奶牛β-干扰素在大肠杆菌中高效表达和生物活性分析

提取经植物血凝素诱导培养的中国健康奶牛外周血淋巴细胞总RNA,应用RT-PCR方法扩增出奶牛β-干扰素成熟蛋白基因并将其克隆到pMD18-T载体上。测序结果表明,扩增片段为奶牛β-干扰素成熟蛋白序列,与GenBank上发表的干扰素序列同源性为100%。将其重组到原核表达载体pET32a(+)上,并在大肠杆菌BL21中实现了高效表达。表达产物以His-Tag融合蛋白的形式存在,表达量约占细菌总蛋白的40%。用镍亲和层析法对蛋白进行纯化,并利用VSV-MDBK/IBRV细胞系统分析其生物活性。重组奶牛β-干扰素抗病毒活性分别约3.16×105U/mL,7.5×104U/mL。结果表明,重组奶牛β-干扰素特异性好,而且抗病毒活性比较稳定。本研究为研制和开发重组奶牛β-干扰素类生物制品研发奠定了基础。     

荷斯坦奶牛IFN-α基因的克隆表达和抗病毒活性分析

本研究通过 PCR从荷斯坦奶牛基因组 DNA中克隆了 IFN- α(Bo IFN- α)基因 ,PCR产物双酶切后与载体 PQE30连接 ,构建重组质粒 PQE30 /Bo IFN- α,进行测序和诱导表达。测序结果表明 ,荷斯坦奶牛 IFN- α基因全长为 4 98个核苷酸 ,含一个ORF,编码 16 6个氨基酸的成熟蛋白 ,与所报道的 Bo IFN- αA亚型只存在一个点变异。表达产物经 SDS- PAGE和 Western blot分析 ,表达出 2 0 KD的融合蛋白 ,表达量占菌体总蛋白的 2 2 % ,表达产物以包涵体形式存在 ,约占沉淀蛋白的 32 %。包涵体提取物经尿素变性、透析复性后初步纯化 ,重组牛 IFN- α(r Bo IFN- α)初提物在牛肾细胞 (MDBK) /水泡性口炎病毒 (VSV)和鸡胚成纤维细胞 (CEF) /VSV细胞系上的活性分别为和 1.0～ 2 .3× 10 6 U/mg和 1.3～ 2 .6× 10 5U/mg,对传染性牛鼻气管炎病毒 (IBRV)感染有一定的抑制作用 ,抗病毒活性为 7.8× 10 5U /mg。结果显示大肠杆菌可以高效表达具有生物学活性的 r Bo IFN-α。     

重组鸡α-干扰素的表达与抗病毒活性分析

为了表达具有抗病毒活性的重组鸡α-干扰素(IFN-α),试验根据大肠杆菌密码子的偏好性,对鸡IFN-α的成熟肽基因序列进行优化,合成后连接至原核表达载体pET30a-ELP,经体外诱导后表达重组蛋白ELP-ChIFN-α,借助重复可逆相变循环(ITC)法进行纯化;纯化蛋白经过变性、复性处理后进行安全性评价,采用微量细胞病变抑制法在犬肾细胞(MDCK)/水疱性口炎病毒(VSV)系统中进行蛋白抗病毒活性的检测。结果表明：合成的重组鸡IFN-α成熟肽基因能在原核表达系统中成功表达;不同浓度的重组蛋白ELP-ChIFN-α对细胞的生长抑制率为0;重组蛋白ELP-ChIFN-α在MDCK/VSV系统中具有抗病毒活性,活性为1.2×10⁶ IU/mg。说明原核表达的重组鸡IFN-α有较好的抗病毒活性,可作为鸡的抗病毒生物药物进一步开发研究。     

猫干扰素α基因的克隆及其表达产物的抗病毒活性分析

为制备重组猫IFN-α并检测其抗病毒活性,本研究采用水泡性口炎病毒(VSV)感染结合poly I:C刺激实验猫后,提取猫脾淋巴细胞总RNA并反转录为cDNA,以其为模板经RT-PCR方法扩增获得了567 bp的猫IFN-α基因,测序后进行生物信息学分析.结果显示,猫IFN-α有21个潜在磷酸化位点、1个N-糖基化位点和...     

