猪β-干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其活性

为了高效表达分泌型的猪β-干扰素,将去除信号肽的编码梅山猪β-干扰素成熟多肽基因(mPoIFNβ)插入酵母-大肠杆菌穿梭载体pPIC9K,构建成分泌型重组表达载体pPIC9K-mPoIFNβ。将以SalⅠ线性化的pPIC9K-mPoIFNβ用化学方法(LiCl),与鲑鱼精DNA(ssDNA)共转化入毕赤酵母菌株GS115,转化子经MD平板筛选和PCR鉴定后获得阳性菌株,再经高浓度G418筛选到多拷贝菌株。以1%甲醇连续诱导4 d,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明:表达产物为22 ku和26 ku的混合物,在GS115中的表达量约为80 mg/L,占分泌型总蛋白的29.4%~30.8%,表明猪β-干扰素基因在毕赤酵母中获得了高效分泌表达。对表达产物进行理化分析发现,重组酵母菌表达的蛋白耐酸(pH2),对热(56℃)部分敏感,并能被特异性的抗猪β-干扰素抗体中和而不与抗猪γ-干扰素抗体反应。以细胞病变抑制法(CPE50)测定干扰素抗病毒活性,在MDBK(牛肾细胞系)中表达的猪β-干扰素的抗VSV比活性达到2.0×106U/mg;对口蹄疫病毒在IBRS-2细胞中的增殖也有明显的抑制作用。     

猪β-干扰素的基因改造表达及其抗猪繁殖与呼吸综合征病毒活性测定

本研究根据GenBank上登录的猪β-干扰素基因成熟肽核苷酸序列(mPoIFNβ),在保持原猪β-干扰素蛋白序列不变的基础上,对猪β-干扰素基因进行了毕赤酵母偏嗜性改造,并构建了毕赤酵母重组表达质粒pPICZαC-PoIFNβ。pPICZαC-PoIFNβ经SacⅠ酶切线性化后,电击转化导入感受态的毕赤酵母菌株X-33中,转化子经YPDS+Zeocin抗性平板筛选和PCR鉴定后获得多株阳性菌株。阳性酵母菌株经甲醇诱导分泌表达了重组PoIFNβ,其表达量约为127.9 mg/L。表达产物经SDS-PAGE和Western blotting检测,结果表明,表达产物为分子质量约25和28 ku的混合物,并且二者都可与PoIFNβ阳性血清结合。以细胞病变抑制法测定重组β-干扰素在BHK-21细胞上的抗水泡性口炎病毒活性为2.8×10³ IU/mL;对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在Marc-145细胞上抗病毒活性达到1.6×10³ IU/mL。     

猪Ⅰ型干扰素融合表达及其抗病毒活性检测

采用重叠延伸PCR(splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)技术将猪I型干扰素PoIFN-α和PoIFN-β成熟肽基因进行连接,构建表达载体pET30a-PoIFN-α/β进行融合表达,利用细胞病变抑制试验检测融合干扰素rPoIFN-α/β抗病毒活性,并与非融合干扰素rPoIFN-α和rPoIFN-β进行比较分析。结果表明,在PK-15细胞上,融合干扰素rPoIFN-α/β表现出较强的抗病毒活性,其对VSV、PRRSV、CSFV、PRV、PPV、PASTV、PEDV和TGEV的抗病毒活性明显高于非融合干扰素,体现了一定的叠加效应,可以用于猪病毒性疾病的防治。     

猪α-干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性测定

利用基因工程技术,将编码梅山猪α-干扰素成熟蛋白基因(mPoIFNα,501 bp)亚克隆到含分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建成分泌型重组表达载体pPIC9K-mPoIFNα。用化学方法(LiCl)将线性化的mPoIFNα与ssDNA共转化入毕赤酵母菌株GS115,转化子经MD平板筛选和PCR鉴定后,得到的阳性菌株再以高浓度的G418筛选多拷贝重组子。该高拷贝菌株经1%甲醇连续诱导4 d,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot检测,结果表明在毕赤酵母中猪α-干扰素获得分泌型表达,表达产物约为20 000,在GS115中的表达量约为40mg/L,占GS115表达的可分泌型总蛋白的40.1%。对表达产物进行理化分析发现,重组酵母菌表达的蛋白耐酸(pH2),对热(56℃)部分敏感,并能被特异性抗猪α-干扰素抗体中和而不与抗猪γ-干扰素抗体反应。细胞病变抑制法(CPE50)测定干扰素生物活性,试验结果表明rPolIFNα具有较高的抗病毒生物活性,在MDBK中的抗VSV比活性为8.0×106U/mg。     

