合浦珠母贝含硒谷胱甘肽过氧化物酶基因特征与表达分析

研究了合浦珠母贝含硒谷胱甘肽过氧化物酶(命名为poSe-GPx)基因结构特征和在应激状态下的表达调控机制,其cDNA全长为1271 bp,5′-非编码区(UTR)长28 bp,3′-UTR长631 bp,包括4个RNA不稳定信号结构域(ATTTA)、1个保守的硒代半胱氨酸插入序列(SECIS)和1个位于poly(A)尾巴上游22个核苷酸处的多聚腺苷信号(AATAAA).开放阅读框(ORF)为612 bp,编码由203个氨基酸组成的多肽,分子质量约23.1 ku,理论等电点为8.29.poSe-GPx第51个氨基酸为硒代半胱氨酸(Sec),由密码子TGA编码.poSe-GPx序列中存在1个保守的GPx签名序列75LGFPCNQF82、1个活性位点序列162WNFEKF167和1个糖基化位点87NCT89.利用MatGAT软件对poSe-GPx氨基酸序列和其他物种GPx序列进行同源性和相似性分析,结果表明:poSe-GPx与其他物种GPx序列具有较高的保守性,同源性为42%-55%,相似性为56%-71%.组织表达模式分析表明:poSe-GPx mRNA在消化腺、鳃、性腺、血细胞、闭壳肌、肠和外套膜中都有表达.免疫应激试验结果显示,在2和4 h时poSe-GPx基因在消化腺中的表达显著上调.     

草菇多酚氧化酶及过氧化物酶特性的研究

草菇多酚氧化酶（ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｏｘｉｄａｓｅ）与过氧化物酶（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）的最适ｐＨ分别为６０～６８、６７～７４,最适温度分别为３０～３２℃、２５～２８℃在最适条件下,前者的活性远高于后者,当ｐＨ８６及温度４３℃或４８℃处理１ｍｉｎ,二者活力显著降低;但是,先在３５～３８℃保温１ｈ再测定,发现二者的最适温度分别达４０～４１℃、５２～５３℃,升温至８０℃１０ｓ,过氧化物酶仍表现活性Ｏ２对多酚氧化酶活性影响极大,而对过氧化物酶活性影响较小金属离子Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｇ２＋对二者均有强烈激活作用,Ｃａ２＋对二者的作用都很弱,Ｆｅ２＋、Ｃｕ２＋对前者作用明显强于后者二者的反应进程及酶浓度与反应速度的关系,表现出较大的差异     

玉米谷胱甘肽过氧化物酶生物信息学分析

谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)是生物体内重要的活性氧自由基清除剂,它能够清除生物体内的过氧化氢和脂质过氧化物,阻断活性氧自由基对机体的进一步损伤,保证生物体能正常进行生命活动。以玉米谷胱甘肽过氧化物酶基因家族的11个成员为研究对象,对其编码的蛋白质的结构和功能进行分析,包括等电点、分子量、亲水性值、二级结构和亚细胞定位等,并建立了分子系统进化树。结果发现,玉米谷胱甘肽过氧化物酶基因家族的11个成员的等电点和相对分子量存在差异,而二级结构存在相似特征,其中,二级结构包括α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲。以上分析为全面解析玉米谷胱甘肽过氧化物酶的功能奠定了基础,并可为植物抵御氧化胁迫研究提供理论依据。     

草菇多酚氧化酶及过氧化物酶活性的抑制研究

研究了柠檬酸、苹果酸、酒石酸、Ｖｃ、ＥＤＴＡ－２Ｎａ、ＳＯ２、ＨＣｌ对多酚氧化酶（ＰＰＯ）及过氧化物酶（ＰＯＤ）最适抑制沈度、最适抑制ｐＨ,并对这几种抑制剂的作用机理进行了探讨,结果表明：草菇采收后,尽快用０．１ｇ／ｋｇＥＤＴＡ－２Ｎａ＋３．０ｇ／ｋｇ Ｖｃ＋５．０ｇ／ｋｇ柠檬酸处理草菇８～１０ｍｉｎ,于１１～１２℃贮藏效果较好。     

