猪去核无透明带卵母细胞电融合参数的探讨

试验通过采用不同场强、电场时程和脉冲次数对去核的猪体外成熟卵母细胞电融合参数进行比较研究,观察细胞融合情况。结果表明,在电场时程30 μs、1次直流脉冲（DC）的情况下,电场强度0.8 kV/cm 时卵母细胞的融合率为94.7%,显著高于其他各组（P<0.05）;当电场强度为0.8 kV/cm、1次直流脉冲的情况下,电场时程60和90 μs时,卵母细胞融合率为86.5%和83.8%,差异不显著（P>0.05）,但显著低于30 μs时的电融合效率（P<0.05）;在电场强度为0.8 kV/cm,电场时程为30 μs的情况下,1次电脉冲激活卵母细胞的融合率（94.7%）和2次电脉冲的融合率（95.6%）无显著差异（P>0.05）,但两者显著高于3次电脉冲的融合率（81.7%）（P<0.05）。通过对各组进行比较,在电场强度为0.8 kV/cm、电场时程为30 μs、1次直流脉冲的电刺激可以对体外成熟的猪卵母细胞取得较好的融合效果。     

小鼠卵母细胞透明带的切割

透明带的切割是哺乳动物早期胚胎显微操作技术中的一个重要环节，本文以小鼠为例介绍一种新的透明带切割方法。     

不同培养时间对猪卵母细胞透明带蛋白泛素化及其体外授精的影响

通过热溶解-溶解透明带蛋白、SDS-PAGE检测蛋白和Western blot分析透明带蛋白泛素化水平,探讨不同培养时间(34 h、46 h、58 h)对猪卵母细胞透明带蛋白泛素化表达量的影响。结果表明:培养46 h组猪卵母细胞成熟率显著高于34 h组和58 h组,死亡率显著低于34 h组和58 h组;体外授精过程中,培养46 h组猪卵母细胞的卵裂率、4-细胞、囊胚率均显著高于34 h和58 h组,而34 h和58 h组没有显著性差异;培养46 h组猪卵母细胞透明带蛋白泛素化水平显著高于34 h和58 h组,而34 h和58 h组没有显著性差异。结果提示,不同培养时间对猪卵母细胞透明带蛋白泛素化和体外授精有显著影响。     

不同方法提取猪和牛卵母细胞和早期胚胎 total RNA的比较

研究以猪和牛GV期的卵母细胞和8细胞期胚胎作为研究对象,分别用QIAGEN RNeasy Micro Kit、无根RNAPrep Micro kit和华舜快速RNA(微量)提取试剂盒提取其中的total RNA,通过对total RNA的浓度和纯度的分析比较,找出较适宜的提取方法.结果显示,QIAGEN RNeasy Micro Kit 能更有效地从少量猪和牛卵母细胞和早期胚胎中提取高质量的total RNA.     

靓精对猪精子、卵母细胞和胚胎的影响

靓精是一个消毒剂的新产品,可用于精液常温保存过程的微生物污染的预防。为了确认靓精对精子、卵子以及早期胚胎的影响,本实验利用病原抑制实验筛选出的三个靓精浓度,0.5%(v/v)、0.75%和1%,并分别添加至精液稀释液、卵母细胞成熟培养液、胚胎的培养液中,观察靓精对猪卵母细胞的成熟、胚胎发育、精子活力以及受精能力等的影响。结果表明,三个处理浓度的靓精对卵母细胞的成熟质量、体外发育能力,精子的运动和受精能力均无显著影响。因此,靓精作为广谱消毒剂,可以在猪精液常温保存过程中添加,以改善精液保存品质。     

PTEN基因在猪卵母细胞、早期胚胎和各主要脏器的表达情况

PTEN基因在哺乳动物早期胚胎发育中起重要作用,但PTEN基因在猪的卵母细胞、早期胚胎和各主要脏器的表达情况还未见报道。本研究以猪为研究对象,利用非同位素银染DNA测序和荧光定量PCR等技术,对PTEN基因在猪卵母细胞、猪体外受精胚胎和仔猪各主要脏器的表达水平进行了研究。结果表明:PTEN基因在猪GV期卵母细胞、MII期卵母细胞和早期胚胎发育中持续表达,在桑椹胚期高表达,说明PTEN基因在胚胎发育过程中尤其在胚胎致密化时期发挥重要作用;PTEN基因在仔猪各主要脏器均有表达,在肺脏高表达,说明PTEN基因对仔猪主要脏器发育尤其是对仔猪肺脏的发育发挥重要作用。试验结果为今后PTEN基因在猪卵母细胞、早期胚胎和仔猪各主要脏器的研究奠定了基础。     

