TNF-α在IFN-γ诱导的感染牛分枝杆菌的THP-1细胞凋亡过程中的作用及相关信号通路分析

为研究IFN-γ对感染牛分枝杆菌的THP-1细胞的促凋亡作用,及TNF-α在此细胞凋亡过程中的作用和相关信号分子的变化,使用浓度为15 ng.mL-1的IFN-γ作用于不同剂量牛分枝杆菌北京株(MOI10∶1,20∶1)感染的THP-1细胞,在感染后12、24、36、48和72 h,使用流式细胞仪测定细胞凋亡百分比。结果显示,IFN-γ诱导了M.bovis北京株感染的细胞凋亡,并且凋亡呈时间相关性。随着细胞凋亡百分比的增加,牛分枝杆菌的CFU降低。在IFN-γ和M.bovis北京株(MOI10∶1)处理的巨噬细胞内加入抗TNF-α单克隆抗体,感染后36 h,细胞凋亡百分比测定结果显示,加入抗TNF-α单抗抑制了IFN-γ诱导的M.bovis感染的THP-1细胞的凋亡,与对照组相比,差异显著(P0.05);用分光光度计检测表明Caspase-3和Caspase-8的激活是TNF-α依赖性的。在IFN-γ和M.bovis北京株(MOI10∶1)作用的THP-1细胞内分别加入JNKinhibitor I或NEMO-Binding Domain BindingPeptide,或同时加入2种抑制剂,36 h后测定细胞凋亡情况,与对照组相比,加入抑制剂后,细胞凋亡无显著差异(P0.05),说明在本试验中,JNK通路和NF-κB凋亡通路未被激活。本研究初步阐明了TNF-α在IFN-γ诱导的感染牛分枝杆菌的细胞凋亡过程中的作用及相关信号通路。     

IP-10作为牛结核病诊断标志物的初步探究

为评价细胞因子IL-12 p40、IP-10和TNF-α转录水平与牛分枝杆菌感染之间的关系,及其在牛结核病诊断中的应用潜力。采集田间筛选的结核病阳性牛、结核病阴性牛以及牛分枝杆菌68002人工感染牛的外周血淋巴细胞,经牛结核菌素(PPDB)、重组蛋白CFP-10-ESAT-6(CE)、MPT63、PET和PBS分别刺激6 h,提取细胞总RNA,用荧光定量PCR检测IL-12 p40、IP-10、IFN-γ和TNF-α的转录水平。结果显示结核病阳性牛的外周血淋巴细胞经PPDB和CE刺激后,其IP-10的m RNA转录水平显著高于结核病阴性牛,且与IFN-γ的m RNA转录水平具有良好的相关性;初步建立牛结核病IFN-γ和IP-10的Real-time PCR检测方法,其对临床阳性样本的检出率分别为71.45%和78.57%。因此,IP-10的m RNA转录水平与牛分枝杆菌的感染相关,有作为牛结核病诊断标志物的潜力。     

牛分枝杆菌Mb0869c抑制外源性细胞凋亡的研究

为探究与人受体相互作用蛋白激酶1 (RIPK1)存在互作的牛分枝杆菌(M. bovis) Mb0869c蛋白对细胞凋亡的作用机制，本研究通过PCR从M. bovis DNA中扩增Mb0869c基因片段后构建重组质粒p MN437-Mb0869c并经PCR和测序鉴定正确后，利用电转化法将重组质粒电转入耻垢分枝杆菌(MS)中，并经western blot鉴定Mb0869c蛋白的表达情况。结果显示，重组菌株中出现约55 ku的特异性条带，表明获得了表达Mb0869c的重组菌MS＿Mb0869c。将MS＿Mb0869c株和对照菌株MS＿Vec分别感染人单核巨噬细胞(THP-1)，通过PI和AnnexinⅤ/FITC染色，经流式细胞仪检测细胞的凋亡情况，结果显示，MS＿Mb0869c感染细胞的凋亡率显著低于MS＿Vec感染组，这表明Mb0869c可以抑制MS诱导的细胞凋亡。将上述获得的Mb0869c基因片段克隆于p LVX-IRES-Puro-3×Flag中，构建的重组质粒经测序鉴定正确后，转染HEK293T细胞中，利用嘌呤霉素筛选表达Mb0869c的细胞并经western blot鉴定。结果显...     