半番鸭谷胱甘肽过氧化物酶的组织表达与酶活力研究

采用实时荧光定量法和化学比色法分别测定了半番鸭不同组织谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px) mRNA的相对表达水平和酶活力。结果显示:半番鸭的GSH-Px mRNA表达水平表现为肾脏>胸肌>肺脏>脾脏>肝脏>心脏>肌胃;胸肌和肝脏的GSH-Px酶活力较高,肾脏次之,肌胃的最低;除胸肌的GSH-Px基因表达水平与酶活力间的相关性达到显著水平外,在其余组织中两者之间的相关性均不显著,但代谢较为活跃的胸肌、肝脏和肾脏的两个指标均较高,而肌胃均为最低。由此提示,半番鸭GSH-Px基因表达和酶活力存在物种和组织特异性,胸肌具有较高的抗氧化能力。     

半番鸭谷胱甘肽过氧化物酶的组织表达与酶活力研究

采用实时荧光定量法和化学比色法分别测定了半番鸭不同组织谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px) mRNA的相对表达水平和酶活力。结果显示:半番鸭的GSH-Px mRNA表达水平表现为肾脏>胸肌>肺脏>脾脏>肝脏>心脏>肌胃;胸肌和肝脏的GSH-Px酶活力较高,肾脏次之,肌胃的最低;除胸肌的GSH-Px基因表达水平与酶活力间的相关性达到显著水平外,在其余组织中两者之间的相关性均不显著,但代谢较为活跃的胸肌、肝脏和肾脏的两个指标均较高,而肌胃均为最低。由此提示,半番鸭GSH-Px基因表达和酶活力存在物种和组织特异性,胸肌具有较高的抗氧化能力。     

采后荔枝果皮抗坏血酸过氧化物酶基因的差异表达试验初报

根据荔枝果皮APX基因cDNA全长,设计RT-PCR引物,以actin基因为内标,对采后不同储存时间荔枝果皮APX基因mRNA表达情况进行分析。结果表明:采后保湿储存处理的荔枝果皮APX基因mRNA相对丰度在采后24h迅速升高,而后升高幅度减缓。     

麻鸭磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶高效可溶性表达及其部分酶学性质

【目的】克隆麻鸭磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶基因(GPx4)并在大肠杆菌中表达,分析其酶学特性,为研究GPx4功能及其在羟基脂肪酸形成过程中的调节机制打下基础。【方法】采用RT-PCR克隆麻鸭GPx4(DGPx4)的编码基因,利用定点突变的方法构建半胱氨酸突变体DGPx4表达载体pMBP-DGPx4(48Sec→Cys),并在大肠杆菌中通过添加His标签进行可溶性表达,经Ni-NTA亲和层析和离子交换层析纯化得到融合蛋白DGPx4;采用总谷胱甘肽过氧化物酶活性检测试剂盒检测DGPx4活力以研究其酶学性质。【结果】克隆获得的DGPx4基因编码序列全长516 bp,编码172个氨基酸,编码蛋白分子量约20 k D,理论等电点(p I)为8.9。构建的突变体基因原核表达载体pMBP-DGPx4(48Sec→Cys)可在大肠杆菌中成功诱导表达获得融合蛋白DGPx4,经Ni-NTA亲和层析和离子交换层析即获得高纯度的DGPx4。以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)为底物时,DGPx4的最适反应温度为32℃,最适pH为8.0,对NaCl浓度较敏感;Cu2+和Ni2+对DGPx4活力有较高的促进作用,Mg2+和Mn2+对DGPx4活力有一定的抑制作用,Ca2+和Zn2+对DGPx4活力则无明显的促进或抑制作用。【结论】从鸭肝细胞中克隆获得的DGPx4基因序列经定点突变后可在原核细胞中高效表达,且纯化后的高纯度融合蛋白DGPx4具有GPx4活力,能在抗脂质氧化过程中发挥作用。     

水稻干尖线虫谷胱甘肽过氧化物酶基因抗缺氧表达

根据转录组测序结果,克隆到水稻干尖线虫谷胱甘肽过氧化物酶基因(Ab-GPX),对其基因结构、在缺氧条件下的表达模式及功能进行研究.原位杂交结果表明,Ab-GPX在水稻干尖线虫生殖系统部位表达.RT-PCR结果表明,Ab-GPX在缺氧胁迫及恢复供氧过程中表达量上调.利用基因沉默技术进一步研究发现,Ab-GPX沉默后,水稻干尖线虫在缺氧条件下存活率显著下降,表明该基因可能参与调控水稻干尖线虫的缺氧隐生状态.     