羊干扰素α和γ融合表达及抗病毒活性分析

为进一步探究羊干扰素α和γ的抗病毒活性效果,根据GenBank羊IFN-α和IFN-γ基因序列,使用Linker连接合成目的序列,成功构建了3种重组表达质粒pET28a-OviIFN-γ、pET28a-OviIFN-α、pET28a-OviIFN-γ/α并进行原核表达。用细胞病变抑制法和RT-qPCR测定重组蛋白rOviIFN-α、rOviIFN-γ和rOviIFN-α/γ的抗病毒活性。结果表明,rOviIFN-α、rOviIFN-γ和rOviIFN-α/γ在牛肾细胞(MDBK)以及非洲绿猴肾细胞(Vero)细胞中有抗病毒活性,且rOviIFN-α/γ的抗病毒效果最优;rOviIFN-α、rOviIFN-γ和rOviIFN-α/γ能够显著上调MDBK以及Vero细胞中4种干扰素刺激基因(IFN stimulated genes, ISGs)的mRNA转录水平,且rOviIFN-α/γ对干扰素刺激基因的上调水平最显著。综上所述,本试验表达的重组蛋白都具有抗病毒作用,其中串联表达的重组蛋白抗病毒活性以及干扰素刺激基因转录水平较高。     

重组奶牛干扰素-α基因的原核表达

从健康奶牛的血液中分离白细胞，用刺激物诱导白细胞产生干扰素，采用RT—PCR扩增干扰素-α基因，构建原核表达载体pQE30-IFNα，用IPTG诱导表达。得到重组的奶牛成熟干扰素-α基因全长498bp，构建的原核表达载体诱导6h后表达量较高，表达产物的分子量约为20kD，从而获得了表达奶牛干扰素-α的基因工程菌株。     

鸡α干扰素基因的原核表达及其活性测定

应用RT-PCR技术,从被刺激诱导的鸡脾脏淋巴细胞中扩增鸡α-干扰素(ChIFN-α)基因cDNA,经克隆和测序后,构建原核表达重组质粒pGEX-proChIFN-α(全长序列)和pET-ChIFN-α(不含信号肽序列),并分别转化相应的表达菌.重组菌经IPTG诱导,SDS-PAGE结果表明,ChIFN-α基因均获得表达,重组蛋白大小分别为45 ku、26ku左右,表达的蛋白以包涵体形式存在.表达产物经变性、提纯、复性,重组蛋白的含量约为1 mg/mL.复性后的ChIFN-α能够在鸡胚成纤维细胞上抑制H5N1禽流感病毒的复制;用水泡性口炎病毒检测结果表明,重组ChIFN-α具有较高的抗病毒作用,其生物学活性达到2×106 u/mg.     

猪α-干扰素基因在大肠杆菌中的表达及活性测定

根据GenBank中登录号为M28623的基因序列,合成猪α-干扰素成熟肽基因,并将该基因克隆至pQE-31载体,转化宿主菌M15诱导表达,SDS-PAGE电泳结果表明该蛋白以包涵体形式表达,分子量约21 ku,经包涵体变性复性后获得了具有抗病毒活性的干扰素,用MDBK-VSV系统检测其抗病毒活性不低于1010 U/0.1 mL.     

牦牛IFN-α基因的克隆表达及抗病毒活性研究

从我国地方品种环湖型牦牛和野牦牛基因组DNA中克隆了α干扰素(BoIFN-α)基因,PCR产物酶切后与载体pQE30连接,构建重组质粒pQE30/BoIFN-α,将其转化JM109E.coli并用IPTG进行诱导表达。序列分析表明,环湖型牦牛和野牦牛IFN-α成熟肽基因全长均为498个核苷酸,编码166个氨基酸,其中环湖型牦牛IFN-α与已报道的8个BoIFN-α亚型氨基酸的一致性为92.8%~95.2%,野牦牛为88.6%~92.8%,均为BoIFN-α新亚型。SDS-PAGE和Westernblot结果表明,重组蛋白约为20kD,以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的25%。经包涵体提取、尿素变性和复性后,重组牛IFN-α粗提物在MDBK/VSV和CEF/VSV细胞系上的抗病毒活性分别为1.6~1.8×106U/mg和2.3×105U/mg,而且对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)也有一定的抑制作用。     

北京鸭干扰素-α基因的分子克隆与表达

采用 PCR法从北京鸭 (Anas platyrhynchosdoestica L innaeus)基因组中克隆了其干扰素 - α基因 (BJ- Du IFN- α)。克隆片段长 4 86 bp,编码 1 6 1个 Du IFN-α成熟肽。与已报道的北京鸭干扰素 -α基因相比 ,BJ- Du IFN-α在 2 85位发生了同义变异。将 BJ-Du IFN-α插入原核表达载体 p QE3 0 ,在 E.Coli JM1 0 9工程菌中表达了重组蛋白。经 SDS- PAGE、Western Blot和抗病毒活性测定 ,表达产物占菌体总蛋白的 2 3 %,为重组鸭干扰素 -α(r Du IFN-α)。 r Du IFN-α抗滤泡性口炎病毒 (VSV)活性高达 7.9× 1 0 5U /mg。     

三黄鸡a干扰素的克隆、表达及抗病毒活性初步研究

采用PCR方法从三黄鸡血液基因组中扩增鸡α干扰素全基因,并克隆和测序.序列分析表明,基因全长为582 bp,亚克隆其成熟蛋白编码基因489 bp.将该片段与表达载体pET-28a连接克隆至大肠埃希菌DH5α菌株,经测序和酶切鉴定,选取正向插入、读码框正确的阳性克隆.构建重组质粒并转化BL21(DE3),经IPTG诱导,...     