cGAS介导牛分枝杆菌诱导小鼠髓源树突状细胞成熟

旨在深入研究小鼠髓源树突状细胞(BMDC)感染牛分枝杆菌(M.bovis)后环磷酸鸟苷-磷酸腺苷合酶(cGAS)的调控作用。通过体外诱导C57BL/6骨髓细胞分化为树突状细胞,建立牛分枝杆菌感染模型,运用siRNA技术沉默cGAS基因的表达,分别设置对照组、感染组、沉默组。通过流式细胞仪检测BMDC表型变化,Western blot和免疫荧光技术检测cGAS信号通路中STING、TBK1、p-TBK1及IRF3的表达情况,ELISA检测细胞上清液中细胞因子分泌水平。结果表明,牛分枝杆菌可刺激BMDC引起细胞表面标志物CD86、CD80、CD40、MHC-Ⅱ表达升高,相关细胞因子IFN-β、TNF-α、IL-12p70、IL-6分泌量提高,BMDC的抗原提呈能力增强。同时cGAS信号通路被激活,下游STING、p-TBK1、IRF3蛋白活化,而沉默cGAS基因后相关指标均显著下调。这表明牛分枝杆菌感染BMDC可激活cGAS信号通路,且cGAS有助于BMDC的成熟和活化。     

牛坏死杆菌对EPH4细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用

为探究牛坏死杆菌对小鼠乳腺上皮细胞系(EPH4细胞)增殖和凋亡的影响,本研究将坏死杆菌(牛A25菌株)以感染复数(MOI)为100感染EPH4细胞,用EdU细胞增殖法检测细胞增殖率,用Hoechst染色以及DNA Ladder检测细胞凋亡,并用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测凋亡基因的mRNA相对表达量变化。EdU检测结果显示,坏死杆菌可抑制EPH4细胞增殖;Hoechst染色以及DNA Ladder检测结果均显示,坏死杆菌可促进细胞凋亡的发生;RT-qPCR结果显示,与对照组相比,坏死杆菌感染EPH4细胞2 h时,促凋亡基因Bax、Bax/Bcl-2的mRNA相对表达量显著上调(P<0.05),感染4 h时,促凋亡基因Caspase-3和Caspase-9的mRNA相对表达量极显著上调(P<0.001),感染6 h时,促凋亡基因AIF的mRNA相对表达量极显著上调(P<0.001)。由此可见,牛坏死杆菌能够抑制EPH4细胞增殖且诱导细胞凋亡,为进一步研究坏死杆菌致病机制提供了相关数据支持。     

谷氨酰胺对BCG诱导小鼠传代巨噬细胞凋亡的调控作用

旨在探讨谷氨酰胺在牛分枝杆菌卡介苗(Bacille Calmette-Guerin vaccine, BCG)感染巨噬细胞过程中对凋亡的调控作用。本文采用小鼠单核巨噬细胞RAW264.7,首先建立了BCG感染致细胞凋亡的细胞模型，采用Western blotting检测凋亡关键因子的表达变化，确定最佳感染条件；进而利用无谷氨酰胺培养基构建谷氨酰胺剥夺模型并结合BCG感染，采用ELISA、免疫印迹、免疫荧光和流式细胞术等技术检测了细胞内谷氨酰胺关键代谢指标的差异变化。通过上述研究，阐明谷氨酰胺对BCG诱导的巨噬细胞凋亡的调控作用，并初步探讨其机制。结果表明，BCG感染显著上调了小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞中Caspase 3和PARP的蛋白表达(P<0.001),最佳感染时间为12 h,最佳感染复数为10 MOI,同时BCG感染促进了RAW264.7细胞内谷氨酰胺的分解代谢。剥夺谷氨酰胺后能极显著降低BCG感染后巨噬细胞中谷氨酸(P<0.001)和谷胱甘肽(P<0.01)的含量，极显著增加了细胞内ROS的含量(P<0.001)。同时，抑制谷氨酰胺代谢促进了RA...     

