶基因(PhCHS)的导入

安祖花(Anthurium andraeanum)是近年来非常流行的年宵花卉之一。为了优化安祖花的遗传转化体系,本研究以安祖花Arizona品种组培苗的叶片为外植体,将构建好的重组质粒p SN1301-HYG-Ph CHS在根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101介导下转化安祖花。优化后的体系为:首先将组培苗幼嫩叶片切块后置于1/3 MS预培养基(附加200 mg/L NH4NO3,0.5mg/L BA,0.05 mg/L 2,4-D,5g/L琼脂,30g/L蔗糖)中预培育3 d,然后用根癌农杆菌(菌液OD600=0.5)侵染10 min,将侵染过的叶片接种于MS培养基,28℃黑暗条件下共培养3 d,之后转移到附加有500 mg/L羧苄青霉素和30 mg/L潮霉素的愈伤诱导培养基中进行筛选。结果表明,抗性愈伤组织形成率可达到5%~6%。对体系优化过程中获得的14株抗性转基因植株进行PCR检测,其中9株为阳性,证实矮牵牛查尔酮合成酶基因(Petunia hybrida chalcone synthase gene,PhCHS)已经转入安祖花Arizona中。该研究结果为利用转基因方法改良安祖花品种提供了技术保障。     

用两个抗虫基因分别转化水稻及抗虫株系的获得

用水稻（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａＬ．）的幼胚、愈伤组织作受体,采用ＰＩＧ基因枪法,成功地将苏云金杆菌毒蛋白基因〖Ｂｔ毒蛋白基因,ｃｒｙＩＡ（ｂ）〗和马铃薯蛋白酶抑制剂基因（ｐｉｎⅡ基因）连同抗除草剂Ｂａｒ基因分别转入不同的水稻中,获得大量的转基因植株。Ｓｏｕｔｈｅｎ杂交分析途中外源抗虫基因均分别整合到水稻的基因组中。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交分析显示它们在水稻叶片中表达的水平较高。外源基因在一代中遵循３     

甘蔗蔗糖磷酸合成酶基因(SofSPSA)的克隆及正反义植物表达载体的构建

蔗糖磷酸合成酶(sPs)是植物体内控制蔗糖合成的关键酶.本研究通过搜索NCBI数据库获得迄今植物中所有的蔗糖磷酸合成酶基因序列共77条,其中全长序列43条;对全长序列进行进化分析表明,植物SPS基因分为A、B、C和D四个家族,同一植物体内有多个分别属于不同家族的SPS基因;比对A家族中进化关系很近的甘蔗(Saccharum officinarum )SofS PSl、水稻(Oryza sativa)OsSPS4、黑麦草(Lolium perenne )LpSPS和竹子(Bambusa oldhamii)BoSPS基因序列,并在保守区设计一对引物扩增获得甘蔗A家族SPS基因(SofSPSA)2 553 bp序列,结合5’-RACE和3’-RACE技术获得甘蔗SofSPSA基因全长cDNA序列3 906 bp;该序列包含一个3 183bp的开放阅读框(ORE),编码1 060个氨基酸残基的蛋白,其理论分子量和等电点分别为l18.4kD和6.09.该序列的起始密码子(ATG)位于转录起始位点后359bp处,终止密码子(TAA)后还有一段365bp的非编码序列,并带有真核生物典型的polyA尾巴(GenBank登录号:HM854011); SofSPSA与SofSPSⅡ、OsSPS4、LpSPS、BoSPS的氨基酸相似性分别为99.3％、91.8％、91.6％和91.9％,一致性分别为99.2％、87.9％、87.5％和87.8％;设计引物分别扩增正、反向SofSPSA基因ORF并分别连到pBI121上获得由组成型表达启动子35S驱动的正、反义植物表达载体pBI-SofSPSA和pBI-anti- SofSPSA,为进一步研究甘蔗SPS基因的生物学功能及利用甘蔗SPS基因改良作物品种提供科学依据.     

