细粒棘球蚴细胞系13G—5培育

从１８例棘球蚴病人的包囊分离棘球蚴细胞,经３６批次体外培养获得１株细粒棘球蚴细胞系（１３Ｇ－５细胞系）,已培养１４０ｄ,传２１代,并继续扩大增殖培养。测定了该细胞系第１３代细胞生长曲线和集落形成率（４％）。１３Ｇ－５细胞系５代以前为多形性细胞,后逐渐以成纤维型细胞占优势。探讨了棘球蚴细胞培养的制约因素。     

转sMTPGH基因小鼠胚胎的体外培养

采用纯化的羊金属硫蛋白 (s MT)启动子指导的猪生长激素 (PGH )基因 (s MTPGH)为显微注射片段 ,将其导入小鼠受精卵原核 ,比较了几种不同培养液对导入外源基因的小鼠胚胎体外发育的影响。结果表明 ,改进的 M16培养液(用 m M16表示 )能有效克服 2 -细胞阻断现象 ,并使转基因胚胎发育到桑椹胚或囊胚阶段。在 m M16培养液的基础上 ,再加入表皮生长因子 (EGF) ,可使 1-细胞胚胎发育到囊胚的比率进一步提高。在 3种培养液 (M16、m M16、m M16 EGF)中 ,转基因胚胎突破 2 -细胞阻断期的比率分别为 12 %、6 8%、90 % ,发育到囊胚期的比率分别是 0 %、2 0 %、4 3%。采用 PCR方法检测 5 7枚经体外培养发育至囊胚的显微注射胚胎 ,4枚扩增出阳性条带 ,外源基因在囊胚期胚胎的滞留率为 7%。     

大鼠骨肉瘤模型的建立

为建立大鼠骨肉瘤动物模型的方法, 用30只6周龄SD大鼠随机分为3组,将大 鼠骨肉瘤细胞系UMR 106分别以105,106, 107个数量注入大鼠股外侧皮下。接种后,每 周观察肿瘤生长情况,测量肿瘤直径,绘制肿 瘤生长曲线,连续5周。第6周取肿瘤病理 材料,常规切片,HE染色,光镜下观察。结果 105个细胞及106个细胞组肿瘤生长情况不 佳;107个细胞组肿瘤发生率达到100%。说 明大鼠骨肉瘤细胞系UMR 106具有较强的 致瘤性,应用该细胞系建立的动物模型为骨 肉瘤综合治疗奠定了动物实验基础。     

表达猪瘟病毒E0-E2基因重组腺病毒疫苗 在小鼠体内的存留时间分析

研究E0-E2基因和表达蛋白及抗体水平在小鼠体内的最长存留时间,以确定表达猪瘟病毒E0-E2基因重组腺病毒疫苗(rAd-E0-E2)在小鼠体内的存留规律。本试验选用30只SPF级别的健康小鼠,随机分为A、B组,各免疫组以1×106 IFU/只剂量接种rAd-E0-E2,对照组注射生理盐水。A组20只于接种后不同特定时间(2只/次)采集血液和组织进行PCR和IFA检测E0-E2基因及表达蛋白残留情况;B组10只于接种后1、3、5、7、10、14、21、28d采集血清检测猪瘟抗体水平。PCR和IFA检测显示,在接种12、24、36h后肝、脾、肾组织和血清中E0-E2基因和蛋白检出率为100%,接种48h后小鼠肝、脾组织检出率为50%,肾组织和血清检出率为100%。接种72h以后,小鼠血液和组织检测均为阴性。接种后7d试验组体内抗体阳性率为40%,接种后10d小鼠体内抗体阳性率为100%,抗体阻断率在43%～51.2%,接种后28d,猪瘟抗体阳性率为100%,抗体阻断率在75.6%～87.5%。表明rAd-E0-E2在小鼠体内的存留时间最长72h,接种时间与E2抗体水平呈正相关。     