去脂对猪卵母细胞和胚胎玻璃化冷冻的影响

卵母细胞和胚胎冷冻保存技术在动物种质资源保存、濒危动物保护等方面具有独特的作用。本文综述了猪卵母细胞和胚胎的玻璃化冷冻及去脂技术,以期为后续研究提供参考,提高冷冻成功率。     

猪体外成熟卵母细胞孤雌激活和胚胎培养的研究

以猪体外成熟卵母细胞为实验材料,研究了不同激活方法、激活时间以及是否添加滋养层细胞的条件对猪成熟卵母细胞体外培养的影响。结果表明,Ionomycin+6-DAMP+CB法卵裂率高,且差异显著;使用6-DMAP激活3h的卵裂率要低于4h和5h组,且差异显著;在卵裂率、8细胞率和囊胚率上,添加滋养层细胞组与未添加滋养层细胞组之间无显著差异,但添加vero细胞后效果略好。     

水牛卵母细胞和体外受精早期胚胎端粒酶活性测定

为了解水牛卵母细胞和体外受精（IVF）胚胎早期发育过程中端粒酶的活性变化,本研究利用端粒重复序列扩增法（TRAP）进行了水牛未成熟卵母细胞,成熟卵母细胞和2～4细胞,8～16细胞,桑椹胚以及囊胚各阶段的早期胚胎端粒酶活性的测定。依据电泳条带在成像系统下的光密度值,计算端粒酶的相对活性（RTA）。结果发现,未成熟卵母细胞端粒酶活性比成熟卵母细胞高（P〈0.05）,受精后2～4和8～16细胞胚胎端粒酶活性相对较低,桑椹胚端粒酶活性明显升高（P〈0.05）,囊胚阶段达到最高水平。通过对水牛不同发育阶段胚胎细胞数计数及单细胞相对端粒酶活性的分析比较结果显示,卵母细胞的单细胞端粒酶活性最高,囊胚阶段的最低。单细胞端粒酶活性从未成熟卵母细胞到IVF囊胚阶段呈逐渐降低的趋势。这些结果表明,水牛卵母细胞及早期胚胎的端粒酶活性变化与其成熟、发育阻断及全能性的逐步降低有关。     

抑制UCHL1对猪卵母细胞体外成熟、透明带泛素化及多精入卵的影响

试验旨在研究抑制泛素羧基末端水解酶-1（UCHL1）对猪卵母细胞体外成熟、透明带泛素化及多精入卵的影响。利用DAPI染色、Hoechst染色及SDS-PAGE等方法检测猪卵母细胞体外成熟率、透明带泛素化水平及多精入卵等情况。结果表明,添加不同浓度UCHL1抑制剂（10、20、25、30 μmol/L,二甲基亚砜（DMSO）及对照组）体外培养猪卵母细胞46 h后,对照组成熟率为86.22%,而30 μmol/L UCHL1抑制剂组的成熟率为15.30%,且各处理组间成熟率差异显著（P<0.05）;经Western blotting检测,各处理组的透明带在约61、80、106 ku处均发生不同程度的泛素标记,通过灰度值分析差异显著（P<0.05）;进行体外受精试验后,发现对照组透明带精子黏附数最多,精子入卵数较少,添加30 μmol/L UCHL1抑制剂组的透明带精子黏附数最少,几乎没有精子入卵。结果显示,UCHL1抑制剂对猪卵母细胞的体外成熟有一定影响,随着UCHL1抑制剂浓度的增加,透明带发生泛素化的程度逐渐降低,且UCHL1可调节透明带精子黏附及多精入卵。     

猪卵母细胞冷冻保存技术优化研究进展

目前获得冷冻猪卵母细胞的存活后代仍是一个世界性的难题。实现冷冻猪卵母细胞技术在猪种质资源收集保存和体外胚胎生产中的应用,还需对影响其冷冻保存效率的因素进行优化。本文介绍了猪卵母细胞不同发育阶段特性、冷冻方法、冷冻保护剂等影响冷冻效率的主要因素,综述了降低冷源温度、去脂或降脂处理、稳定细胞骨架、软化透明带、诱导抗性、抗氧化与抗凋亡等技术优化的研究进展,为提高猪卵母细胞冷冻效率及后续解决相关瓶颈问题提供参考。     