猪β干扰素的基因改造及真核表达

本试验选择高表达密码子重新设计合成猪β干扰素成熟肽核苷酸,通过设计特异的引物,在毕赤酵母表达系统中表达PoIFN-β,获得分泌表达的高活性重组PoIFN-β,并采用非洲绿猴肾细胞(Vero)-水泡性口炎病毒(VSV)系统以细胞病变抑制法测定重组猪β干扰素的效价,为指导重组PoIFN-β的临床使用和研究其生物学功能提供基础。     

猪α干扰素基因突变、表达及其高效抗病毒活性筛选研究

利用RT-PCR方法从猪肝细胞总RNA中扩增出编码猪α干扰素基因,根据大肠杆菌偏嗜性及活性位点改造基因并克隆至原核表达载体p ET21a,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白诱导表达和鉴定。重组蛋白以包涵体形式表达,经变-复性及纯化处理后,获得多种不同基因型的高纯度猪α干扰素。用细胞病变抑制法在MDBK/VSV系统上进行抗病毒活性测定,结果表明经过基因改造的猪α干扰素(Po IFN-M6)具有更高抗病毒活性,约为2.97×108U/mg。本研究为猪α干扰素基因工程产品的研发及其在临床兽医的应用奠定基础。     

蜂素信号肽介导猪干扰素-γ在杆状病毒中分泌表达及抗病毒活性检测

应用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统,将编码成熟的猪干扰素-γ基因插入供体质粒pFastBacTM1polyhedrin启动子控制下的多克隆位点,引入昆虫细胞可识别的蜂素信号肽(Honeybee melittin signal peptide)取代猪干扰素-γ原有信号肽以实现在昆虫细胞中分泌型表达,并在C端融合6个组氨酸标签以利于纯化。将构建质粒转化DH10Bac感受态细胞获得重组穿梭载体质粒,转染对数生长期的Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒。重组蛋白通过SDS-PAGE、间接免疫荧光、Western-blot证明在重组杆状病毒感染的昆虫细胞中获得分泌表达。通过在猪肾细胞(PK-15)上抑制水泡性口炎病毒(VSV)致病变作用检测重组蛋白的抗病毒活性是1.38×106U/mL。     

猪α-干扰素基因在大肠杆菌中的表达及活性测定

根据GenBank中登录号为M28623的基因序列,合成猪α-干扰素成熟肽基因,并将该基因克隆至pQE-31载体,转化宿主菌M15诱导表达,SDS-PAGE电泳结果表明该蛋白以包涵体形式表达,分子量约21 ku,经包涵体变性复性后获得了具有抗病毒活性的干扰素,用MDBK-VSV系统检测其抗病毒活性不低于1010 U/0.1 mL.     

重组猪干扰素α的原核表达及抗病毒活性

为了探究重组猪干扰素(PoIFN-α)在体内外的抗病毒活性,利用pET-32a载体系统,构建了PoIFN-α的原核表达体系。在体外,MTT法在猪肾细胞(PK-15)和猪睾丸细胞(ST)上测定了其细胞毒性,并利用细胞病变抑制法测定其抗水泡性口炎病毒(VSV)、猪脑心肌炎病毒(EMCV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)的活性,同时测定了重组蛋白作用PK-15细胞后干扰素刺激基因(ISGs)的转录水平;之后通过小鼠攻毒保护试验,测定了rPoIFN-α治疗后各组织器官的病毒载量,ELISA测定了小鼠血清中细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-10和IL-6的动态变化,并对整个试验期间小鼠出现的临床症状进行打分。结果显示,成功获得了原核表达的特异性重组蛋白rPoIFN-α,在细胞上抗病毒比活性达到1.67×10⁶ IU,对细胞没有损害作用,且显著上调了Mx1、OAS等因子的转录水平;在小鼠体内能明显拮抗EMCV和PRV的增殖,减少促炎因子的产生,延缓临床症状的出现。结果表明,原核表达重组蛋白rPoIFN-α在体内外均具有抗病毒活性,为进一步推进蛋白药物在临床上的应用奠定了基础。     

转基因作物及其在畜禽饲料中的应用安全性研究进展

本文综述了国内外对转基因作物营养成分含量、营养成分消化代谢率、对动物生产性能、动物产品、血液生化指标的影响以及外源基因的转移情况等的研究进展。转基因作物作为动物饲料原料,目前绝大多数研究认为是安全的,与非转基因亲本间具有“营养等同性”。     

