红毛鸭胚源鹅细小病毒江西株的分离鉴定与NS基因的分析

自死亡的红毛鸭胚中分离获得1株病毒株(命名为JX-JA-2017株),经胶体金试纸条检测呈鹅细小病毒(GPV)阳性,经中和试验测定可被GPV阳性血清特异性中和,表明该毒株为GPV。对其进行非结构基因(NS)特征分析发现,其NS基因与GenBank登入的13株鹅细小病毒核苷酸序列同源性为94%～99.6%,氨基酸同源性为94.8%～99.5%;经分子进化分析发现,该株病毒与亚洲型GPV分离株共处于一个进化分支。以上结果揭示,红毛鸭胚存在GPV感染,且其JX-JA-2017株病毒与经典的GPV具有共同的遗传起源,丰富了GPV的流行病学与分子生态学内涵,为加强我国鹅细小病毒病的防控提供科学依据。     

一株鹅星状病毒的分离鉴定

为了研制预防鹅痛风病的鹅星状病毒(Goose astrovirus,GAstV)疫苗及卵黄抗体,试验对黑龙江省某养鹅场疑似痛风死亡鹅的肝脏及肾脏组织进行了病原分离,并对分离病毒进行了鹅胚传代、RT-PCR检测、核苷酸序列测定与比对、病毒含量测定及动物回归试验。结果表明:试验分离得到一株鹅星状病毒;分离毒株可致传代鹅胚100%死亡;鹅胚传代尿囊液的RT-PCR检测为阳性;阳性产物核苷酸序列与鹅星状病毒AHDY株基因(登录号为MH410610.1)和FLX株基因(登录号为KY271027.1)核苷酸序列的同源性分别为98%和93%;分离株病毒含量为1×10~(4.83)ELD_(50)/0.2 mL;2日龄健康易感雏鹅接种分离毒株48 h后陆续死亡,剖检表现为心脏、肝脏与输尿管尿酸盐沉积及肾脏出血肿胀,与自然发病雏鹅症状一致。说明该分离毒株为导致雏鹅痛风病的病原,可作为研制鹅星状病毒疫苗及卵黄抗体的候选毒株。     

1株新型鸭呼肠孤病毒(SL株)的全基因组测定分析及其致病性

为明确我国川渝地区鸭疑似呼肠孤病毒病的致病原,本试验对患病鸭进行病毒的分离、鉴定、全基因组测序分析及致病性试验。首先针对临床肝脾肿大、出血坏死为主要特征的病例,利用鸭胚传代法进行病毒的分离,结合RT-PCR方法鉴定分离毒株;其次利用二代测序技术对分离毒株进行全基因组测序,利用MEGA X软件对序列进行比对和分析;最后将分离毒接种7日龄健康雏鸭,观察其病死率及肝脏、脾脏组织的病理变化。结果发现F6代病毒能够稳定适应鸭胚,RT-PCR鉴定为呼肠孤病毒,对鸭胚的半数致死量(ELD₅₀)为10^-5.32/0.2 mL,分离毒命名为SL株。全基因测序显示该毒株全长23 580 bp, GC含量49.62%,共分10个节段,分别为L1～L3、M1～M3和S1～S4(GenBank登录号：MW196679～MW196688)。序列分析显示SL株与新型鸭呼肠孤病毒(novel duck reovirus, NDRV)具有较高的相似性,为87.02%～99.48%;与番鸭呼肠孤病毒(MDRV)的相似性次之,为80.09%～98.77%;而与鸡源呼肠孤病毒(AR...     