钙结合蛋白S100A4对BCG感染THP-1细胞自噬的调控作用

本研究旨在探究牛结核分枝杆菌减毒株卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)感染人单核巨噬细胞THP-1后,钙结合蛋白S100A4对细胞自噬的调控作用。以感染复数为10∶1的BCG感染THP-1细胞不同时间,用Western blot检测S100A4和LC3Ⅱ的表达,以确定最佳感染时间,并采用透射电镜观察自噬体数量变化。在BCG单独感染或与S100A4小干扰RNA共处理THP-1细胞12 h后,采用qRT-PCR检测S100A4及自噬相关因子——微管相关蛋白轻链3II (microtubule-associated protein light chain 3Ⅱ, LC3Ⅱ)、自噬相关蛋白7(autophagy-related gene 7, Atg7)、Beclin-1在mRNA水平上的表达,采用Western blot检测S100A4、LC3Ⅱ、Atg7、Beclin-1在蛋白水平的表达。利用mRFP-GFP-LC3检测自噬流,激光共聚焦显微镜观察细胞中mRFP-LC3和mRFP-GFP-LC3点状聚集。结果显示：在BCG感染THP-1细胞不同时间后,S100...     

细胞因子IL-17作为牛结核病诊断标志物的研究及实时荧光定量PCR检测方法的建立

试验旨在评价细胞因子IL-6和IL-17mRNA转录水平与牛分枝杆菌感染之间的关系,及其在牛结核病诊断中的应用潜力。通过皮内变态反应试验和IFN-γ释放试验临床筛选结核病阳性牛和结核病阴性牛,采集试验动物抗凝全血,分离、收集外周血淋巴细胞,分别用牛结核菌素(PPD-B)、禽结核菌素(PPD-A)、重组蛋白CFP-10-ESAT-6(CE)、pET-32a载体标签蛋白(PET)或PBS 37℃培养6h,用实时荧光定量PCR检测细胞因子IL-6、IL-17和IFN-γ的mRNA相对转录水平。结果显示,PET和空白对照PBS类似,不能刺激细胞因子mRNA转录水平的提高,表明CE中包含的PET对试验的影响可忽略不计;牛外周血淋巴细胞经PPD-B、PPD-A或CE刺激后,结核病阳性牛样品中IL-17和IFN-γ的mRNA转录水平均显著高于结核病阴性牛(P0.05),其中PPD-B刺激效果强于CE和PPD-A,而CE刺激的特异性更好;选取CE作为最佳刺激源,结果显示,IL-17和IFN-γ的mRNA转录水平之间相关性良好(spearman r=0.79),并初步建立了基于IL-17和IFN-γ转录水平的实时荧光定量PCR检测方法;以此方法对14头结核病阳性牛进行临床检验,IL-17实时荧光定量PCR法的阳性样本检出率为85.7%,高于IFN-γ(71.4%)。本研究结果初步表明,牛分枝杆菌特异性抗原(PPD-B、CE)诱导的IL-17mRNA转录水平与牛结核病相关,以CE为刺激源建立的IL-17实时荧光定量PCR检测方法具有用于牛结核病诊断的潜力。     

Fas对镉激活PC12细胞线粒体凋亡通路的影响

旨在探究死亡受体Fas在镉致大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC12）凋亡中的作用及其对线粒体通路的调控机制,用10 μmol·L^-1镉处理Fas基因沉默的PC12细胞株12 h,通过Western blot检测BH3相互作用域死亡激动剂（BID）、半胱氨酸蛋白酶-9（caspase-9）、半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）、多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（PARP）的活化情况,Bcl-2相关X蛋白（Bax）、B细胞淋巴瘤/白血病-2基因（Bcl-2）、凋亡诱导因子（AIF）、核酸内切酶G（Endo G）的表达情况,以及细胞色素C（Cyt C）在细胞内的分布情况,免疫荧光染色检测AIF核转位。结果显示,镉极显著上调tBID/BID比值和Bax/Bcl-2比值,诱导Cyt C从线粒体释放到细胞质,激活caspase-9、caspase-3和PARP,增加AIF和Endo G蛋白表达水平（P<0.01）,并诱导AIF核转位;沉默Fas极显著抑制镉引起的tBID/BID比值和Bax/Bcl-2比值升高,Cyt C从线粒体释放到胞浆,caspase-3、PARP蛋白活化和AIF、Endo G蛋白表达水平极显著升高（P<0.01）,显著抑制镉激活的caspase-9（P<0.05）,并抑制AIF核转位。综上表明,Fas通过调控线粒体通路参与镉致PC12细胞凋亡。     