猪α干扰素的原核表达及抗高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒活性测定

为了研究高效广谱的基因工程抗病毒制剂,本研究采用PCR技术自猪肝脏总DNA中扩增、克隆猪α干扰素（PoIFN-α）成熟肽基因并亚克隆入pQE30载体进行原核表达,对表达的融合重组猪α干扰素（rPoIFN-α）蛋白通过尿素变性、低浓度蛋白复性液复性、PBS溶液透析等步骤进行纯化,采用细胞病变抑制法分别测定rPoIFN-α蛋白在PK15细胞上抗水泡性口炎病毒（VSV）增殖活性及在Marc-145细胞上抑制高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的增殖活性,以分别评价rPoIFN-α的活性单位及其体外抑制高致病性PRRSV增殖所需的最低浓度。结果表明,克隆的PoIFN-α成熟肽基因全长501bp,编码166个氨基酸;表达的rPoIFN-α蛋白分子量大小20.7ku左右,与预期大小相一致;经纯化后的蛋白纯度在95%以上;纯化的rPoIFN-α蛋白在PK15细胞上抗VSV病毒活性单位为1.4482×10^4IU/mL（5.2×10^6IU/mg）,在Marc-145细胞上能完全抑制高致病性PRRSV增殖所需的rPoIFN-α蛋白最低有效剂量为640U/mL（2.3×10^4U/mg）。这些研究结果为新型基因工程抗病毒制剂的开发以及用于高致病性PRRSV性疾病的预防和治疗奠定了基础。     

猪捷申病毒3D蛋白的原核高效表达及其反应活性

根据猪捷申病毒（PTV）Swine／CH／IMH／03株核苷酸序列，设计了1对特异性引物，以全长基因组重组质粒pSK—PTVFL为模板扩增了3D基因，并将扩增产物定向克隆到原核表达载体pET30a（＋）中，阳性质粒转化BL21（DE3），阳性菌经0．3mmol／L IPTG诱导后，进行Western—blotting检测。结果显示，3D蛋白获得了高效表达，表达量占菌体总蛋白的66．1％，且重组蛋白能与PTV Swine／CH／IMH／03株阳性血清发生特异性反应。表明，3D蛋白能在大肠杆菌中高效表达，并具有良好的免疫原性，这为开发相应的鉴别诊断技术奠定了基础。     

Antiviral and antigenic properties of recombinant porcine interferon gamma

Recombinant porcine interferon gamma (rPoIFN gamma) induced a dose-dependent inhibition of the cytopathic effect produced by vesicular stomatitis virus (VSV) challenge of both homologous and heterologous (bovine) cell lines. In addition, an antiviral effect of rPoIFN gamma was demonstrable against the coronavirus transmissible gastroenteritis virus (TGEV) infection of porcine epithelial cells and of pulmonary macrophages. A rabbit anti-PoIFN gamma antiserum was prepared and shown to specifically neutralize the antiviral effects of natural and recombinant porcine IFN gamma preparations. This antiserum could also neutralize recombinant bovine IFN gamma but not recombinant human IFN gamma. These results suggest antigenic homology of porcine and bovine IFN gamma but antigenic differences between these molecules and human IFN gamma.     

The interferon sensitivity of selected porcine viruses.

The objective of this study was to compare the sensitivity of 11 porcine viruses to the antiviral effects of porcine interferon-alpha in serum from piglets which had been infected 19 h previously with transmissible gastroenteritis virus, and of porcine interferon-beta prepared in PK-15 cells by induction with polyinosinic:polycytidylic acid, in yield reduction assays in pig kidney cells which were treated with interferon before virus challenge, and both before and after virus challenge. The most sensitive virus to both types of interferon was vesicular stomatitis. A porcine isolate of bovine herpesvirus type 1, hemagglutinating encephalomyelitis virus and porcine enterovirus types 1 and 2 were also highly sensitive to interferon-alpha. There was little reduction in the yield of porcine parvovirus or porcine rotavirus, while swinepox, swine influenza and transmissible gastroenteritis viruses were intermediate in their sensitivity to interferon-alpha. In addition to vesicular stomatitis virus, porcine adenovirus type 3, swine influenza, hemagglutinating encephalomyelitis and porcine rotavirus were highly sensitive to interferon-beta, while swinepox, bovine herpesvirus type 1, porcine parvovirus, transmissible gastroenteritis and porcine enteroviruses were less sensitive than the above viruses to interferon-beta, although all showed significant reductions in virus yield.     