鸭源新型鹅细小病毒的分离鉴定与VP1基因序列分析

为确定发病鸭场的致病原,掌握该致病原的遗传进化特征,研究从山东省某鸭场采集到1份短喙与矮小综合征(SBDS)疑似病例病料,采用永生化鹅胚上皮细胞系(GEEC)对病料进行病毒分离培养,观察细胞病变,测定分离毒株的血凝性、病毒滴度(TCID50)、对鸭胚的致病性,并进行VP1基因序列比对及相似性分析。结果显示：临床病料分离培养的病毒可引起GEEC出现细胞明显皱缩、聚集、折光性增强等典型细胞病变,表明分离到一株鸭源NGPV毒株,命名为SDHZ株,该病毒对1%鸡红细胞无凝集性,TCID50高达10^-6.25/mL,鸭胚半数致死量(ELD₅₀)为10^-4.5/mL,接种鸭胚死亡出现全身及肝脏出血、短喙、发育迟缓等典型症状,VP1基因序列与樱桃谷鸭中分离的新型鹅细小病毒(NGPV)相似性为95.3%～98.0%,与GPV经典毒株的相似性为89.3%～94.6%。表明该鸭场本次疫病病原为NGPV,为进一步研究NGPV致病机制及制定综合防控措施提供参考。     

鸭甲型肝炎病毒JS2013株的鸭胚适应性与基因组分析

鸭甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus,DHAV)是引起雏鸭病毒性肝炎的主要病原之一。本研究将2013~2015年分离的5株DHAV进行了鸭胚传代复苏,发现JS2013株的鸭胚适应性最好,可导致鸭胚在接毒后2~5d出现有规律的死亡。应用血凝试验和PCR方法进行了鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭瘟病毒(DPV)和鸭圆环病毒(Du CV)等的检测,结果均为阴性。将DHAV JS2013株继续在鸭胚传代并测定其病毒滴度,发现其在5至8代之间病毒滴度稳定提升,第8代病毒的ELD50为10-7.5/0.1m L,但8至20代没有出现有规律的病毒滴度提升。为了揭示DHAV JS2013株的基因组特征,应用RT-PCR方法分9段扩增了病毒基因片段,通过序列拼接获得了全基因组序列,Gen Bank登录号为KP721458。同源比对发现,与DHAV JS2013株基因同源性最高的毒株属于基因I型DHAV。将其编码多聚蛋白的序列与同源性最高的10株已登录序列的DHAV毒株进行比对,发现存在8处氨基酸位点变异。该研究探明了DHAV JS2013株在鸭胚的增殖特性及其基因特征,为研制新型鸭肝炎病毒灭活疫苗奠定基础。     

1株新型鸭呼肠孤病毒的分离与鉴定

山东某鸭场疑似发生新型鸭呼肠孤病,从采集的病料组织样品中分离出1株病毒,经一步法RT-PCR扩增得到新型鸭呼肠孤病毒部分S3基因序列,克隆到p MD18-T载体中,经序列测定,与Gen Bank上的毒株序列进行比对,并做了该病毒的致病性试验。结果显示,该分离株与参照的新型鸭呼肠孤病毒同源性为100%,并对鸭具有一定的致病性。本试验成功分离获得1株新型鸭呼肠孤病毒山东地方流行毒株。     

1株基因Ⅶ型新城疫病毒的生物学特性研究及全基因组序列分析

为研究当前流行的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)基因型、致病性及其与传统新城疫病毒疫苗株(La Sota等)的核苷酸差异,试验从某发病鸡场病死鸡体内分离到1株疑似NDV毒株,经红细胞凝集试验(HA)和红细胞凝集抑制试验(HI)初步确定为鸡源NDV。参照GenBank公布的NDV F基因部分片段(登录号:JF950510.1)设计1对引物,通过RT-PCR技术扩增分离株的F基因并克隆、测序,测序结果与NCBI中NDVF基因序列进行比对,构建系统进化树并分析其基因型;通过测定鸡胚平均致死时间(MDT)、1日龄鸡脑内致病指数(ICPI)和6周龄鸡静脉致病指数(IVPI)判断病毒致病性;参照GenBank公布的NDV全基因组序列(登录号:JF950510.1)设计9对引物对分离株进行全基因组序列测定,并分析其基因组结构。结果表明,RT-PCR扩增得到F基因长约500bp,基于F基因构建的系统进化树显示分离株为基因Ⅶ型NDV;MDT、ICPI和IVPI分别为52.8h、1.675和2.46,表明分离株属于强毒株。全基因组序列分析显示,分离株全基因组全长15 192bp,与传统La Sota株基因组相比,序列多出6个碱基,核苷酸序列同源性82.8%。本研究成功分离到1株基因Ⅶ型NDV强毒株,且与传统疫苗毒株La Sota的核苷酸序列同源性差异较大。     