猪瘟病毒E0和E2蛋白融合表达的重组腺病毒构建及免疫保护性研究

为评价重组腺病毒融合表达猪瘟病毒(CSFV)E0和E2蛋白的免疫保护效果,本研究以CSFV基因组为模板,应用RT-PCR扩增E0和E2蛋白的编码基因,通过pET-32a载体将E0和E2基因串联,形成pET-E0-E2重组质粒。用KpnⅠ和NotⅠ双酶切pET-E0-E2得到E0-E2融合基因,定向亚克隆于穿梭载体pAdTrack-CMV中,采用"两步转化法"在细菌内同源重组,构建携带E0-E2基因的重组腺病毒转移载体质粒pAdEasy-E0-E2,经PacⅠ酶切线性化后转染人胚胎肾细胞(HEK293),成功包装出重组腺病毒(rAd-E0-E2),PCR和western blot检测表明,E0-E2基因已重组于腺病毒基因组中并获得表达。将rAd-E0-E2接种于小鼠和猪,并通过ELISA进行抗体检测。另外,将rAd-E0-E2经肌肉2次(间隔7d)免疫接种6周龄～7周龄猪,3周后用103TCID50CSFV石门株攻毒。结果表明,rAd-E0-E2免疫组6/7头存活,各组织器官带毒时间不超过10d,而非重组腺病毒rAd-CMV免疫组和空白对照组全部死亡,各组织器官均能分离到CSFV。结果提示,rAd-E0-E2能使免疫猪抵抗CSFV强毒攻击,为进一步研制猪瘟基因工程疫苗提供了实验依据。     

小鼠体外受精及胚胎发育的影响因素

为了完善小鼠体外受精和胚胎的体外培养系统 ,以 M16为基础培养液 ,探讨了葡萄糖、磷酸盐、EDTA、谷氨酰胺及β-巯基乙醇等对小鼠体外受精和胚胎体外培养的影响。结果表明 ,在 M16液中添加 EDTA和 L -谷氨酰胺(m M16液 ) ,小鼠的体外受精率由 2 6 %提高到 5 1%;当在 m M16液中去掉磷酸盐 ,或添加 Hepes,或添加 β-巯基乙醇 ,体外受精率由 5 1%增至 6 2 %～ 74%;m M16液中添加 Hepes,或去掉磷酸盐 ,可阻碍胚胎的体外发育 ,囊胚的扩张率由 80 %降至 49%和 5 8%,而在无糖 m M16液中添加 β-巯基乙醇 ,可显著地提高扩张囊胚率 (91%)。以上结果表明 ,M16液中添加 EDTA、谷氨酰胺和 β-巯基乙醇后 ,适用于小鼠体外受精 ;同时去掉葡萄糖后 ,则适用于 2细胞胚的体外培养。     

鸭坦布苏病毒E蛋白中和性单克隆杭体的制备

本试验利用纯化的鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus , DTMUV)奉贤株(FX2010)免疫BALB/c小鼠,通过淋巴细胞杂交瘤技术,筛选获得3株能够稳定分泌杭DTMUV的杂交瘤细胞,分别命名为:J1-E5-E4, 7B5和1E5-B6,3株杂交瘤细胞诱导同品系刁、鼠的杭体效价为1:12 800,1:6 400和1:25 600。间接ELISA和IFA结果显示,3株单杭均可以与DTMUV发生特异性反应。进一步研究发现,J1-E5-E4可以与DTMUV-E蛋白结合,使得表达E蛋白的293T细胞显现出特异性的绿色荧光;在病毒中和试验中,J1-E5-E4可以中和DTMUV,使其失去致死鸡胚的能力。这些结果表明,J1-E5-E4是一株针对DTMUV-E蛋白中和表位的单杭,该单杭将在DTMUV诊断和杭原分析中发挥重要作用。     

兔胎儿成纤维细胞的分离培养和鉴定

本研究旨在建立稳定传代的兔胎儿成纤维细胞系及其鉴定方法。取配种后14~15d的兔胎儿,0.25%胰酶消化胎儿皮肤获得兔胎儿成纤维细胞,体外传代培养;通过观察细胞形态、测定生长曲线、免疫荧光染色、核型分析等鉴定兔胎儿成纤维细胞,PCR扩增SRY基因鉴定2株细胞系性别。研究结果表明,兔胎儿成纤维细胞呈梭形,可在体外快速生长,符合"潜伏期-对数期-平台期"的生长规律;免疫荧光染色结果显示,波形蛋白与纤维连接蛋白染色为阳性,细胞角蛋白染色为阴性,表明兔胎儿成纤维细胞纯度高,活性好;染色体检测结果显示,在传至第5代时,80%的成纤维细胞核型正常,为2n=44,属正常范畴;PCR法检测的2株细胞系均来源于兔雄性胎儿。综上表明,本研究建立了兔胎儿成纤维细胞系体外培养、传代、鉴定及其性别鉴定方法,可为转基因兔、克隆兔、兔诱导性多能性干细胞等研究提供充足、可靠的成纤维细胞来源。     