有无透明带牛卵母细胞孤雌发育研究

研究探讨了不同浓度的钙离子载体(A23187)结合6-二甲氨基嘌呤(DMAP)或丁内酯Ⅰ(BL-1)激活处理对有或无透明带牛卵母细胞孤雌发育的影响。结果表明：使用A23187浓度从0．625～10．000μmol／L配合2．0mmol／L DMAP孤雌激活牛具透明带卵均能获得良好的卵裂及早期胚胎发育效果；对于去透明带卵来说．使用0．625μmol／L浓度的A23187激活效果最佳。BL-1的激活效果则明显差于DMAP；当采用0．3%PVA取代激活液中的5%血清时，BL-1的激活效率显著提高。     

抑制泛素结合酶改变猪卵母细胞透明带泛素化状态及精-卵结合能力

本研究旨在探究猪卵母细胞体外成熟过程中添加泛素结合酶(E2)抑制剂对卵母细胞透明带蛋白泛素化水平及精-卵结合能力的影响。试验分为6组:对照组、DMSO组、5、10、15和20μmol·L^-1 NSC697923处理组。采用Western blot方法分析体外成熟培养液中添加不同浓度泛素结合酶抑制剂NSC697923对猪卵母细胞透明带泛素化水平表达的影响。通过Hoechst染色检测不同组别的精卵结合能力。结果表明:1)猪卵母细胞体外成熟培养液中,添加10、15和20μmol·L^-1 NSC697923显著降低卵母细胞成熟率(P<0.05),透明带硬化时间(P<0.05)以及精卵结合率(P<0.05)。2)对照组和各处理组的透明带蛋白在61、81、106 ku处发生不同程度的泛素化标记,而添加15和20μmol·L^-1 NSC697923显著地降低透明带蛋白泛素化水平(P<0.05)。综上表明,猪卵母细胞体外成熟过程中泛素结合酶(E2)改变成熟卵母细胞透明带泛素化水平以及精卵结合能力。     

玻璃化冷冻对小鼠卵母细胞透明带的影响

本文旨在通过研究玻璃化冷冻小鼠卵母细胞透明带超微结构、透明带厚度(ZPT)、厚度变量(ZPTV)及双折射分值(ZPB)的影响,分析三者间的相关性,探求玻璃化冷冻液的最佳配方。选用4组应用最广泛的冷冻液配方对小鼠卵母细胞进行处理,与未处理的卵母细胞比较存活率、受精率、卵裂率和囊胚率,选出最适冷冻液配方。以新鲜卵母细胞为对照组,进行冷冻程序但并没有进行实际冷冻的卵母细胞为处理组,进行玻璃化冷冻复苏的卵母细胞为冷冻组,扫描电镜观察各组的透明带超微结构变化;检测3组细胞的ZPT和ZPB,并对ZPT和ZPB、ZPTV和ZPB之间相关性进行分析。结果发现HM+7.5%(DMSO+EG),HM+15%(DMSO+EG)+0.5 mol/L Su冷冻液组对卵母细胞发育潜力影响较小。玻璃化冷冻对ZPT(6.05±0.10μm vs 5.77±0.60μm)和ZPB(0.30±0.38 vs 1.22±0.21)有显著影响(P<0.05),且ZPT与ZPB呈负相关(r=-0.299)(P<0.05)。扫描电镜发现玻璃化冷冻造成卵母细胞透明带呈熔融状,表面凹凸不平,窗孔基本不可见,甚至出现透明带部分脱落的情况;冷冻组透明带超微结构的正常率较对照组和处理组下降,其中粗ZP(44.9%对92.9%和84.8%)(P<0.01)和光滑ZP(31.0%对7.4%和9.1%)(P<0.01)。结果表明,玻璃化冷冻影响卵母细胞的发育潜能,低温对透明带的超微结构有较大的负面影响。     

表皮生长因子对无透明带小鼠胚胎体外发育的影响

为了观察不同浓度的表皮生长因子对无透明带小鼠胚胎体外发育的影响,试验将小鼠原核期胚胎用链霉蛋白酶去除透明带后,分别置于含有不同浓度的表皮生长因子无血清胚胎体外培养液中培养,观察各期胚胎的发育情况.结果表明:除0.01 ng/mL表皮生长因子添加组胚胎的2细胞发育率和囊胚回收率与添加0.1 ng/mL表皮生长因子处理组差异不显著外(P>0.05),其体外胚胎各期的发育率、囊胚回收率和囊胚细胞数与其他处理组比较均差异显著(P<0.05).说明一定浓度的表皮生长因子可以提高无透明带小鼠胚胎体外培养各期的发育率,但是高浓度的表皮生长因子对无透明带小鼠胚胎的体外发育有一定的抑制作用.     

