抗猪囊尾蚴单克隆抗体轻重链可变区基因的扩增及序列分析

从分泌抗猪囊尾蚴单克隆抗体杂交瘤细胞提取总RNA,以此为摸板,RT-PCR扩增出抗猪囊尾蚴单克隆抗体轻重链可变区基因,琼脂糖凝胶电泳检测显示约350 bp,符合鼠抗体特征.PCR产物与pMD18-T连接后转化JM109,蓝白斑法筛选出阳性重组子.以载体通用引物对阳性重组子进行鉴定,对证明为阳性的重组子测序.结果显示,轻链可变区和重链可变区基因符合鼠抗体轻链可变区和重链可变区基因特征.VH和VL有3个比较明显的CDR区和FR区.     

氨肽酶N鼠源单链抗体T7噬菌体展示文库的构建

氨肽酶N(pAPN)是一种常见的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的细胞受体。为研究抗pAPN的单链抗体(scFv),试验设计一系列简并引物,通过RT-PCR方法从免疫了天然pAPN的BALB/c小鼠脾中克隆了免疫球蛋白轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)的编码基因。通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)用12个氨基酸的连接肽将VL和VH的扩增产物随机连接,从而获得单链抗体基因。将整个单链抗体基因与T7Select10-3b载体连接,通过体外包装获得了针对pAPN的鼠源ScFv噬菌体文库。pAPN单链抗体初级文库包含2.0×107个重组噬菌体克隆,扩增后的文库滴度达到3.6×109 PFU/mL。Bst NⅠ酶切分析和DNA测序结果显示,28个pAPN抗体初级文库的噬菌体克隆多样性良好。以pAPN C亚基重组蛋白为包被抗原,用噬菌体ELISA进一步验证抗pAPN单链抗体库的活性。本研究主要介绍了采用T7噬菌体展示系统构建猪冠状病毒TGEV和PEDV通用受体pAPN的鼠源单链抗体库及其鉴定。     

抗非洲猪瘟病毒单链抗体的构建、表达及活性鉴定

制备抗非洲猪瘟病毒(ASFV)猪源单链抗体(ScFv),并对其生物学活性进行鉴定,筛选出具有ASFV反应活性的猪源单链抗体(ScFv),为ASFV的诊断提供新的材料.采集ASFV感染康复猪的外周血,分离淋巴细胞,提取淋巴细胞总RNA,以此为模板通过PCR扩增得到猪源IgG重链可变区与轻链可变区基因,利用SOE-PCR技...     

抗鸡传染性支气管炎病毒核蛋白单链抗体的构建及初步鉴定

为了构建鸡传染性支气管炎病毒(IBV)核蛋白(N)单链抗体(scFv),本研究通过提取杂交瘤细胞株6H3的总mRNA,采用RT-PCR法扩增出抗IBV N蛋白抗体的重链和轻链可变区基因,利用重叠延伸PCR将其重链和轻链通过一条寡核苷酸链连接起来扩增了单链抗体基因,并将其克隆于原核表达载体pET-30a,构建重组质粒,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达.对表达产物进行纯化复性后,用夹心ELISA和western blot检测表明scFv可与传染性支气管炎病毒核蛋白发生特异性结合.     

猪源抗体基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

为制备原核表达猪源重组抗体,本研究利用FITC标记的山羊抗猪Ig G标记猪外周血淋巴细胞,通过流式细胞术筛选出Ig G+B细胞。以提取的Ig G+B细胞总RNA反转录制备的c DNA为模板,通过PCR扩增猪抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),将扩增的可变区与本实验室前期克隆的猪源抗体恒定区编码序列通过Linker序列[(Gly)4Ser]3连接,构建全长的猪源抗体编码基因(H-linker-L)。将该基因克隆于原核表达载体p ET-28a中进行原核表达及纯化。Western blot鉴定结果表明,该重组蛋白能够被兔抗猪Ig G-HRP所识别,表明构建的重组抗体为猪源抗体。本研究为特异性猪源抗体的制备以及猪病的防制奠定了基础。     

鸡堆型艾美耳球虫单链抗体基因的构建及表达

轻链可变区和重链可变区基因产物等摩尔浓度混合后,用重叠延伸拼接法扩增出单链抗体基因,再用带限制性内切酶位点的引物(NcoⅠ和HindⅢ)扩增出带有特定酶切位点的单链抗体基因片段.NcoⅠ和HindⅢ双酶切单链抗体与表达载体pET-22b( ),用回收试剂盒回收酶切后的单链抗体与表达载体pET-22b( )基因片段,用连接试剂盒将单链抗体与表达载体pET-22b( )基因片段连接,并将连接产物转化感受态细胞JM109.氨苄青霉素筛选阳性重组子.以T7promoter/T7terminator primer进行茼落PCR鉴定,测定正确后,37℃摇菌扩增,测菌浓度至D600为0.6时,加入IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE初步检测.SDS-PAGE检测显示其相对分子质量是31 000,与预期结果一致,证明单链抗体基因在大肠杆菌中得到表达.     