鹅源新城疫病毒的分离鉴定及其致病性

从吉林省某发病鹅场分离到1株病毒,经血凝、血凝抑制试验和RT-PCR鉴定证实,该毒株为新城疫病毒,命名为MHK-1株.毒力测定结果表明,该病毒的鸡胚平均死亡时间(MDT)为43 h,1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)为1.63,鸡胚半数致死量(ELD50)为10-8.3/0.2 mL,表明该毒株为新城疫病毒强毒株.经致病性试验表明,该病毒对鹅有很强的致病性.分子病毒学分析表明,MHK-1株F基因裂解位点的氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117,符合强毒株氨基酸序列特点.     

2013年苏皖地区鹅细小病毒的分离鉴定及其VP3基因序列分析

鹅细小病毒(GPV)主要引起雏鹅和雏番鸭的高死亡率。本研究对2013年采集的苏皖地区疑似GPV感染的病鹅组织,通过鹅胚病毒分离以及PCR扩增,共分离鉴定出11株GPV病毒。这11株GPV病毒的鹅胚致死时间为43¹59h。与NCBI中检索到的21个VP3进行的序列分析发现,这些GPV的VP3氨基酸同源性为97.2%159h。与NCBI中检索到的21个VP3进行的序列分析发现,这些GPV的VP3氨基酸同源性为97.2%¹00%。进化树分析表明,新分离的GPV VP3与分离于1982年的台湾GPV毒株82-0308最接近。与其他分离株VP3比较,这11株中有3株VP3中存在N35D、V261L、Y293H共突变现象。这些苏皖地区GPV毒株的分离、鉴定以及序列特征,对进一步探究苏皖地区GPV病毒的分子演化特征以及流行病学提供了材料。     

鸭坦布苏病毒江苏XZ株的分离和鉴定

从江苏徐州地区分离到的以引起樱桃谷鸭产蛋下降和死亡为特征的1株病毒,命名为XZ株。对该病毒进行电镜观察、血凝试验、ELD₅₀测定、RT-PCR扩增特异性目的基因、序列比对分析和动物回归试验。结果显示,分离毒株能致死鸭胚和鸡胚,电镜下观察到球形病毒粒子,不具有血凝性,对病料和接毒鸭胚尿囊液进行RT-PCR,均可扩增出基因片段,其核苷酸序列与坦布苏病毒奉贤株的相似性最高,为98.7%,与其他坦布苏病毒的毒株也具较高同源性,为86%~98%。用鸭胚分离毒株接种健康产蛋鸭,能复制出同样的疾病。结果表明分离病毒为鸭黄病毒属的坦布苏病毒。     

鸭黄病毒感染逆转录半套式PCR检测方法的建立

根据GenBank发布的黄病毒Bagaza毒株的NS3基因的保守序列设计了3条引物,建立了一种适用于鸭黄病毒的半套式PCR快速检测方法。采用该方法对鸭黄病毒山东分离株进行检测,结果半套式PCR对2株分离株均能扩增出277bp的特异性条带,而对鸭瘟病毒、禽流感病毒（H9亚型）、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、减蛋综合征病毒的扩增结果均为阴性;经检测该方法第1次扩增的敏感性为1×105拷贝/μL,第2次扩增的敏感性为1×102拷贝/μL,第2次扩增的敏感性比第1次高103倍;该方法对山东省各地采集的24份疑似病料可检出22份阳性。表明本试验所建立的套式PCR方法可用于鸭黄病毒感染的临床诊断和流行病学调查。     