水牛卵母细胞体外受精及其早期胚胎性别鉴定

从屠宰场收集了本地水牛卵巢380个，平均每个卵巢回收3．29枚可用卵母细胞。分别采用添加5％、10％自制发情牛血清和国产胎牛血清培养液体外成熟培养水牛卵母细胞，结果表明，发情牛血清影响牛卵母细胞体外成热的效果与胎牛血清的效果无显著差异（48．89％vs51.11％，52．22％Vs50．00％），2种浓度间亦无显著差异。在胚胎培养液中添加10％的发情牛血清，比添加5％发情牛血清的卵裂率和胚胎发育率显著升高（34．85％Vs23．58％，39．13％Vs31.48％），差异显著。通过自主设计的两对引物扩增公水牛特有的Sry基因以及公母水牛共有的水牛1．715卫星DNA序列，采用连续多重PCR方法，能够有效地对水牛早期胚胎进行性别鉴定。     

水牛卵母细胞体外受精及其早期胚胎性别鉴定

从屠宰场收集了本地水牛卵巢380个,平均每个卵巢回收3.29枚可用卵母细胞。分别采用添加5%、10%自制发情牛血清和国产胎牛血清培养液体外成熟培养水牛卵母细胞,结果表明,发情牛血清影响牛卵母细胞体外成熟的效果与胎牛血清的效果无显著差异(48.89%Vs51.11,52.22 Vs50.00),2种浓度间亦无显著差异。在胚胎培养液中分别添加10%的发情牛血清,比添加5%发情牛血清更使卵裂率和胚胎发育率显著升高(34.85 Vs23.58,39.13 Vs31.48),差异显著。通过自主设计的两对引物扩增公水牛特有的Sry基因以及公母水牛共有的水牛1.715卫星DNA序列,采用连续多重PCR方法,能够有效的对水牛早期胚胎进行性别鉴定。     

猪卵母细胞体外成熟体系研究简述

随着胚胎生物技术的日臻完善并逐步应用于家畜的育种和繁殖领域,人们对动物胚胎工程的认识逐渐加深,一系列更深层次的胚胎生物技术越来越受到人们的重视。20世纪80年代以来,人们在家畜卵母细胞体外培养、体外受精、     

LDL对玻璃化冷冻解冻培养MⅡ期猪卵母细胞线粒体膜电位和透明带泛素化水平的影响

本试验旨在探究添加低密度脂蛋白（low density lipoprotein,LDL）对玻璃化冷冻解冻后MⅡ期猪卵母细胞发育率、线粒体膜电位及透明带泛素化水平的影响。采用线粒体膜电位特异性探针JC-1检测各处理组线粒体膜电位,并采用SDS-PAGE及Western blotting方法分析不同处理组MⅡ期猪卵母细胞透明带蛋白泛素化水平。结果显示,玻璃化冷冻法处理中,10 mg/mL LDL处理组MⅡ期卵母细胞正常率和成熟率（71.92%和69.86%）显著高于对照组（58.26%和54.55%）（P<0.05）,最接近未冷冻组。10 mg/mL LDL处理组MⅡ期卵母细胞线粒体膜电位显著高于对照组、1和20 mg/mL LDL组（P<0.05）。免疫印迹结果显示,未冷冻组和LDL处理组MⅡ期卵母细胞ZP1、ZP2及ZP3蛋白分别在61、80、106 ku发生不同程度的泛素化标记;10 mg/mL LDL处理组ZPs（ZP1、ZP2、ZP3）蛋白泛素化水平显著高于1和20 mg/mL LDL组（P<0.05）,但显著低于非冷冻组（P<0.05）。结果表明LDL可改善玻璃化冷冻解冻培养后MⅡ期猪卵母细胞成熟率、线粒体膜电位及透明带泛素化水平。     

母源基因在猪卵母细胞成熟及胚胎发育中的作用

卵母细胞成熟和胚胎的早期发育是由多因素调控的复杂的生物过程,母源基因及合子基因的表达变化控制着个体的发生,决定着所有生命的进程。母源基因是指受精前卵子发育时母体细胞转录生成的RNA以及其蛋白产物,定位于成熟的卵母细胞胞质中,母源基因在卵母细胞成熟和胚胎的早期发育过程中起着相当重要的作用。对母源基因的研究将为我们解释胚胎发育过程中的生命现象及解决生殖发育方面的问题提供有力的理论依据。目前关于母源基因的研究多集中于传统的模式生物中,而对畜牧业生产中重要的经济动物却涉及很少。本文以母源基因在猪卵母细胞成熟和胚胎发育中的研究现状作一综述,希望为经济动物的繁殖及发育研究提供一定的参考依据。