东方田鼠组织与血清中抗日本血吸虫相关蛋白的分离与筛选

本试验以兔、牛、人及感染日本血吸虫后小鼠血清蛋白为对照,分别提取东方田鼠和小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、皮肤、骨髓和脑组织蛋白,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,综合比较和筛选东方田鼠组织及血清中潜在的抗日本血吸虫相关蛋白组分。结果表明,随着感染日龄的增加,小鼠在感染日本血吸虫后12和45 d,其血清中85 ku附近蛋白质条带较东方田鼠表达量明显上调,且有继续升高的趋势;东方田鼠肝脏及血清中150 ku组分蛋白电泳条带与其他动物相同组织中相应蛋白质在表达量存在显著差异,蛋白质表达丰度高,该蛋白质组分可能与东方田鼠抗日本血吸虫作用相关。     

东方田鼠感染日本血吸虫前后血常规和血清生化指标的动态变化

东方田鼠具有天然抗日本血吸虫病特征,为了探索东方田鼠抗日本血吸虫机制,本研究分析了东方田鼠和小鼠感染日本血吸虫尾蚴前后血液细胞以及生化指标的动态变化。东方田鼠和BALB/c鼠定量感染日本血吸虫尾蚴,于感染后第0、1、3、5、8、12、16、21、28、35、42 d分别采集抗凝血和血清,进行血常规和血清生化分析。血常规检测结果表明,东方田鼠感染后第3~16 d,WBC数量显著升高(Neu数量显著升高),而小鼠血常规检测结果正常;血清生化结果显示,东方田鼠感染日本血吸虫后ALB、HDL-C显著升高,小鼠各指标变化不明显。本研究结果显示东方田鼠天然免疫细胞Neu和血清ALB可能与其抗日本血吸虫特性相关,对补体杀伤日本血吸虫机制研究具有重要的指导意义。     

感染日本血吸虫前后东方田鼠血清补体的动态变化和杀虫作用

东方田鼠是迄今为止发现的唯一一种具有天然抗日本血吸虫病特性的哺乳动物,但具体抗病机制尚不明确。本研究应用组织培养法比较了东方田鼠和BALB/c鼠感染日本血吸虫尾蚴后1、3、8、12、15 d的皮肤、肺脏和肝脏中童虫回收情况,结果表明东方田鼠对日本血吸虫的杀伤主要发生在感染后1～3 d和8～12 d。应用RT-PCR和ELISA检测东方田鼠和BALB/c鼠的补体相关分子C3、C9、CD59和DAF的转录水平,结果显示BALB/c小鼠各指标变化不明显,东方田鼠感染后8 d各因子转录水平显著升高。体外杀虫试验结果显示,东方田鼠正常血清和灭活补体血清孵育的日本血吸虫童虫死亡率分别为85.50%±7.15%和60.99%±8.61%,差异具有显著统计学意义(P 0.001)。结果表明东方田鼠补体对日本血吸虫童虫具有显著杀伤效果,东方田鼠早期对日本血吸虫的杀伤作用可能和补体相关。     

东方田鼠肺脏裂解物筛选日本血吸虫成虫噬菌体展示cDNA文库

目的寻找与东方田鼠抗性相关的血吸虫靶基因。方法以东方田鼠肺脏裂解物为探针,亲和淘洗筛选日本血吸虫成虫（44d）噬菌体展示cDNA文库。三轮筛选后．随机挑取76个阳性噬菌体克隆进行序列测定及生物信息学分析。结果共获得了13个有效EST序列,其中8条EST序列与已知基因或表达序列标签同源,5个EST序列与已知基因或表达序列标签均无同源性,为新的表达序列标签。功能预测结果显示．这13个有效EST编码蛋白主要与血吸虫基因表达调控及蛋白质加工修饰相关。结论东方田鼠直接或间接地影响血吸虫基因表达,进而影响血吸虫的发育,可能是东方田鼠具有抗血吸虫特性的一个重要分子机理。     