广东地区鸭黄病毒JM株的分离和初步鉴定

2010年4月以来,我国部分地区陆续发生以产蛋鸭产蛋急剧下降为特点的疾病。从广东省江门地区某鸭场的发病鸭群采集样品,接种鸭胚后分离到一株病毒,并命名为JM株,经RT-PCR检测为黄病毒核酸阳性。序列测定后分析显示,该分离株JM株与黄病毒属Tembusu病毒的对应序列相似性最高,其中与Tembusu病毒JS804株相似性最高达98%。结果表明,JM株为黄病毒,与该病鸭产蛋急剧下降有关。     

猪源副黏病毒HX01株分离鉴定、全基因测序与遗传变异分析

从陕西省户县某猪场患流感样症状病死仔猪肺脏分离得到1株副黏病毒,命名为猪源副黏病毒（PPMV）HX01株,对分离毒株鉴定后进行部分生物学特性研究和全基因测序分析。参考PPMV JL-1株基因组序列设计10对引物,对PPMV HX01株分段扩增并测序,将测序成功的各序列依次拼接得到全基因序列并进行序列比对。该病毒MDT为91.2h,ICPI和IVPI为0,EID50为10-10.25/mL,表明该毒株属于新城疫弱毒株。序列分析结果表明,PPMV HX01株（全基因序列GenBank登录号：JF795531）与NDV参考毒株全基因核苷酸同源性83.3%～99.8%,该病毒与基因Ⅱ型我国传统弱毒疫苗株La Sota全基因水平和各个基因编码开放阅读框的同源性均在99.5%以上,而与基因Ⅸ型国家标准强毒株F48E9和目前流行的基因Ⅶ型毒株亲缘关系较远。     

肉鸭中黄病毒的分离与鉴定

为探索2011年年底在广东阳江地区某肉鸭场出现的病鸭和死鸭的发病原因,对其中2个发病鸭场的病死鸭进行了解剖,对病变组织的样品应用RT-PCR的方法进行了病原鉴定。经剖检,发现鸭心脏表面形成小结节,伴有少量心包积液;肝脏和胆囊肿大;脾脏有花斑;胰腺和直肠有出血点。利用病料研磨上清和病料接种后的鸡胚尿囊液进行RT-PCR检测,结果显示鸭黄病毒阳性。序列分析显示,该病毒的核苷酸序列与坦布苏病毒Fengxian株的相似性为99%。试验结果表明,该病毒为黄病毒,是引起此次鸭场发病的病原。     

禽黄病毒套式RT-PCR检测方法的建立及应用

禽黄病毒病是新发的一种疫病,可引起鸭、鹅和鸡等家禽产蛋和采食量下降及死亡。本研究旨在建立一种快速诊断方法用于临床诊断及流行病学调查。根据GenBank发表的鹅黄病毒JS804株全基因序列,应用Primer Premier 5.0软件设计了2对特异性引物,建立了禽黄病毒套式RT-PCR检测方法。结果:该套式RT-PCR方法具有特异性强、敏感性高的特点,最低病毒检测量为101.89TCID50/0.1 mL,比普通RT-PCR方法敏感性高1 000倍。应用该方法对江苏地区疑似禽黄病毒病的70份鹅病料、4份鸭病料、12份鸡病料进行检测,总阳性率为58.14%,而用普通RT-PCR方法检测的阳性率仅为17.44%。结果表明,禽黄病毒套式RT-PCR检测方法具有快速、特异、敏感的特点,可用于禽黄病毒感染的临床诊断和流行病学调查。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒SH株全基因组序列测定与分析

本研究从上海市某鸭场发病鸭群中分离到1株DHV-1型强毒株,对其进行毒价测定、琼脂扩散试验和动物回归实验,结果显示：按103.41 ELD50/0.2 mL接种1日龄雏鸭,该毒株对雏鸭有明显的致病性,死亡率为60%,肝脏病变率为100%。经全基因组测序显示：该毒株长度为7652 nt,含626 nt的5＇非编码区和314 nt的3＇非编码区,编码一个2249 aa大小的多聚蛋白。根据Blast比对发现,该毒株属于经典的DHV-1A群,与韩国经典强毒株R85952（99.7%）和中国分离强毒株HP-1（99.3%）的同源性最高。     