牛结核γ干扰素ELISA检测方法的建立及应用

为建立快速、敏感的牛结核分枝杆菌检测方法,本研究利用两株牛γ干扰素(IFN-γ)的单克隆抗体(MAb)建立检测牛IFN-γ的抗原捕获夹心ELISA方法。通过优化反应条件,确定抗体包被浓度为5μg/mL;全血刺激上清最佳稀释倍数为1∶2,作用时间为1 h;最佳酶标抗体作用时间为1 h;底物作用时间为15 min。该方法对重组牛IFN-γ的最小检测量可达25 pg/mL,对重组和天然牛的IFN-γ均具有特异性,与IFN-α、IFN-β或白细胞介素4为阴性反应;与山羊和绵羊的IFN-γ呈阳性反应,而与猪、鸡、鹿、犬和人的IFN-γ呈阴性反应。通过对177头牛进行检测,该方法与皮内变态反应的符合率为78.9%,与进口试剂盒的符合率为89.8%,表明该方法具有良好的应用价值。本研究为牛结核早期及其潜伏期感染的监测及流行病学调查提供了快速敏感的检测方法。     

牛病毒性腹泻病毒2型感染激活MDBK细胞中未折叠蛋白应答导致细胞凋亡

根据对培养细胞致细胞病变的能力将牛病毒性腹泻病毒2型毒株(BVDV-2)分为致细胞病变型和非致细胞病变型。BVDV-2的致细胞病变机制还不是很清楚。试验通过显微镜检查和微阵列分析检测由BVDV-2感染造成的牛肾细胞发病机理。结果发现,BVDV-2可激活内质网应激信号通路,该通路对感染细胞的凋亡起作用。在感染BVDV-2期间用RT-PCR监测内质网应激标记基因的表达,结果表明,用BVDV-2致细胞病变毒株感染牛肾细胞可诱导葡萄糖调节蛋白78的表达。感染BVDV-2也可诱导DNA损伤诱导转录物3的表达并抑制外源凝集素半乳糖苷结合溶解物1的水平。结果表明,BVDV-2致细胞病变毒株可诱导内质网应激反应从而导致细胞凋亡。     

通过抑制caspase-8活性提高PRRSV体外培养滴度的初步研究

探讨通过凋亡抑制剂阻断PRRSV诱导的细胞凋亡来促进PRRSV体外复制,从而提高PRRSV体外培养滴度的可行性。本研究以PRRSV高致病毒株(HP-PRRSV)感染Marc-145细胞,并用三种凋亡抑制剂(Z-VAD-FMK、Z-IETD-FMK、Z-LEHD-FMK)分别处理PRRSV感染细胞,通过比较在不同的浓度、不同的作用时间处理下PRRSV培养滴度(TCID₅₀)来筛选最佳抑制剂及其最佳使用浓度和作用时间。同时采用caspase-8活性蛋白酶检测试剂盒、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、流式细胞术等检测在最佳抑制剂作用下caspase-8活性、细胞凋亡及其通路相关因子表达情况。结果显示：z-IETD-FMK(caspases-8特异性抑制剂)为最佳抑制剂,10 μmol/L为最佳使用浓度,PRRSV感染细胞48 h后加入10 μmol/L Z-IETD-FMK能最大限度提高PRRSV体外培养滴度。此外,PRRSV感染Marc-145细胞后,细胞caspase-8活性显著增加,且随着感染时间的延长,细胞凋亡率及促凋亡因子Bax均呈上升趋势,而抑凋亡因子B...     

母牛分枝杆菌感染引起小鼠细胞免疫应答的特征分析

为研究母牛分枝杆菌感染鼠的细胞免疫应答变化,本研究将母牛分枝杆菌分离株感染C57BL/6J小鼠,通过病理组织学检查肝脏的病理变化,并采用荧光定量PCR检测肝脏中细胞因子IFN-γ、IL-12b、TNF-α、IL-10、NLRP3和TGF-β表达量的变化。结果发现,肝脏组织出现明显的炎性细胞浸润,而且实验组小鼠肝脏IFN-γ、IL-12b、TNF-α的表达量显著高于对照组,IL-10和TGF-β仅有微弱的表达。上述结果表明,抗母牛分枝杆菌感染免疫反应主要以Th1免疫反应为主。本研究为母牛分枝杆菌免疫机制研究提供实验依据。     

抗牛γ-干扰素特异性单克隆抗体的制备

为了制备抗牛γ-干扰素(IFN-γ)的单克隆抗体(McAb),并对其部分生物学特性进行初步研究,试验用重组牛IFN-γ蛋白免疫小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术和间接ELISA方法进行试验.结果表明:共获得5株抗IFN-γ的单克隆抗体,Ig亚类鉴定均为IgGI,轻链为k链;经Weatern-blot试验证实5株McAb均能与IFN-γ发生特异性反应,而与其他蛋白不发生反应,特异性好;以5株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株制备腹水,效价均达到1:50 000以上.     