东方田鼠肝脏裂解物筛选日本血吸虫成虫噬菌体展示cDNA文库

东方田鼠对血吸虫具有天然抗性。为寻找东方田鼠抗血吸虫抗性相关靶基因，探索其分子机理，我们将日本血吸虫童虫与东方田鼠不同组织／器官裂解物共培养，比较它们对血吸虫童虫的杀伤效果，之后，以杀伤效果较好的肝脏裂解物为探针，以亲和淘洗方法筛选日本血吸虫成虫（44d）噬菌体展示cDNA文库。经三轮筛选后，随机挑取92个噬菌体克隆进行序列测定及生物信息学分析，获得了19个有效EST序列，其中15条EST序列与已知基因或表达序列标签同源，4个EST序列与已知基因或表达序列标签均无同源性，为新的表达序列标签。对19个有效EST编码蛋白的功能预测结果显示，其中6个为卵壳蛋白（Eggshell protein）相关基因，10个EST及其编码蛋白的功能与血吸虫基因表达调控及蛋白质加工修饰相关。研究结果提示，东方田鼠直接或间接地影响血吸虫基因表达，进而影响血吸虫的发育，可能是东方田鼠具有抗血吸虫特性的一个重要分子机理。     

东方田鼠抗日本血吸虫抗体水平检测与分析

东方田鼠具有抗日本血吸虫病的特性，观察东方田鼠感染日本血吸虫尾蚴后的特异性抗体水平变化，可为阐明其抗病机制提供依据。本试验用间接ELISA方法检测东方田鼠抗成虫可溶性抗原（SWAP）和几种日本血吸虫基因重组抗原（Sj28-GST、LHD-SjTP1、C-SjParamyosion）的特异性抗体水平动态变化，并检测东方田鼠感染日本血吸虫尾蚴前、后的IgG3亚类特异性抗体水平。结果东方田鼠在攻击日本血吸虫尾蚴后，抗SWAP的特异性抗体水平有所升高，而抗几体基因重组抗原的特异性抗体水平低，没有显著变化。东方田鼠正常血清中抗SWAP和IgG3亚类抗体的OD值是牛血清白蛋白（BSA）对照的31倍。结果表明，在东方田鼠血清中有较高水平的SWAP的IgG3亚类抗体，值得进一步深入探讨。     

牦牛日本血吸虫Sjp38MAPK基因克隆、原核表达及免疫保护效果研究

为了分析牦牛日本血吸虫Sjp38MAPK重组蛋白的免疫效果,试验采用RT-PCR方法克隆出牦牛日本血吸虫Sjp38MAPK基因,构建重组表达载体pET-30a(+)-Sjp38MAPK,转化到BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,采用SDS-PAGE和Western-blot方法检测其蛋白的表达情况。结果表明,获得约为55 ku的重组蛋白rSjp38MAPK,表达的重组蛋白Sjp38MAPK能被感染日本血吸虫的阳性血清识别,具有免疫原性。用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠后,以临床分离的日本血吸虫尾蚴腹部贴片攻毒,发现重组蛋白免疫组能降低小鼠的减虫率和肝脏减卵率,可诱导产生特异IgG抗体,具有较好免疫保护效果。这为进一步研究Sjp38MAPK蛋白功能及研制基因疫苗奠定基础。     

东方田鼠抗日本血吸虫病现象的观察

本试验分别应用１０００条、２００条和４０条日本血吸虫尾蚴人工攻击感染东方田鼠,金黄地鼠和Ｂａｌｂ／ｃ小鼠,在攻击后第１、２、３、４、７、９、１２、１５、１６、１８、１９、２１、２２、２４、４２天时分别将其剖杀,集虫、观察。结果观察到血吸虫在东方田鼠体内不能发育成熟,在攻击后１９天时虫体已全部死亡。而黄金地鼠和Ｂａｌｂ／ｃ小鼠的虫体回收率分别为６５％和６０．６％。在虫体移行时,东方田鼠肺组织和肝组织     

东方田鼠与昆明小鼠胚胎成纤维细胞体外分离和培养比较研究

为了进一步从细胞水平深入研究东方田鼠抗日本血吸虫机制提供试验材料,以及经济可靠地保存野生东方田鼠的生物活性细胞,试验采用胰蛋白酶消化法和组织块贴壁法,分别取妊娠12 d的东方田鼠和昆明小鼠胚胎组织,体外分离、培养成纤维细胞,观察比较不同培养方法、胰蛋白酶浓度、消化时间、传代次数及冻存复苏等因素对分离和培养两种胚胎成纤维细胞的影响,实时观察比较两种细胞生长特性。结果表明:组织块贴壁法和胰蛋白酶消化法均能在体外条件下较好地分离、培养两种胚胎成纤维细胞;采用0.125%胰蛋白酶37℃消化组织10 min,分离的细胞普遍密度大、活力好、贴壁细胞多、速度快,是实验室分离12 d胎龄东方田鼠与小鼠胚胎组织最佳胰酶浓度;昆明小鼠胚胎成纤维细胞较东方田鼠胚胎成纤维细胞足丝长而明显,细胞核较小;两种细胞冻存后生长及活率无显著差异;在含10%血清浓度培养体系中,东方田鼠胚胎成纤维细胞生长速率慢于昆明小鼠胚胎成纤维细胞,生理代数分别为8代和7代,其中2～5代增殖旺盛。说明东方田鼠和昆明小鼠胚胎成纤维细胞在体外分离方法上差异不显著,而两者在生物学特性方面存在一定种属差异。     