猪体内谷胱甘肽过氧化物酶分布及动态变化研究

【目的】全面了解谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)在猪体内的分布和动态变化.【方法】以3个品种的猪为研究对象,测定了不同组织中及不同品种、性别、龄期、健康状态猪血液中的GPx活力.【结果和结论】在26~150日龄,长白猪和蓝塘猪全血中的GPx活力随着龄期的增加而缓慢上升,至150日龄时达到最大值;蓝塘猪各龄期GPx活力高于长白猪GPx活力,30和90日龄GPx活力显著高于长白猪的GPx活力(P0.05);90日龄杜大长公猪GPx活力显著高于母猪的GPx活力(P0.01);90日龄健康杜大长猪GPx活力显著高于病猪的GPx活力(P0.01).对不同组织GPx活力和比活力进行比较,结果发现猪的肾、脾、肝、肺、心和回肠等组织的活力和比活力较高,可作为理想的提取GPx的原材料.     

草菇多酚氧化酶基因的克隆与表达分析

【目的】解析草菇多酚氧化酶基因家族序列信息,明确其特征和表达模式。【方法】通过转录组测序找出含有酪氨酸酶结构域的基因,并根据搜索得到的序列设计引物,以不同发育时期的草菇 v26 菌株,以及草菇蛋形期外菌膜、菌盖、菌柄等不同组织为材料提取 RNA,经反转录为 cDNA,扩增获得草菇多酚氧化酶基因序列。采用在线生物信息学网站预测草菇多酚氧化酶的理化性质。采用 RT-PCR 的方法,检测草菇不同发育时期和不同组织部位多酚氧化酶的表达模式。【结果】获得 4 个草菇多酚氧化酶基因家族的 CDS 序列,依次命名为 VvPPO1、VvPPO2、VvPPO3、VvPPO4,其中 VvPPO1 CDS 全长 1 596 bp、编码 531 个氨基酸,VvPPO2 CDS 全长 2 685 bp、编码 894 个氨基酸,VvPPO3 CDS 全长 1 593 bp、编码 530 个氨基酸,VvPPO4 CDS 全长2 067 bp、编码 688 个氨基酸。生物信息学分析表明,4 个基因编码的蛋白均含有 2 个铜离子结合区,为亲水性蛋白;RT-PCR 结果显示,4 个基因在草菇发育的菌丝期、原基期、蛋形期、成熟期均有表达,VvPPO1、VvPPO3 和VvPPO4 的表达量在子实体时期高于菌丝期,在蛋形期 VvPPO1 和 VvPPO4 在外菌膜的表达量比在菌柄和菌盖中的表达量高。【结论】在草菇中搜索得到 4 个多酚氧化酶基因,均含有 2 个铜离子结合区,4 个基因在各个发育时期均有表达。     

草菇TPI基因的克隆、结构及其在同核、异核菌株中的表达量

分别从不能出菇的草菇单孢菌株PYd21(基因组测序菌株)和PYd15(重测序菌株)及由PYd21、PYd15配对杂交获得可正常出菇的异核菌株H15-21中克隆测序了磷酸丙糖异构酶(TPI)基因,并对TPI基因的结构及其在3个菌株中的表达量进行了分析.结果表明:PYd21、PYd15中TPI基因的序列完全相同;转录组读段定位、双末端分析结果显示,TPI基因全长1015 bp,开放阅读框序列全长756 bp,编码251个氨基酸,有6个外显子、5个内含子;RNA加工过程中存在两种可变剪切类型和两个可变剪切位点;数字基因表达谱测序的结果表明,PYd21、PYd15和H15-21中TPI基因的表达量(TPM)分别为30.25、36.49、77.17,同时通过实时荧光定量PCR分析3个菌株中TPI基因的表达情况证实了该结果,表明草菇中TPI基因的表达表现出异核体表达的协同增效作用,预示着异核菌株中两种不同细胞核存在相互作用.     

越橘谷胱甘肽巯基转移酶基因的克隆及表达

以越橘(Vaccinium L.)品种"北陆"为试材,采用反转录PCR克隆技术成功克隆越橘谷胱甘肽巯基转移酶基因c DNA全长序列,获得一个完整的编码区c DNA序列,长为690 bp,编码229个氨基酸,将其命名为VcGSTU1(Gen Bank登录号KT601064)。经与谷胱甘肽巯基转移酶家族其他成员的氨基酸序列比对和系统进化分析,初步确定VcGSTU1属于谷胱甘肽巯基转移酶Tau家族。生物信息学分析表明,该蛋白不稳定指数为28.80,属于稳定蛋白。预测该蛋白分子量为25.499 ku,等电位点为5.68。蛋白质序列同源比对发现其含有完整的GST-N-Tau和GST-C-Tau结构域。利用反转录PCR和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)2种方法分析谷胱甘肽巯基转移酶的表达模式,该基因在越橘的根、茎、叶芽、叶、花芽、绿果、粉果、蓝果、蓝果果皮、蓝果种子中均有表达,且在蓝果种子中相对表达量最高。     