牛γ干扰素基因的原核表达及其单克隆抗体的研制

为了制备高质量高效价抗牛γ干扰素(Bo IFN-γ)的单克隆抗体,本研究将Bo IFN-γ基因克隆到His标签的大肠杆菌表达载体p ET32a+中,诱导表达并纯化蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体。结果筛选到9株单抗,分别命名为Bo IFN-γ-1E10、Bo IFN-γ-3C2、Bo IFN-γ-3E1、Bo IFN-γ-6C6、Bo IFN-γ-6H9、Bo IFN-γ-6B6、Bo IFN-γ-6E5、Bo IFN-γ-2A10和Bo IFN-γ-2G10。ELISA、Western blot和间接免疫荧光试验结果显示,制备的单克隆抗体与原核、真核表达的Bo IFN-γ都具有良好的反应性。本研究制备获得的针对牛γ干扰素的单克隆抗体为建立检测天然Bo IFN-γ的方法提供了重要的生物材料。     

水貂阿留申病毒诱导猫肾细胞(CrFK)凋亡

为研究水貂阿留申病毒(AMDV)在体外诱导猫肾细胞(CrFK)凋亡情况,用AMDV-G株感染CrFK细胞,采用CCK-8法检测CrFK细胞感染后的细胞存活率,用AO/EB染色法检测CrFK细胞核的形态变化,用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率,并通过分光光度计法检测细胞凋亡执行分子Caspase-3活性。结果显示,AMDV-G株感染可导致CrFK细胞增殖率下降,产生明显的形态学凋亡特征;流式细胞术检测结果显示,AMDV-G株感染可引起CrFK细胞凋亡并随着感染时间的延长凋亡率增加,同时Caspase-3活性显著升高。上述结果表明,AMDV-G株在体外能够诱导CrFK细胞凋亡,为进一步研究AMDV致病机理奠定基础。     

人源H7N9流感病毒促进Ⅰ型干扰素产生机制的研究

为阐明不同来源H7N9流感病毒诱导Ⅰ型干扰素(IFN-Ⅰ)产生水平差异及其机制,本研究选取人源流感病毒A/Anhui/1/2013(AH/1)株和禽源流感病毒A/Pigeon/Shanghai/S1421/2013(PG/S1421)株作为模式病毒株,利用C57BL/6小鼠进行致病性试验。结果显示,AH/1株感染可以致小鼠发病死亡,而PG/S1421株则不会致小鼠发病。采用间接免疫荧光试验和流式细胞试验分别对两株病毒在A549细胞和小鼠腹腔巨噬细胞中的感染效率进行检测,结果显示两株病毒在两种细胞中的感染效率无显著差异。将该两株病毒分别感染小鼠腹腔巨噬细胞,在感染后不同时间点收集培养上清,并裂解细胞收取细胞总蛋白。采用ELISA方法对细胞培养上清IFN-Ⅰ含量进行测定。结果显示,感染后不同时间,AH/1株和PG/S1421株均可以诱导IFN-Ⅰ产生,但相较于PG/S1421株,AH/1株感染可以诱导细胞产生更多的IFN-Ⅰ;利用western blot对细胞总蛋白中IFN-Ⅰ产生信号通路的上游感受器分子视黄酸诱导基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)的表达水平进行检测。结果显示,在PG/S1421株感染细胞的12 h内,胞内RIG-Ⅰ分子的表达量无显著变化,而AH/1株感染后,胞内RIG-Ⅰ分子的表达量增加,并且表达量随时间延长而上升。以上试验结果表明,AH/1株感染可以通过上调RIG-Ⅰ表达进而诱导宿主细胞产生更多IFN-Ⅰ。本研究阐明了人源H7N9流感病毒促进IFN-Ⅰ产生的初步机制,为进一步解析人源H7N9流感病毒促进IFN-Ⅰ产生的精细分子机制以及免疫逃逸机制奠定了基础,为H7N9流感防控提供参考依据。     