蒙古绵羊输卵管上皮细胞培养体系的建立

为了建立蒙古绵羊输卵管上皮细胞培养体系作为良好的体外研究模型,本试验取蒙古绵羊输卵管,运用0.25%胰蛋白酶消化的方法分离上皮细胞进行体外培养.对培养细胞进行形态学、免疫组织化学方法鉴定.原代培养细胞用胰蛋白酶/EDTA方法成功传代,传三代后检测其染色体核型.结果显示,成功获得了原代和传代培养细胞,经鉴定为上皮细胞,传三代后经染色体核型分析显示细胞核型正常,培养的细胞健康状况良好,可以用做体外研究模型.     

鸡胚盲肠上皮细胞的传代培养

本研究旨在探讨鸡胚盲肠上皮细胞传代培养条件及其特性,为E.tenella损伤机制及抗球虫药的研究提供体外模型。分别用胰酶-EDTA联合消化和分步消化2种方法分离纯化原代鸡胚盲肠上皮细胞,通过测定贴壁细胞覆盖率选择细胞传代的适宜消化方式;筛选了传代细胞培养液中L-GLN和胰岛素的最佳浓度,通过贴壁差进一步纯化盲肠上皮细胞,探索其合适的培养条件。通过形态学观察、透射电镜、免疫组织化学技术、组织化学技术、糖原染色、流式细胞术的方法对传代细胞特性进行了鉴定。结果表明:胰酶-EDTA联合消化、15min贴壁差纯化除去成纤维细胞,72.5mg.L-1 L-GLN、0.05mg.L-1胰岛素和5%FBS的传代细胞培养液更有利于盲肠上皮细胞的生长;经形态学和透射电镜观察,AKP、Vimentin及PAS染色,所培养的传代细胞具有典型的上皮细胞特征,在传代后24～72h盲肠上皮细胞纯度达95%以上,贴壁细胞覆盖率达85%以上;细胞凋亡测定表明,细胞连传5代,活性较好,第6代细胞凋亡率显著增加,贴壁细胞覆盖率降低。本研究提示用该法传代可获得稳定、数量大、活性高、纯度高的鸡胚盲肠上皮细胞。     

辽宁绒山羊胎儿成纤维细胞系的建立

为了成功建立绒山羊胎儿成纤维细胞系,利用核移植法获取转基因绒山羊,试验采用组织块贴壁法和细胞冷冻技术,并根据上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同,采用酶消化法纯化细胞获得成纤维细胞系S1和S2,并对该细胞进行性别鉴定、生长曲线测定与核型分析。结果表明:该供体细胞S1为雌性,S2为雄性,其生长旺盛,状态良好,核型正常,有30对染色体。说明试验成功建立了辽宁绒山羊胎儿成纤维细胞的体外培养体系,可用于通过核移植法获取高产绒量的转基因绒山羊。     

牛病毒性腹泻/粘膜病病毒核酸疫苗的构建及其免疫效果研究

为提高牛病毒性腹泻/粘膜病(BVD/MD)核酸疫苗的免疫效力,本实验应用PCR方法扩增BVD病毒(BVDV) E0基因,构建真核表达质粒pVAX1-E0,转染293T细胞,经RT-PCR和western blot分析显示,转染细胞能够瞬时表达E0蛋白.并分别将pVAX1、pVAX1-E0或将pVAX1-E0分别与一种表达细胞因子基因的重组质粒作为佐剂(pVAX1-IL-2、pVAX1-IL-4及pVAX1-IFN-γ)免疫小鼠,采用间接ELISA法检测免疫小鼠BVDV抗体效价,以MTT法检测免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖活性.实验结果表明,与pVAX1-E0相比,接种pVAX1-E0/pVAX1-IL-2小鼠血清E0抗体水平及淋巴细胞增殖水平显著提高(p＜0.01),表明细胞因子基因佐剂IL-2能够有效提高BVDV E0核酸疫苗免疫效果,可以刺激小鼠产生良好的免疫应答.     