猪γ-干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其抗病毒作用

为了获得高效分泌表达重组猪γ-干扰素(rPoIFNγ),将去除信号肽的编码梅山猪γ-干扰素成熟蛋白基因(mPoIFNγ)插入酵母-大肠杆菌穿梭载体pPIC 9K中,构建成分泌型重组表达载体pPIC 9K-mPoIFNγ.将线性化的pPIC 9K-mPoIFNγ以化学方法(LiCl)转化入毕赤酵母菌株GS115(组氨酸缺陷型),转化子经MD平板筛选和PCR分析鉴定后,以G418(4 g/L)筛选到多拷贝菌株.SDS-PAGE和Western-blot检测结果表明,所获得的重组子能够分泌表达出17 000和23 000左右的mPoIFNγ特异蛋白,其表达量约为120 mg/L,占分泌型总蛋白的65%;细胞病变抑制法(CPE50)测定干扰素生物活性,结果表明rPolIFNγ具有较高的抗病毒生物活性,在MDBK中的抗VSV比活性为1.67×106 U/mg.     

猪γ干扰素基因重组腺病毒的构建与鉴定

干扰素-γ(INF-γ)又称Ⅱ干扰素,主要是由活化的CD4+、CD8+等T淋巴细胞和NK细胞产生的一种细胞因子[1-2],猪γ干扰素全基因为501个碱基,编码166个氨基酸,前23个氨基酸为信号肽,后143个氨基酸为活性成熟蛋白,天然活性状态为同源二聚体,而单体形式没有生物学活性[3].     

猪圆环病毒2型多表位串联体诱导表达及其免疫活性

为了获得体外诱导表达的具有良好免疫原性的PCV2多表位串联体。本试验筛选PCV2主要抗原表位,顺序组成多表位串联体,人工合成其cDNA序列,通过BamHⅠ和SalⅠ定向克隆至原核表达载体pEGX-4T-1多克隆位点,转化BL21感受态细胞,筛选阳性克隆,进行IPTG诱导表达。使用SDS-PAGE对目的基因表达情况进行分析,提取与纯化融合蛋白多肽,Western blot鉴定表达多表位串联蛋白免疫活性。融合蛋白多肽免疫BALB/c小鼠,ELISA测定其抗体,评价其免疫原性。结果显示,成功构建了含7个PCV2抗原表位串联体的表达重组质粒pEGX-4T-1-ep,SDS-PAGE分析显示,融合蛋白多肽在大肠杆菌中获得了有效表达,其分子量约35ku,主要以可溶性形式存在。Western blot结果显示,提取与纯化融合蛋白多肽与PCV2阳性血清具有良好的反应原性。ELISA检测结果显示,纯化的融合蛋白多肽可有效刺激机体产生PCV2特异性抗体,具有良好的免疫原性。结果表明,构建的PCV2多表位串联体表达重组体具有良好的体外表达特性,表达蛋白具有良好的免疫原性。该研究为PCV2表位筛选,功能鉴定及多表位疫苗研究奠定了一定基础。     

Antiviral activity against transmissible gastroenteritis virus, and cytotoxicity, of natural porcine interferons alpha and beta.

Porcine interferon (POIFN)-alpha prepared in primed peripheral blood leukocyte cultures induced with Newcastle disease virus and POIFN-beta from PK-15 cell cultures induced with polyinosinic:polycytidylic acid were partially purified by precipitation with potassium thiocyanate and anion exchange chromatography. Mean purification factors in terms of units of POIFN per mg of protein, of 37 and 12 were obtained for POIFN-alpha and POIFN-beta respectively. In yield reduction assays in swine testis and pig kidney cell cultures, POIFN-alpha and POIFN-beta had greater antiviral activity against vesicular stomatitis virus than against transmissible gastroenteritis virus (TGEV). The antiviral effects were greater at higher concentrations of interferon (IFN), and when the IFN treatments were continued postinfection. Porcine interferon-beta showed greater antiviral activity against TGEV than POIFN-alpha, but this may have been partly due to cytotoxicity. There were no major differences in the antiviral activities of crude and partially purified IFN preparations. Both types of IFN showed antiviral activity against TGEV in yield reduction assays in porcine intestinal explant and intestinal epithelial cell cultures. Crude POIFN-beta was found to be rapidly cytotoxic, especially in porcine cells, and some fractions of partially purified POIFN-beta were also cytotoxic. The cytotoxicity of POIFN-beta was partially neutralized by antibodies against human IFN-beta, but human IFN-beta was not cytotoxic for porcine or bovine cells.