1株基因Ⅶ型新城疫病毒的生物学特性研究及全基因组序列分析

为研究当前流行的新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）基因型、致病性及其与传统新城疫病毒疫苗株（La Sota等）的核苷酸差异,试验从某发病鸡场病死鸡体内分离到1株疑似NDV毒株,经红细胞凝集试验（HA）和红细胞凝集抑制试验（HI）初步确定为鸡源NDV。参照GenBank公布的NDV F基因部分片段（登录号：JF950510.1）设计1对引物,通过RT-PCR技术扩增分离株的F基因并克隆、测序,测序结果与NCBI中NDV F基因序列进行比对,构建系统进化树并分析其基因型;通过测定鸡胚平均致死时间（MDT）、1日龄鸡脑内致病指数（ICPI）和6周龄鸡静脉致病指数（IVPI）判断病毒致病性;参照GenBank公布的NDV全基因组序列（登录号：JF950510.1）设计9对引物对分离株进行全基因组序列测定,并分析其基因组结构。结果表明,RT-PCR扩增得到F基因长约500 bp,基于F基因构建的系统进化树显示分离株为基因Ⅶ型NDV;MDT、ICPI和IVPI分别为52.8 h、1.675和2.46,表明分离株属于强毒株。全基因组序列分析显示,分离株全基因组全长15 192 bp,与传统La Sota株基因组相比,序列多出6个碱基,核苷酸序列同源性82.8%。本研究成功分离到1株基因Ⅶ型NDV强毒株,且与传统疫苗毒株La Sota的核苷酸序列同源性差异较大。     

探针检测鸭黄病毒的地高辛标记DNA的制备与应用

利用RT-PCR方法扩增鸭黄病毒的NS3基因406bp的特异性片段,回收并纯化PCR产物,用地高辛标记,制备核酸探针。特异性试验结果表明,该探针仅与鸭黄病毒的核酸特异性杂交,而与鸭瘟病毒、H9N2禽流感病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、减蛋综合征病毒的核酸杂交均为阴性。敏感性试验表明,该探针对鸭黄病毒的RNA最低检出限量为100μg/L。对疑似黄病毒感染鸭的肝脏、肺脏、脾脏、输卵管、卵泡膜和泄殖腔棉拭子进行检测,以卵泡膜的检出率最高。该研究为鸭黄病毒感染的诊断和流行病学调查提供了一种可靠的方法。     

鸭源新城疫病毒对鹅的致病性试验

鸭源新城疫病毒（NDV）SDFC株通过静脉注射、肌肉注射、点眼滴鼻3种途径人工感染15日龄健康雏鹅,观察试验鹅的发病情况及临床症状,于感染后不同时间剖杀,观察各组织器官的主要剖检变化,并进行病理组织学研究,同时对病毒在组织中的抗原分布进行检测。结果显示,试验鹅感染鸭源NDV后发病率达100%,静脉注射组死亡率为80%,肌肉注射组死亡率为40%,点眼滴鼻组死亡率为26.7%。病鹅表现下痢、流泪,部分出现瘫痪、扭头、角弓反张等神经症状;剖检变化表现为胰腺、脾脏有大小不等的白色坏死灶,胸腺、法氏囊萎缩,心包积液,肠道、肝脏、肺脏、肾脏出血;病理组织学变化表现为胸腺、脾脏、法氏囊等器官内淋巴细胞坏死、崩解,心脏、肺脏、肝脏、肾脏广泛性出血、变性;抗原分布检测结果显示,病毒在病鹅体内多个组织器官中分布。试验结果表明,鸭源NDV对鹅具有较强的致病性。