构建稳定表达JSRV受体Hyal-2小鼠肺上皮细胞系

为了构建稳定表达绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)受体透明质酸酶-2(Hyal-2)蛋白的小鼠肺上皮细胞系,试验采用将重组质粒p DsRed-monomer-N1-Hyal-2转染小鼠肺上皮细胞后,用G418对转染后的细胞进行筛选、纯化,通过对不同培养代次的细胞系进行倒置荧光显微镜观察、RT-PCR、基因测序、Western-blot等方法加以验证。结果表明:试验成功构建了JSRV受体Hyal-2蛋白小鼠肺上皮细胞系,在传至20代后Hyal-2仍在该细胞系中稳定表达。说明该细胞系的成功建立,为研究绵羊Hyal-2对JSRV转化目的细胞能力的影响提供了一种体外试验平台。     

FGF20及其受体FGFR2和FGFR3在小鼠毛囊形成期的定位及表达

旨在研究成纤维细胞生长因子(FGF20)及受体FGFR2和FGFR3在小鼠胚胎期毛囊形成期的表达情况,了解FGF20及受体FGFR2和FG-FR3在小鼠毛囊形成期的作用。采用实时荧光定量PCR、Western blot和免疫组织化学技术检测胚胎期13 d (E13)至18 d (E18)小鼠背部皮肤中FGF20、FGFR2和FGFR3 mRNA及蛋白的差异表达。免疫组化结果显示,FGF20蛋白和FGFR3蛋白E13在表层细胞微弱表达,E14主要表达在表层细胞,且在基底层细胞也有微弱表达,E15主要表达在基板和表层细胞,E16强表达在毛钉与表层细胞,E17和E18主要表达在表层细胞和未成熟的毛囊;FGFR2蛋白在表层细胞、基底层细胞、基板、毛钉、未成熟的毛囊等处均有表达,且E18强表达在表层细胞和未成熟毛囊;RT-PCR及Western blot数据分析结果显示:FGF20 mRNA及蛋白在E16相对表达量最高;FGFR2 mRNA及蛋白在E13相对表达量最低,E18相对表达量最高;FGFR3 mRNA及蛋白表达趋势和FGF20相似。研究结果提示,在毛囊形成期,FGF20可能通过与FGFR3结合从而参与毛囊的诱导和激活,促进毛囊形成并决定其生长方向。FGFR2可能在毛囊形成过程调控表层细胞增殖,促进毛囊形成,诱导毛囊进入第一生长周期。     

马源人乳头瘤病毒18型的鉴定及遗传进化分析

为了解新疆地区马携带病毒的多样性,本研究采集新疆昌吉市和伊宁市30匹纯血马,147匹本土马粪便、鼻拭子和血清样品,采用高通量测序检测马携带病毒多样性。结果显示马粪便携带人乳头瘤病毒18型(HPV18)。根据GenBank中HPV18参考株E6基因序列,设计特异性引物,对样品进行PCR检测。结果显示20%(6/30)纯血马粪便样品携带HPV18,与其同场饲养的本土马粪便样品HPV18阳性率为12.7%(7/55),非同场饲养的本土马粪便样品HPV18阴性(0/92),表明马源HPV18可能是由纯血马携带的病毒。此外,马鼻拭子和血清样品中未检测到HPV18,表明该病毒可能仅存在于马肠道中,这也是本研究首次在动物肠道中检测到HPV18。马源HPV18 E6基因核苷酸和氨基酸序列与国外HPV18 E6基因与氨基酸序列同源性为99.6%～100%、100%,与我国HPV18 E6基因与氨基酸序列同源性为94.6%～97.3%、91.8%～96.8%,与马乳头瘤病毒E6基因与氨基酸序列同源性为35.8%～40.1%、14.6%～24.6%。遗传进化分析显示马源HPV18与国外HPV18亲缘关系较近,而与马乳头瘤病毒处于不同分支,表明马源HPV18可能是由纯血马携带的外来病毒。本研究首次鉴定了马源HPV18并对其E6氨基酸进行遗传进化分析,为HPV18的流行病学研究提供了参考依据。     