猪α干扰素基因突变、表达及其高效抗病毒活性筛选研究

利用RT-PCR方法从猪肝细胞总RNA中扩增出编码猪α干扰素基因,根据大肠杆菌偏嗜性及活性位点改造基因并克隆至原核表达载体p ET21a,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白诱导表达和鉴定。重组蛋白以包涵体形式表达,经变-复性及纯化处理后,获得多种不同基因型的高纯度猪α干扰素。用细胞病变抑制法在MDBK/VSV系统上进行抗病毒活性测定,结果表明经过基因改造的猪α干扰素(Po IFN-M6)具有更高抗病毒活性,约为2.97×108U/mg。本研究为猪α干扰素基因工程产品的研发及其在临床兽医的应用奠定基础。     

梅花鹿γ干扰素克隆表达及抗病毒活性测定

提取经植物血凝素诱导培养的梅花鹿外周血淋巴细胞总RNA,应用RT-PCR方法扩增出梅花鹿γ干扰素成熟蛋白基因并将其克隆到pMD18-T载体上,测序结果表明,扩增片段为梅花鹿γ干扰素成熟蛋白序列,与GenBank上发表的干扰素序列同源性为100%.将其重组到原核表达载体pET32a(+)上,并在大肠埃希菌BL21中实现了高效表达.表达产物以His-Tag融合蛋白的形式存在,表达量约占细菌总蛋白的32.6%.用镍亲和层析法对蛋白进行纯化,并利用VSV-MDBK/IBRV细胞系统分析其生物活性,重组梅花鹿γ干扰素抗病毒活性分别约为7.25×104 U/mL和4.61×104 U/mL.结果表明,重组梅花鹿γ干扰素特异性好,而且抗病毒活性比较稳定.     

重组牛α干扰素的分泌表达及抗病毒活性分析

本研究旨在利用乳酸乳球菌构建牛α干扰素（BoIFN-α）的分泌表达系统并分析其抗病毒活性。根据乳酸乳球菌MG1363密码子使用的偏好性,对BoIFN-α基因进行优化合成。将目的基因和乳酸乳球菌表达载体质粒pAMJ399分别进行SalⅠ和BglⅡ双酶切,将胶回收产物进行连接后,转化大肠杆菌TG1感受态细胞,提取阳性质粒电转化乳酸乳球菌感受态细胞,用SDS-PAGE和Western blotting方法对表达蛋白进行分析和鉴定,同时将重组乳酸乳球菌培养28 h后取上清用PEG20000浓缩10倍左右,进行体外抗病毒试验。结果显示,试验成功构建了重组乳酸乳球菌pAMJ399-BoIFN-α/MG1363,重组菌上清和沉淀均出现约20 ku的目的条带,表明重组蛋白以分泌的形式同时存在于培养液的上清和沉淀中。浓缩后的重组BoIFN-α（rBoIFN-α）上清与水泡性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus,VSV）同时作用,用MDBK/VSV系统以微量细胞病变抑制法测定rBoIFN-α的效价为1.02×10⁶ U/L;通过Alamer Blue法分析可知,加入rBoIFN-α后对细胞的活性影响较小;间接免疫荧光试验可见加入rBoIFN-α后细胞无绿色荧光,说明rBoIFN-α有良好的抗病毒效果;实时荧光定量PCR结果进一步证实rBoIFN-α具有一定的抗病毒效果。本试验构建了能分泌表达rBoIFN-α的乳酸乳球菌,通过一系列的体外抗病毒试验证明rBoIFN-α具有良好的抗病毒活性,试验结果为rBoIFN-α作为抗病毒药物、免疫增强剂的开发、肽类用药及临床应用提供新途径。     

犬α-干扰素原核表达及其抗病毒活性检测

干扰素(interferon,IFN)是一类能诱导动物细胞产生多种广谱抗病毒蛋白的细胞因子,具有阻止病毒繁殖、调节机体免疫反应的生物学功能,是当今应用前景最为广阔的重要生物制剂之一[1-2]。干扰素按其细胞来源可分为α、β及γ3种类型,其中α-干扰素(IFN-α)是由能在脊椎动物各种类型的细胞中增殖     