小油桐外植体的KN1基因遗传转化及其超量表达的转基因植株

本研究采用农杆菌介导法将KN1基因遗传转化小油桐,并获得了转基因植株。在研究中分析了农杆菌菌液菌液的浓度、侵染时间和外植体的大小对遗传转化效率的影响以及KN1基因超量表达对转基因植株再生的影响。研究结果表明：以苗龄15d左右的小油桐无菌苗子叶为外植体,农杆菌菌液浓度OD600为0.6～0.8时,侵染8min,外植体大小为（0.8×0.8）～（1.0×1.0）mm时,遗传转化效果最好;对抗性芽及再生植株进行GUS及PCR检测结果表明,KN1基因已经整合到小油桐植物基因组中。KN1基因的超量表达可提高小油桐再生芽分化,影响转化芽及植株的外观形态及叶片的表型,包括芽及植株矮小,茎杆粗壮;叶片缩小,边缘分裂,对称性丧失,无子叶柄等。     

转大麦烟酰胺合成酶基因提高水稻逆境胁迫耐受性的研究

维持铁等金属离子的动态平衡是保持植物细胞功能正常的先决条件。烟酰胺合成酶基因在单子叶禾本科的缺铁胁迫应答反应中起着关键作用,它的催化产物烟酰胺(NA)是铁及其他二价金属离子在体内吸收和转运的重要载体,且能与Fe2+结合形成Fe2+-NA复合物,从而使植物在酸性土壤中免受铁毒害。利用农杆菌介导法,将大麦烟酰胺合成酶基因NASHOR1转入水稻台北309中,经PCR及PCR-Southern杂交检测,确定目的基因已经整合到水稻基因组中。铁、锰、铜和锌含量的检测结果显示:与非转基因对照植株相比,转基因植株的金属元素含量都明显提高,铜、锌、锰和铁元素含量分别增加了15%、80%、31%和44%,但铁、锰和锌元素增量在株系间差异较大。在干旱胁迫下,转基因植株的超氧化物歧化酶(SOD)活性和脯氨酸含量都高于非转基因对照植株的,暗示大麦烟酰胺合酶基因在一定程度上提高了水稻的耐旱性。     

谷酰胺合成酶基因的克隆及转基因植物的获得

谷酰胺合成酶是高等植物体内ＮＨ４＾＋同化过程中的关键酶。本文计介绍了目前已克隆的微生物和植物的ＧＳ基因及有关ＧＳ基因植物表达载体构建和转基因植物获得的研究进展，探讨了导入异源ＧＳ基因以获得在氮盆瘠的土壤中能正常生长的转基因植物的可能性及其意义。     

可溶性淀粉合成酶SSⅢ基因对马铃薯的遗传转化

马铃薯是淀粉生产中重要的农作物之一,而可溶性淀粉合成酶SSⅢ是可溶性淀粉合成酶的主要活性成分,通过基因工程的手段来研究SSⅢ基因在淀粉合成中的功能可以用于改良马铃薯淀粉的品质。本研究采用根癌农杆菌介导法将强组成型表达启动子CaMV35S驱动的可溶性淀粉合成酶SSⅢ基因的RNA干扰表达载体导入马铃薯栽培品种克新1号和克新4号中,获得了65株卡那霉素抗性植株。对抗性植株PCR检测结果表明,SSⅢ基因的干扰片段已整合到马铃薯基因组中,RT-PCR检测表明SSⅢ基因在转录水平上受到了明显抑制。该研究为马铃薯淀粉品质的改良奠定了基础。     

茶树海藻糖-6-磷酸合成酶基因(CsTPS)的克隆及表达分析

海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-phosphate synthase,TPS)是海藻糖合成途径中的一个关键酶.目前,TPS基因的研究多数集中于细菌和真菌等,而对植物的研究较少.本实验通过对茶树(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)全器官转录组文库序列比对,获得一条与其他物种同源性较高的编码TPS基因的EST序列,通过RACE扩增后获得茶树TPS基因cDNA全长序列,命名为Cs TPS(GenBank登录号JQ742017).该基因cDNA全长3 125 bp,包含一个2799 bp的开放阅读框,编码932个氨基酸.多序列比对分析结果表明,Cs TPS基因编码的蛋白具有明显的TPS和TPP两个结构域.系统进化分析表明,其编码的氨基酸序列与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotiana tabacum)和番茄(Solanum lycopersicum)等植物的TPS同源性较高,且CsTPS与拟南芥TPS1(AtTPS1)的同源性高于TPS2(AtTPS2)和TPS3(AtTPS3).qPCR分析显示,CsTPS基因在茶树不同组织器官中呈现差异性表达.低温诱导促使老叶和嫩叶中的CsTPS基因上调程度明显大于根系,表明CsTPS基因可能参与了茶树抗寒机制.     