鸡传染性法氏囊病病毒BJQBJQ902株在悬浮培养DF-DF-1细胞上的增殖特性研究

为探讨鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)BJ902株感染复数(Multiplicity of infection,MOI)、接种时间和维持液三种因素对在悬浮培养DF-1细胞上的病毒滴度影响,分别以不同MOI的IBDV BJQ902株感染悬浮培养24 h的DF-1细胞,以0.005 MOI的IBDV BJQ902株感染悬浮培养不同时间的DF-1细胞,然后以含2%胎牛血清(FBS)的高糖DMEM(HG-DMEM)作为维持液进行培养,观察感染后不同时间的细胞病变、收获感染不同时间的病毒液。以0.005 MOI感染悬浮培养24 h的DF-1细胞,然后使用含2%FBS的不同维持液(MEM、HG-DMEM、LG-DMEM)进行病毒增殖,收获不同时间的病毒液,测定病毒液的TCID_(50)。结果显示,以0.005 MOI的IBDV BJQ902种毒接种悬浮培养24 h的DF-1细胞,维持液为2%FBS的HG-DMEM进行病毒增殖,病毒接种后24~36 h收获的病毒毒价可达10~(8.3) TCID_(50)/0.1 m L以上。表明IBDV BJQ902株可以在微载体悬浮培养的DF-1细胞上高密度增殖。     

不同毒力马耳他种布鲁氏菌体内外诱导细胞凋亡的研究

为探究不同毒力马耳他种布鲁氏菌能否在体内外诱导凋亡以及诱导凋亡程度的差异,本研究将M28(强毒株)和M5-90(疫苗株)以MOI=100感染小鼠巨噬细胞系RAW264.7,利用激光共聚焦显微镜观察和流式细胞术检测凋亡产物caspase3/7。结果显示:M5-90和M28在体外细胞水平均能够诱导RAW264.7细胞凋亡,且M5-90促进细胞凋亡能力高于M28。然后将M28和M5-90以1×10~6 cfu的剂量接种BALB/c小鼠,分别在接种后3 d、7 d和42 d迫杀小鼠,取小鼠脾脏组织制备切片,经HE染色后进行形态学观察,利用透射电镜观察并通过Tunel法检测细胞凋亡。结果显示M5-90和M28感染后均可诱导小鼠脾脏细胞凋亡,凋亡细胞主要为T淋巴细胞。本研究为布鲁氏菌诱导宿主细胞凋亡和布鲁氏菌致病机理研究奠定了基础。     

基于结核菌素与CFP10／ESAT6的牛IFN-γ检测法在牛结核病诊断中的比较研究

本研究通过比较三种刺激物（牛结核菌素、禽结核菌素和牛型结核菌特异性抗原CFP10／ESAT6对结核菌素皮内变态反应阳性牛的IFN-γ刺激反应,探讨IFN-γ检测法在我国牛结核病诊断中的应用前景。无菌采集22头结核菌素皮内变态反应阳性牛的血液．肝素抗凝。每1mL全血与1mL RPMI1640完全培养基混合均匀,并加入0.1mL（20μg）PHA（阳性对照孔）、0．1mL（20μg PHA）CFP10／ESAT6融合蛋白、0．1mL（2000U）＆结核菌素（PPD／B）、0．1mL（2500u）禽结核菌素（PPD／A）或等量PBS（无刺激阴性对照）,37℃培养过夜。次日用夹心ELISA法检测各刺激组0．1mL培养上清的IFN-γ,以OD630表示IFN-γ浓度。结果,特异性抗原CFP10／ESAT6刺激组与牛结核菌素（PPD／B）刺激组的IFN-γ反应具有良好的相关性．相关系数为0．84。但CFP10／ESAT6刺激组IFN-γ浓度与牛和禽PPD的比较反应（以两刺激组IFN-γ浓度差值表示）间无相关性,相关系数为-0．11。分析禽PPD组的IFN-γ反应,发现实验牛中有少数牛对禽PPD有反应。以OD630=0．17为阳性反应切割值,牛PPD检出阳性牛21头,CFP10／ESAT6检出20头,牛和禽PPD比较反应（以OD值差值表示）检出14头,禽PPD阳性反应3头。扣除禽PPD阳性反应牛后,牛和禽PPD比较反应与牛PPD刺激组的相关系数增至0．54。结果表明,牛PPD的IFN-γ释放反应检测灵敏度最高。当出现牛型结核菌与环境分枝杆菌混合感染时．应用牛和禽PPD比较反应检测牛结核的准确度低,混合感染牛被误判为结核阴性牛。而基于CFP10／ESAT6的IFN-γ释放反应不受环境分枝杆菌的影响,检测具有良好的特异性与敏感性。