猪α-干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性测定

利用基因工程技术,将编码梅山猪α-干扰素成熟蛋白基因(mPoIFNα,501 bp)亚克隆到含分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建成分泌型重组表达载体pPIC9K-mPoIFNα。用化学方法(LiCl)将线性化的mPoIFNα与ssDNA共转化入毕赤酵母菌株GS115,转化子经MD平板筛选和PCR鉴定后,得到的阳性菌株再以高浓度的G418筛选多拷贝重组子。该高拷贝菌株经1%甲醇连续诱导4 d,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot检测,结果表明在毕赤酵母中猪α-干扰素获得分泌型表达,表达产物约为20 000,在GS115中的表达量约为40mg/L,占GS115表达的可分泌型总蛋白的40.1%。对表达产物进行理化分析发现,重组酵母菌表达的蛋白耐酸(pH2),对热(56℃)部分敏感,并能被特异性抗猪α-干扰素抗体中和而不与抗猪γ-干扰素抗体反应。细胞病变抑制法(CPE50)测定干扰素生物活性,试验结果表明rPolIFNα具有较高的抗病毒生物活性,在MDBK中的抗VSV比活性为8.0×106U/mg。     

重组猪干扰素α的原核表达及抗病毒活性

为了探究重组猪干扰素(PoIFN-α)在体内外的抗病毒活性,利用pET-32a载体系统,构建了PoIFN-α的原核表达体系。在体外,MTT法在猪肾细胞(PK-15)和猪睾丸细胞(ST)上测定了其细胞毒性,并利用细胞病变抑制法测定其抗水泡性口炎病毒(VSV)、猪脑心肌炎病毒(EMCV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)的活性,同时测定了重组蛋白作用PK-15细胞后干扰素刺激基因(ISGs)的转录水平;之后通过小鼠攻毒保护试验,测定了rPoIFN-α治疗后各组织器官的病毒载量,ELISA测定了小鼠血清中细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-10和IL-6的动态变化,并对整个试验期间小鼠出现的临床症状进行打分。结果显示,成功获得了原核表达的特异性重组蛋白rPoIFN-α,在细胞上抗病毒比活性达到1.67×10⁶ IU,对细胞没有损害作用,且显著上调了Mx1、OAS等因子的转录水平;在小鼠体内能明显拮抗EMCV和PRV的增殖,减少促炎因子的产生,延缓临床症状的出现。结果表明,原核表达重组蛋白rPoIFN-α在体内外均具有抗病毒活性,为进一步推进蛋白药物在临床上的应用奠定了基础。     

猪干扰素α的原核可溶性表达及抗PEDV活性

旨在利用原核表达系统高效表达具有抗病毒活性的可溶性重组猪干扰素α(soluble recombinant porcine interferon-α,srPoIFN-α)。通过PCR方法扩增姜曲海猪IFNα基因成熟肽序列,将其分别克隆至原核表达载体pCold-Ⅱ、pET22b、pET30a和pET30a-ELP中并在大肠杆菌中进行表达;通过Western blot结合Image J软件或BCA定量分析不同表达载体、密码子偏好优化、培养基类别、纯化方式等因素对猪干扰素α基因在大肠杆菌中可溶性表达的影响,鉴定提高srPoIFN-α表达的有利因素;利用VSV-GFP和PEDV检测srPoIFN-α的抗病毒活性。结果显示,原核表达载体pET30a、密码子优化、HB-PET自诱导培养基和磁珠纯化均能显著提高srPoIFN-α产量(P<0.001);srPoIFN-α有效抑制VSV-GFP复制的稀释倍数为2^-8.1,与重组人干扰素α2b标准品的比活为1.71×10⁸ IU/g,有效抑制PEDV复制的稀释倍数为2^-10.29,抗P...     

吉林白鹅α干扰素在大肠杆菌中的表达及抗病毒活性检测

用PCR方法扩增了吉林白鹅α干扰素(IFN-α)成熟肽编码序列,将IFN-α片段定向插入原核表达载体pGEX-6p-1中,构建重组质粒pGEX-IFN-α,将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞里,在IPTG诱导下表达可溶性的融合蛋白(GST-IFN-α)。SDS-PAGE、Western-blot检测结果表明,重组吉林白鹅IFN-α融合蛋白(rGoIFN-α)的分子量大小约为43ku,能与IFN-α抗血清发生特异性结合反应。重组吉林白鹅α干扰素经谷胱甘肽Sepharose-4B亲和柱层析纯化后,在鸭胚成纤维细胞上抗鹅细小病毒的活性为3.32×105 U/mg,本试验结果表明,该表达系统能够表达重组鹅α干扰素,且表达的重组鹅α干扰素具有一定的抗病毒活性。