草菇钙调磷酸酶催化亚基(Vv-CNA)的序列与表达

[目的]分析草菇钙调磷酸酶催化亚基(Vv-CNA)的序列与表达,为进一步探究草菇生长发育及子实体开伞分子调控机理提供参考.[方法]通过生物信息学分析确定Vv-CNA基因的组成及保守结构,将ORF Finder预测的草菇CNA氨基酸序列与从NCBI下载的其他真菌CNA氨基酸序列进行比对,并通过荧光定量PCR检测Vv-CNA基因在草菇不同生长时期的相对表达量.[结果]Vv-CNA基因编码区为2503 bp,包含10个内含子(其中I2、I8、I9和I10存在内含子保留现象),编码610个氨基酸,GenBank登录号KX463514.将Vv-CNA氨基酸序列与动物(人、小鼠)、植物(拟南芥、水稻)和真菌(曲霉、酵母等)的CNA氨基酸序列进行同源比对分析,结果发现Vv-CNA蛋白有3个最保守的结构域,与密褐褶菌(Gloeophyllum trabeum)的亲缘关系最近.Vv-CNA基因在草菇子实体的蛋形期和伸长期高表达,以蛋形期的相对表达量最高.[结论]Vv-CNA基因编码钙调磷酸酶催化亚基,其高表达有利于草菇菌柄的伸长.     

干旱和盐胁迫条件下枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因（ZjGPX）的差异表达及功能分析

【目的】研究枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因（ZjGPX）的功能,为其在果树抗逆基因工程改良中的利用奠定基础【方法】以‘壶瓶枣’（Ziziphus jujuba Mill. Hupingzao）结果枝构建的cDNA文库中选取一条与其他植物谷胱甘肽过氧化物酶基因有较高同源性的序列为研究对象进行序列分析,预测其功能。通过实时荧光定量技术分析目的基因在盐胁迫及干旱胁迫条件下的表达特性,并构建植物表达载体PEZR(K)-LNY-ZjGPX,运用农杆菌介导法,将ZjGPX转入拟南芥,对转基因及野生拟南芥植株作盐胁迫及干旱胁迫处理,验证其抗逆功能。【结果】ZjGPX编码序列（CDS）长510 bp,编码169个氨基酸。Blast比对发现该基因与多种植物GPX基因具有高度同源性（>80%）。实时荧光定量分析表明,在辣椒枣组培苗中,ZjGPX能够被一定浓度的干旱胁迫和盐胁迫诱导表达,且反应迅速,仅胁迫15 min,其相对表达量与对照相比即出现大幅升高,暗示该基因可能对枣树抗旱性和耐盐性具有重要的作用。结合50 μg·mL^-1 Kan抗性筛选、PCR验证及激光共聚焦显微镜观察,共获得10株阳性转基因拟南芥株系,干旱及盐胁迫处理结果显示,转基因拟南芥种子萌发率均高于野生型拟南芥;成株在胁迫15 d后,野生型拟南芥出现叶片发黄、萎焉、整株干枯、死亡的迹象,而转ZjGPX拟南芥生长基本正常。表明过表达ZjGPX拟南芥株系具有良好的耐旱性和耐盐性。【结论】ZjGPX在植物的干旱和盐胁迫应答反应机制中起重要作用,过量表达ZjGPX可提高转基因拟南芥的耐旱和耐盐能力。     