感染日本血吸虫小鼠肝脏miR-17-92簇表达变化的研究

研究表明miR-17-92簇在诸多生命进程中发挥着重要作用。本研究目的是分析感染日本血吸虫小鼠肝脏不同时期miR-17-92簇的表达水平及其靶基因蛋白水平的表达变化,为进一步研究肝脏病理损害的分子机理奠定基础。q RT-PCR分析表明miR-17-92簇在感染日本血吸虫小鼠肝脏的不同感染时期呈现差异变化,随着时间延长呈现升高趋势;q RT-PCR和免疫印迹分析表明miR-17-92簇靶基因在感染日本血吸虫小鼠的肝脏呈现差异变化,进一步研究表明感染日本血吸虫小鼠血浆中miR-17-92簇的丰度也呈现差异变化。研究提示miR-17-92簇在血吸虫感染的终末宿主的肝脏病理损害中可能发挥重要的调控作用,也有可能成为血吸虫病引起宿主肝脏病变损伤诊断的新型标识分子。     

东方田鼠重复感染日本血吸虫试验研究初步

本试验以1000条日本血吸虫尾蚴同时攻击感染东方田鼠洞庭湖种群和东方田鼠宁夏指名亚种进行重复感染对比试验，并在攻击后不同天数分别同时解剖相数目的两种群东方田鼠，收集其体内不同时段，不同部位的日本血吸虫童虫，比较结果证实东方田鼠对日本血吸虫具有天然的抗性，其抗性是可遗传的，不以东方田鼠的地域分布不同、生活环境的差异或传代数目的变化而有所不同，与获得必免疫无关。     

Clinical and pathologic features of experimental Schistosoma japonicum infection in pigs

Nine piglets, 2-5 months old and weighing 12-15 kg were infected percutaneously with 5000 to 6000 cercariae of Schistosoma japonicum. Three similar piglets which were not infected served as controls. Infected animals were necropsied at 5, 10, 30, 40, 59, 90, 120, 150 and 180 days post-infection (PI) and the controls at 5, 60 and 180 days PI. The prepatent period varied from 27 to 33 days after infection. Clinical signs observed, coincident with egg production, were loss of appetite, lethargy, pallor of mucous membranes, diarrhea, progressive emaciation and dehydration. One piglet was moribund when killed for necropsy at 40 days and another piglet died 59 days PI. Pathological changes induced by S. japonicum included erythematous papules on the site of inoculation, petechial hemorrhages in the lungs, catarrhal to hemorrhagic enteritis, bluish-gray discoloration of the liver, and egg granulomas in the liver, lungs, spleen, intestines, pancreas and mesenteric lymph nodes. Endophlebitis with intimal hyperplasia was occasionally observed in veins harboring adult schistosomes.     

日本血吸虫重组IAP蛋白的免疫保护效果评估

为研究日本血吸虫凋亡蛋白抑制因子（inhibitor of apoptosis protein of Schistosoma japonicum,SjIAP）重组蛋白诱导BALB/c小鼠的免疫保护效果,利用PCR技术扩增SjIAP基因,构建重组表达质粒pET-28a（＋）-SjIAP,诱导表达重组SjIAP蛋白,并利用重组蛋白制备兔源多克隆抗体血清。然后,选用SjIAP重组蛋白免疫BALB/c小鼠,利用ELISA检测免疫小鼠血清中的特异性抗体水平,以及免疫小鼠脾脏淋巴细胞在SjIAP重组蛋白刺激后产生的细胞因子水平。强化免疫后,将小鼠进行血吸虫尾蚴攻虫试验,感染38 d,进行剖杀,计算虫体减虫率及肝脏减卵率。Western blot结果表明本研究制备的兔源多抗血清能特异性识别SjIAP重组蛋白。ELISA检测表明免疫SjIAP重组蛋白可诱导较高水平的IgG及IgG亚型（IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3）抗体和IFN-γ、IL-2及IL-4细胞因子。动物试验表明,免疫SjIAP重组蛋白的小鼠与PBS组相比分别获得了31.5%的减虫率和37.2%的肝脏减卵率。免疫SjIAP重组蛋白能诱导小鼠获得一定减虫和减卵保护效果,提示血吸虫凋亡蛋白抑制因子可作为抗血吸虫病的疫苗候选分子。     