芪合酶基因转化小白菜

利用质粒pBin438构建了含有NPTⅡ基因和葡萄芪合酶(RS)基因的芪合酶组成型植物表达载体EHA105/pBinRS。用根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导法将RS基因导入纯合系小白菜(Brassicacampestrisssp.chinensis)品种中,经Kan抗性筛选、PCR及RT-PCR检测,RS基因已整合到小白菜基因组中并得到了表达,共获得了7株转基因植株。     

棉花农杆菌基因转化体系的优化和转苜蓿抗菌肽基因(alfAFP)植株的获得

为了优化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的棉花(Gossypium hirsutumL.)下胚轴切段的基因转化体系,以苜蓿(Medicago sativa L.)抗菌肽基因(alflafa antifungul peptide,alfAFP)为目标,利用γ-葡萄糖甘酸酶基因(gus)和潮霉素抗性基因(Hpt)的检测方法,分析了根癌农杆菌菌种、菌液浓度、浸染下胚轴的时间、共培养中乙酰丁香酮(AS)的浓度、共培养温度和时间等因子对基因转化的影响.优化分析表明,用农杆菌菌株LBA4404,当OD_(600)值为0.5～0.7的菌液浸染5～7日龄的棉花无菌苗下胚轴切段10～15 min.在含200 μmol/L AS的共培养基中21℃暗培养60h,可更有效地提高转化率.经上述条件处理的下胚轴在含50 mg/L潮霉素的愈伤诱导培养基上培养3周可产生转化率最高的愈伤组织.愈伤组织经分化培养获得15株再生棉花,经过PCR和PCR-Southern分析.发现其中12株含有外源基因alfAFP.     

中国野生葡萄芪合成酶基因融合表达、纯化及多克隆抗体制备

根据中国野生葡萄芪合成酶基因cDNA序列(该序列已申请国家发明专利,申请号:200510041662.4),设计1对PCR引物,以野生种华东葡萄(Vitispseudoreticulata)白河-35-15'RACEcDNA第一链为模板,克隆该目的基因。将该基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上,转化EscherichiacoliBL21,经诱导后表达出约66kD的融合蛋白。该融合蛋白主要以包涵体形式表达,经变性剂溶解、梯度透析,对该包涵体进行复性,复性蛋白通过与GlutathioneSepharose4BFastFlow结合、洗脱,获得了纯化的芪合成酶融合蛋白。以洗涤纯化的包涵体作抗原免疫家兔,制备多克隆抗血清,经Westernblot检测,该抗血清(稀释到1∶3000)与芪合成酶融合蛋白识别反应良好。     

转青蒿反义鲨烯合酶基因对烟草鲨烯合酶基因表达的影响

利用反义技术，通过根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导，将青蒿（Artemisia annua）的反义鲨烯合酶基因导入烟草（Nicotiana tabacum）株系W38中，存转基因烟草中，鲨烯合酶的表达成功地得到抑制，其mRNA的水平降低。对鲨烯合酶的下游产物之一胆同醇的检测显示，转基因烟草的胆固醇含量低于对照，同时以法呢基焦磷酸为前体的二萜支路产物之一的GA，含量得到提高。实验结果表明，反义抑制烟草鲨烯合酶可以降低植物甾醇的生物合成，并促进类异戊二烯途径中以法呢基焦磷酸为前体的其它代谢支路的生物合成。     

UV-B诱导拟南芥查耳酮合成酶（CHS）基因表达及其信号传导途径

应用RT-PCR技术研究了6个拟南芥（Arabidopsis thaliana）株系的查耳酮合成酶（CHS）基因转录对UV-B照射以及过氧化氢（H2O2）、D/L-NG -一甲基精氨酸（D-NAME、L-NAME）和2-苯基-l-4,4,4,4-四甲基咪唑啉-1-烃氧基-3-氧化物（PTIO）等化合物处理的响应。结果表明，在6个株系中，Fah1-2突变株UV-B伤害最为敏感，而野生型WS2对UV-B伤害耐受力最强；在15 μmol/m2/s UV-B照射2 h，CHS基因转录产物明显增加，但24 h后消失。H2O2对CHS基因转录没有显著作用，D-NAME 和L-NAME能抑制CHS在UV-B照射下表达转录的增加，而PTIO对CHS基因表达的抑制作用很弱。据此认为，CHS基因对UV-B照射响应的表达和转录不受NO和H2O2的调节     