鸡堆型艾美耳球虫特异性单抗轻、重链可变区基因的克隆与序列测定

将已扩增出的鸡堆型史美耳球虫特异性单抗轻、重链可变区基因进行纯化,并用纯化的2基因片段与pMD-18T载体连接,将重组载体转化于感受态细胞JM109,筛选出阳性重组子,提取阳性重组子质粒并进行测序.得到单抗轻、重链可变区的基因序列.轻链基因为312 bp,重链基因为381 bp,为单链抗体基因的构建及免疫毒素的构建奠定了基础.     

具有免疫反应活性的猪源重组抗体的原核表达及鉴定

为制备与猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)具有反应活性的猪源化原核表达抗体(Pr Ab),本实验通过流式细胞技术,以PRRSV GP5蛋白多肽及抗猪Ig G抗体,筛选出能够与PRRSV抗原表位结合的阳性B淋巴细胞,利用RT-PCR从筛选得到的B细胞的mRNA中扩增出编码抗体重链可变区(VH)基因序列和轻链可变区(VL)基因序列,将扩增的可变区基因序列分别与本实验室前期克隆的猪源抗体轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH)基因序列连接后,以Linker序列将轻链和重链全长基因序列相连,构建全长的猪源抗体编码基因(H-linker-L)。将该基因克隆于原核表达载体p ET-28a中进行原核表达及纯化。Western blot鉴定结果显示,表达的重组蛋白能够被抗猪IgG抗体所识别,表明表达的重组蛋白为PrAb;经PRRSV包被的ELISA鉴定,PrAb与PRRSV弱毒株CH1R和强毒株HuN4呈阳性反应,表明所制备的PrAb为PRRSV特异性抗体。本实验为进一步制备诊断PRRS的猪源化重组抗体奠定了基础。     

鸡堆型艾美耳球虫特异性单抗重链可变区基因的克隆与测序

提取堆型艾美耳球虫子孢子杂交瘤细胞总RNA,进行RT PCR,扩增出重链可变区基因。将已扩增出的鸡堆型艾美耳球虫特异性单抗重链可变区基因片段与pMD 18T载体连接,重组载体转化于感受态细胞JM109,筛选出阳性重组子,提取阳性重组子质粒并进行测序,得到单抗重链可变区的基因序列,为单链抗体基因的构建及免疫毒素的构建奠定了基础。     

天然鼠源噬菌体抗体库的构建及抗鸡堆型艾美耳球虫裂殖子单链抗体的筛选（英文）

从未经主动免疫的BALB/c小鼠脾脏淋巴细胞中提取总RNA,用RT-PCR扩增鼠抗体重链(VH)和轻链(VL)可变区基因,将轻链和重链可变区基因经重叠延伸拼接PCR反应,构建成单链抗体(ScFv)基因。将ScFv基因克隆到噬菌体载体PCANTAB-5E,转化入大肠杆菌TG1中,筛选出阳性克隆,接种于LB培养基,经辅助噬菌体M13KO7拯救,构建天然鼠源噬菌体抗体库,并进行抗体库滴度测定,通过DNA finger printing技术及单链抗体基因序列分析鉴定抗体库的多样性。以堆型艾美耳球虫裂殖子为靶抗原,对构建的噬菌体抗体库进行亲和筛选,将强阳性重组噬菌体克隆感染大肠杆菌HB2151,经IPTG诱导表达可溶性ScFv抗体,并对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot鉴定,用ELISA法鉴定其对堆型艾美耳球虫裂殖子抗原的结合活性。结果表明,天然鼠源噬菌体抗体库成功构建,库容量约为2.50×10~(11) CFU/mol,单链抗体库具有一定的多样性。经过4轮亲和筛选,携带抗鸡堆型艾美耳球虫裂殖子表面抗原的特异性噬菌体抗体得到了富集。特异性ScFv抗体在E.coli中分泌表达,表达产物具有免疫活性。筛选出5个与鸡堆型艾美耳球虫裂殖子抗原结合活性较高的克隆,构建的单链噬菌体抗体库的有效表位具有多样性。本研究为进一步认识鸡球虫的各个发育阶段奠定理论基础,为鸡球虫病免疫控制研究提供参考。