CD44、VEGF、p53在犬乳腺肿瘤细胞系中的表达

为了研究犬乳腺肿瘤的转移机制,试验选用从自然发生乳腺肿瘤病例的原发病灶和转移病灶分离培养的4种细胞(CHMp、CHMm、CIPp、CIPm),经传代120代以上、生长性状稳定的细胞系作为研究对象,并对细胞系进行免疫组织化学分析。结果表明:不同细胞系中p53、CD44、VEGF 3种抗体均为阳性反应,但有不同的临床意义;VEGF在4种细胞系中表达无差异,说明在转移组和原发组乳腺肿瘤细胞中功能和作用机理类似;CD44在4种细胞系中的表达均有差异,说明其不能作为独立的预后指标,需要其他因素共同参与调节乳腺肿瘤的浸润和转移;p53在活性和增殖能力最弱的CIPm细胞中表达强度最弱,与组织中的表达结果相符合,说明p53作为动物预后指标是可靠的。     

适应无血清培养的HEK293细胞系的培育

为培育适合腺病毒增殖的无血清培养细胞系,本研究采用培养液渐进替换的方法获得了一株适应无血清培养的HEK293细胞(293SF),经检测293SF细胞具有稳定的支持腺病毒增殖与表达外源蛋白的能力;平均病变时间为97 h,比HEK293细胞缩短12.9%;毒价达到107.48TCID50/mL,比HEK293细胞提高43.3%;并且稳定性良好,连续传16代后293SF细胞状态与易感性未发生变化。该细胞系为腺病毒的无血清培养奠定基础。     

小鼠精原干细胞的形态结构及其细胞化学和免疫组化特性

应用光镜、电镜观察了 ７～８ ｄ 小鼠精原干细胞的形态结构特点;应用细胞化学、免疫组织化学方法研究了体外培养小鼠精原干细胞的细胞化学和免疫组织化学特性。结果显示,精原干细胞呈圆形,直径（９±１） μｍ ,核大,呈圆形或轻微卵圆形,胞质较少;核内常染色质占绝对优势,异染色质极少;胞质内核糖体、线粒体较丰富,其他细胞器不发达;精原干细胞 Ａ Ｋ Ｐ染色呈阳性或强阳性,胞质内脂滴很少或没有;精原干细胞表达特异的 ｃｋｉｔ 受体;体外培养的小鼠精原干细胞常呈不完全的胞质分裂,细胞间由细胞间桥相连而呈链状或团状的细胞群丛,细胞群常由偶数细胞组成。     

去甲斑蝥素抑制肺癌细胞增殖的体外研究

为分析去甲基斑蝥素二钠盐对人和小鼠肺癌细胞增殖的抑制作用,体外培养人非小细胞肺癌A549细胞和小鼠肺癌Lewis细胞,用WST-1还原法检测不同浓度去甲斑蝥素(norcantharidin,NCTD)对肿瘤细胞增殖的抑制作用,并用流式细胞术分析细胞周期;免疫印迹技术分析MAPK激酶表达。NCTD抑制A549和Lewis增殖的IC50值分别为13.5和9.5μmol/L;0、6.25、12.50和25.00μmol/L NCTD处理24h,诱导A549细胞G2/M期阻滞率分别为26.30%、29.44%、49.83%和81.35%。结果表明,抑制肿瘤细胞增殖可能是去甲基斑蝥素抗肿瘤作用的分子机制之一。     

大鼠表皮干细胞的分离培养

为探索一种简单而又高效的分离大鼠表皮干细胞(ESCs)的方法,采用酶消化法和组织块法对大鼠表皮干细胞进行分离、培养;并用Ⅳ型胶原快速黏附法筛选大鼠表皮干细胞,免疫组织化学方法检测CK15、P63、β1-integrin和α6-integrin表达情况;同时,测定ESCs单细胞克隆与克隆形成率及表皮干细胞生长曲线.结果表明,采用组织块法和酶消化法均能分离得到大鼠表皮干细胞,获得的细胞生长良好,具有较高的克隆形成率,前者可传至第6代,而后者传至3代～4代便分化;干细胞标记物CK15、P63、β2-integrin和α6-integrin均呈阳性;酶消化法和组织块法均能成功地分离、纯化和培养大鼠表皮干细胞,组织块法相对较好.