辣椒烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸基因(NADPH)在辣椒中的遗传转化及其抗病性鉴定

为了分析辣椒NADPH基因与辣椒疫病抗性之间的关系,明确其在辣椒抗疫病方面的作用,以辣椒NADPH基因为目的基因,利用载体pBI121构建了植物表达载体pBI121-NADPH,采用农杆菌介导法转化辣椒(Capsicum annuum L.)感病品种B12,获得了5个卡那霉素抗性转化株系。对卡那霉素抗性转化植株进行PCR和RT-PCR分子检测发现,这5个转化株系含有目的基因CanNADPH。应用辣椒疫病抗性离体叶片鉴定技术,鉴定转基因植株对疫霉菌(Phytophthora capsici)的抗病性,结果表明,转基因辣椒的发病率较非转基因植株降低了22.2%,其病情指数降低了46.5%,表明辣椒NADPH基因在辣椒抗疫病方面有重要作用。     

自体诱导物合成酶基因的筛选及其功能分析

细菌在高细胞密度下通过产生一类化学信号分子(autoinducer,自体诱导物)感知细胞群体密度变化,从而对基因表达进行调控,这一现象被称为群体感应(quorum sensing).以中慢生型华癸根瘤菌 Mesorhizobium huakuii AS9 为出发菌株,利用转座子随机突变的方法获得了自体诱导物缺失突变株 YQ1,并克隆得到了其自体诱导物合成酶基因,命名为 mrhI;构建PmrhI-lacZ 转录融合表达质粒 pYQ1,通过同源重组的方法得到在华癸根瘤菌中 mrhI-lacZ 融合表达而且 mrhI 基因突变菌株YQ3.突变株 YQ3 的培养液上清不含有自体诱导物分子,通过 lacZ 报告基因的表达发现 mrhI 的表达受自体诱导物的调控,说明 mrhI 基因是 M. huakuii AS9 的群体感应体系中的自体诱导物合成酶基因.     

PchsA驱动的烟草orf25基因表达载体构建及遗传转化

为研究orf25基因的功能及其与烟草雄性不育性的相关性,通过PCR方法从质粒p UC57-Pchs A中扩增了花特异性启动子Pchs A,并以其取代植物表达载体p BI121中的组成型启动子Ca MV35S,然后将orf25基因插入到Pchs A启动子下游,构建由Pchs A启动子驱动的orf25基因表达载体,测序结果显示植物表达载体p BI121-Pchs A-orf25构建成功。将该表达载体导入根癌农杆菌LBA4404中,采用根癌农杆菌介导法遗传转化雄性不育烟草MS革新3号,共获得76株转基因烟草植株,经PCR鉴定,转基因阳性植株为18株,转化率为23.7%。研究结果证明目的基因orf25已整合到烟草基因组中,为进一步探究该基因的功能及其与烟草雄性不育性的关系奠定了基础。     

转柽柳金属硫蛋白基因（MT1）烟草的获得及对重金属镉的抗性分析

将柽柳（Tamarix. sp）金属硫蛋白基因（MT1）插入到植物表达载体pBI121，利用农杆菌（Agrobactrium tumefaciens）介导法将MT1导入烟草基因组。对转基因T1植株的卡那霉素抗性分析表明，多数转基因植株后代表现为3:1的分离比例，只有少数转基因植株的抗性分离表现为15:1或不符合孟德尔遗传的分离比例。说明整合到烟草基因组的外源基因多为单拷贝基因，也有少数为多拷贝基因。对具有卡那霉素抗性的转基因植株进行PCR-Southern检测和Northern杂交分析表明，外源MT1基因已整合到烟草基因组，并且得到了正确表达。转基因植株对重金属镉的抗性比对照显著提高，表现为转基因植株的株高和鲜重均明显优于非转基因株系。