苹果抗性相关的谷胱甘肽转移酶基因MdGSTU1的生物信息学和表达分析

【目的】克隆苹果（Malus domestica Borkh.）中抗苹果轮纹病相关的编码谷胱甘肽转移酶基因MdGSTU1,研究其在不同组织器官及不同逆境处理条件下的表达特性,为解析该基因的抗逆功能奠定基础。【方法】基于抗轮纹病相关的EST序列,通过在NCBI进行比对,得到一个谷胱甘肽转移酶（GST）基因相关的EST片段;然后在苹果基因组数据库中进行比对,获得该GST的编码框序列（coding sequence,CDS）,同时,设计RACE引物,克隆该基因的UTR序列;利用MEGA5.0软件对该GST蛋白与拟南芥GST家族蛋白成员进行系统进化树分析,使用DNAMAN软件对该蛋白的分子量、等电点等进行预测,并对其氨基酸序列进行分析;采用荧光定量PCR检测该基因在不同组织中的表达以及该基因在盐、模拟干旱和苹果斑点落叶病原菌处理条件下的表达特性;克隆该基因的启动子,利用PlantCARE软件在线分析该基因启动子上的顺式作用元件。【结果】进化树分析显示该GST与拟南芥中GST家族的U亚家族成员亲缘关系最近,故被命名为MdGSTU1;MdGSTU1的CDS为666 bp,编码221个氨基酸残基,其蛋白分子量为25.41 kDa,等电点为5.28;RACE结果显示该基因3'UTR区域为135 bp;蛋白序列及结构分析显示,其与拟南芥GST家族蛋白相同,该蛋白也包含保守的谷胱甘肽-S-转移酶的N端及C端结构域;PCR结果显示,MdGSTU1在根、茎、叶、花、果各组织中均有表达,但根中的表达水平最高,同时,该基因能够被150 mmol·L^-1 NaCl和20%的PEG诱导表达,均在1 h时表达量达到最高值;另外,苹果斑点落叶病原菌也能诱导MdGSTU1的表达,表达量在病菌处理8 h时达到最大;启动子分析显示MdGSTU1启动子区域含有多个抗性相关的作用元件,其中包括ABA响应元件、厌氧响应元件、GA响应元件、SA响应元件、JA响应元件以及防御和逆境响应元件;此外,该启动子上还包含多个MYB转录因子结合位点。【结论】MdGSTU1属于植物tau亚家族（GSTU）成员,生物及非生物逆境胁迫均可诱导该基因的表达。     

荔枝抗坏血酸过氧化物酶cDNA的克隆和分析

[目的]为了对荔枝果皮中克隆的APX基因进行cDNA序列分析。[方法]采用RT-PCR和RACE技术从荔枝果皮中扩增克隆抗坏血酸过氧化物酶基因,利用NCBI的ORFFinder程序分析克隆基因的序列,然后将ORF转换成氨基酸序列,进行BLASTX和BLASTN分析,最后用dnasismax2.6pro软件将荔枝与胡瓜、加杨等8种植物进行APX氨基酸序列配比和进化树分析。[结果]该基因cDNA全长1118bp,含有645bp的ORF,编码214个氨基酸。它编码的氨基酸序列与胡瓜、加杨、龙眼、落花生、豌豆、芸苔、帕拉港橡胶树和紫花苜蓿编码的氨基酸序列的同源性分别为83%、89%、97%、78%、84%、75%、79%和85%。推测该蛋白的分子式为C1946H3249N645O827S142,相对分子质量为53466.5,等电点为5.16,理论推导半衰期大于10h。[结论]该基因的克隆与cDNA序列分析为采后荔枝果皮中抗坏血酸过氧化物酶的基因工程操作奠定了基础。     

草菇VEGF信号通路中vv-SPK基因的结构与表达分析

VEGF通路是一条调控细胞增殖、分化、迁移、应激反应以及生存的信号通路。本研究从草菇基因组中获得1个在VEGF通路中编码SPK蛋白的基因,将其命名为vv-SPK,并对该基因进行结构分析,结果显示:基因vv-SPK全长1 996bp,包含11个内含子;ORF长为1 401bp,编码466个氨基酸。通过BLASTP比对显示,vv-SPK基因与纹缘盔孢伞、双色蜡蘑以及紫蜡蘑的相似度最高;经过荧光定量PCR验证后发现,SPK蛋白的基因表达量与菌柄的伸长有关。根据SPK在VEGF通路中参与的细胞增殖途径以及SPK蛋白本身的激酶特性,推测其对草菇菌柄生长过程的细胞分裂和伸长有显著的促进作用,且草菇中可能存在SPK激酶介导的促进细胞增殖、伸长的信号通路。     

海蓬子DnaJ-like基因片段的表达和生物信息学分析

从盐生植物海蓬子的抑制消减杂交文库中克隆了DnaJ-like基因的长609 bp的DNA序列,编码1个202 aa的开放阅读框,Northern B loting显示该基因在检测子(200 mmol/L NaC l)中的表达显著增强。生物信息学分析表明,在蛋白质水平上,该片段与拟南芥和水稻的同源性分别为6 e-68和1 e-58;在核酸水平上,该片段与拟南芥的同源性为3 e-24。保守区分析显示,该片段含有DnaJ-like基因完整的J功能域(J-Dom ain,66 aa),功能域在蛋白质水平与GenBank两种相关类型的J功能域的同源性分别为1 e-11和9 e-15。这为该基因的克隆及研究其在植物逆境胁迫中的作用奠定了基础。