鼠源重组UBC13蛋白对脂多糖诱导的小鼠急性炎症的影响

试验旨在探讨鼠源重组UBC13蛋白对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的小鼠急性炎症的影响。将24只SPF雌性小鼠随机分成4组:PBS组,LPS模型组,重组UBC13蛋白高、低剂量组(分别为100和25μg/只),每组6只。LPS模型组与各蛋白剂量组腹腔注射20 mg/kg LPS,PBS组腹腔注射等体积PBS;注射结束1 h后,各蛋白组按相应剂量背部皮下多点注射重组UBC13蛋白,PBS组与LPS模型组注射等体积PBS。给予蛋白24 h后处死小鼠。收集小鼠肺脏、脾脏、胸腺及肝脏组织,计算脏器指数,HE染色观察组织病理学变化,实时荧光定量PCR检测肺脏、脾脏、胸腺和肝脏中IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA的相对表达量,以及肺脏中iNOS mRNA的相对表达量,综合评价鼠源重组UBC13蛋白对LPS诱导小鼠急性炎症的影响。结果显示,与PBS组相比,LPS模型组小鼠肺脏、脾脏及肝脏指数均显著或极显著升高(P<0.05;P<0.01),且肺脏、脾脏和肝脏组织均出现病理变化。实时荧光定量PCR结果显示,与PBS组相比,LPS模型组肺脏、脾脏、胸腺和肝脏中IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA相对表达量均极显著升高(P<0.01),肺脏中iNOS mRNA相对表达量也极显著升高(P<0.01);与LPS模型组相比,UBC13蛋白高剂量组肺脏、脾脏和肝脏中病理变化明显改善,肺脏、肝脏、脾脏中IL-1β、TNF-α、IL-6及肺脏中iNOS mRNA表达量均极显著降低(P<0.01);胸腺中TNF-αmRNA表达量显著降低(P<0.05),IL-6 mRNA和IL-1β表达量极显著降低(P<0.01)。表明鼠源重组UBC13蛋白可下调炎性因子的表达,从而改善LPS诱导的小鼠急性炎症反应。     

单性血吸虫带虫免疫对继发血吸虫病的影响

研究表明,辐照致弱血吸虫尾蚴疫苗能够诱导宿主产生较高的免疫保护作用,是所有血吸虫候选疫苗中保护力最强的,且辐照致弱尾蚴在宿主体内不能发育成熟,不会对宿主造成严重的病理损害。单性感染的血吸虫同样不能在宿主体内发育成熟,其发育状态停留在童虫阶段,也不会对宿主造成严重的病理损害,在童虫状态下对宿主持续进行的免疫刺激,是否也能诱导宿主对继发血吸虫病产生较高的免疫保护作用呢？为此,本研究通过让宿主携带单性血吸虫雄虫的带虫免疫方式来检测其对继发血吸虫病的影响。选用雄性血吸虫尾蚴感染BALB/c小鼠（100条/只）,于单性血吸虫尾蚴攻击后第5、7 w用吡喹酮进行治疗（300mg/kg）,第9 w进行雌雄血吸虫混合尾蚴攻击实验动物（40条/只）,第15 w剖杀实验动物,收集宿主荷虫、宿主肝卵负荷、肝卵孵化、宿主肝单卵肉芽肿体积数据,并检测宿主血清特异性抗体变化趋势。结果表明单性带虫免疫可以引起宿主肝虫卵孵化率及组织病理损伤显著降低,对宿主有一定的免疫保护效果。     

Autoradiographic quantification of the efficacy of niridazole in mice infected with 75Se-labelled cercariae of Schistosoma mansoni.

The effects of the anti-schistosomal drug, niridazole, on the migration of Schistosoma mansoni larvae, biosynthetically radioisotope-labelled with 75[Se]-selenomethionine, was evaluated by autoradiography of compressed tissues of mice treated daily from Days 6 to 10 post-infection with 200 mg kg-1 niridazole. The results were compared with the migration of schistosomula in untreated controls. The distribution of schistosomula was altered in niridazole-treated mice, where there was a delayed migration from the lungs relative to the controls and significantly fewer schistosomula in total appeared to reach the liver. The total percentage of schistosomula detected as autoradiographic foci was significantly lower in treated mice than in the untreated controls. Niridazole-treated mice were free of any foci 10 days after the last treatment and no adult worms were recovered on perfusion of the hepatic portal system relative to control mice from which 5.8% of the infective cercariae were recovered as adult worms at Day 42 post-infection.