应用PCR法检测禽源生物制品中禽网状内皮组织增生症病毒

为了快速、准确检测禽源生物制品中的禽网状内皮组织增生症病毒,根据GenBank中登录的REV参考毒株LTR基因序列,利用Primer Premier5.0软件设计合成了1对特异性引物,其扩增产物长度为314bp,建立了PCR法。经与间接免疫荧光法进行同步比较试验,发现结果吻合性较高,而且PCR法的结果更为直观,易于判断,样品保存方便,重检也方便,当日即可完成,显示出了较好的可行性。     

双重PCR检测禽源生物制品中禽网状内皮组织增生症病毒和禽白血病病毒

为了快速、准确检测禽源生物制品中的禽网状内皮组织增生症病毒(REV)和禽白血病病毒(ALV),根据GenBank中登录的REV参考毒株LTR基因序列和ALV P27基因序列,设计合成2对特异性引物。在建立各病毒单项PCR检测技术的基础上,优化反应条件,建立2种病毒的双重PCR检测方法。结果:可同时扩增REV的467 bp和ALV的675 bp的特异性片段,而对其他5种禽病病原的PCR扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明,该双重PCR技术能检出10 pg的ALV和10 pg的REV模板。用双重PCR技术与REV的间接免疫荧光法及ALV ELISA对245份疫苗株检测,进行同步比较,结果总符合率为100%。表明建立的双重PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,对这2种外源病毒的同时检测,显示出了较好的可行性。     

SYBR GreenⅠ实时荧光PCR法检测禽活疫苗中禽网状内皮组织增生症病毒

为快速、准确检测禽活疫苗中的禽网状内皮组织增生症病毒(REV),根据REV p30基因上的一段保守序列,利用Primer Premier 5.0软件设计合成了1对特异性引物,建立了基于SYBR Green I模式的实时荧光PCR方法,并以常规PCR产物为标准品绘制了标准曲线,对方法的特异性、敏感性、重复性、与经典方法的符合率进行了评价。结果表明:扩增产物片段大小为222 bp,与预期片段大小相符,测序结果证实为REV靶序列;标准曲线具有良好的线性关系,相关系数为1.0,扩增效率为94.2%,溶解温度Tm=(86.0±0.50)℃,无引物二聚体;该方法只从REV阳性样本检出扩增信号,其他病原无扩增信号,特异性好;最低可检测26.97拷贝数的阳性标准品,比常规PCR敏感1000倍;组内变异系数、组间变异系数分别为0.79%~5.36%,1.61%~5.25%。运用建立的实时荧光PCR方法对17批禽用活疫苗进行检测,并与间接免疫荧光法(IFA)进行同步比较试验,结果两者符合率为100%。且实时荧光PCR法更快捷、更方便,结果判定更为直观可用于疫苗中REV污染情况的监测。     

基于hexon基因的Ⅰ群禽腺病毒PCR快速检测方法的建立和应用

根据Gen Bank公布的Ⅰ群禽腺病毒hexon基因保守序列,设计了1对引物,建立了检测Ⅰ群禽腺病毒PCR检测方法,并对其特异性、敏感性进行了研究。该PCR方法对Ⅰ群禽腺病毒扩增结果为阳性,对照毒株扩增结果均为阴性,对Ⅰ群禽腺病毒检测的灵敏性为1pg总DNA量。以上结果表明该PCR方法特异性强、敏感性高、简便及快速,可用于Ⅰ群禽腺病毒的早期确诊和病毒鉴定。     

鸭疫里默氏杆菌混合感染禽致病性大肠杆菌的分子检测与敏感药物快速筛选的研究

针对禽致病性大肠杆菌的F菌毛、P菌毛和HPI设计了三对引物,又在鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白保守区设计了一对特异性引物,建立检测鸭疫里默氏杆菌混合感染禽致病性大肠杆菌的多重PCR方法,并对临床采集的病死鸭病料组织进行检测,结果表明不同样品均可扩增出420bp、700bp、287bp、592bp的特异性目的条带,而对鸭源多杀性巴氏杆菌、鸭源沙门氏菌的扩增结果均为阴性,说明该多重PCR方法具有较好的特异性,可用于快速鉴定鸭疫里默氏杆菌混合感染禽致病性大肠杆菌,也适用于病料的直接检测。利用建立的PCR方法对临床病料进行分子检测,并对检测为阳性的菌株进行药物敏感试验。     

禽衣原体病诊断技术简述

禽衣原体病(AC)由细菌门鹦鹉热嗜性衣原体引起,禽衣原体株可引起人严重发病甚至死亡。细胞培养是分离鹦鹉热衣原体最方便的方法,鸡胚仍在用于衣原体的初级分离,PCR技术对动物组织中衣原体的检测已经取代病原分离。PCR敏感性和特异性通常超过病原分离的敏感性和特异性,巢氏PCR和实时PCR可以与病原分离方法一样敏感。检测衣原体抗体的标准血清学方法是补体结合(CF)试验,改良过的直接CF试验可以与多种血清配合应用。其他血清学试验方法如ELISA、乳胶凝集试验、原生小体凝集试验、微量免疫荧光试验及琼脂免疫扩散试验等也可作为检测方法。     

应用PCR检测禽腺病毒

根据禽腺病毒 CELO株的基因序列 ,设计合成了 1对引物 :上游引物为 5′-CCCTCCCACCGC-TAACCA-3′,下游引物为 5′-CACGTTGCCCTTATCTTGC-3′。用这对引物对 群禽腺病毒中 1 2个血清型病毒和 1 9个分离野毒株、 群 4个血清型病毒、 群禽腺病毒株的核酸模板进行了 PCR扩增 ,结果均特异性地扩增出了与设计片段大小相一致的 4 2 1 bp片段 ,而对其他 5种禽病病原体和哺乳动物腺病毒血清 2型核酸模板的扩增均为阴性。该 PCR能检出 1 fg禽腺病毒 DNA模板     

蛋鸡禽白血病的实验室诊断

对开阳县某蛋鸡场发生的疫病通过发病情况调查、剖检病变观察、细菌分离培养和相关病毒PCR检测。结果:疫病主要发生于160日龄以上鸡群,病变以肝脏和脾脏显著肿大为特征;细菌分离培养未见菌落生长; PCR检测可见禽白血病病毒特异性DNA片段,但未检出鸡马立克氏病病毒特异性DNA片段。综合诊断为禽白血病病毒感染。     

禽腺病毒4型PCR检测方法的建立与应用

根据禽腺病毒4型(FAdV-4)Hexon基因核苷酸序列,设计用于扩增FAdV-4的PCR引物,建立了FAdV-4 PCR检测方法。特异性和敏感性实验结果表明,该方法可扩增出954 bp的特异性核酸片段,而对禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒与禽腺病毒11型的检测结果均为阴性,对FAdV-4的最低核酸检出量为12.9 pg。该方法可用于禽腺病毒4型的临床检测与流行病学调查。     

单管套式PCR检测外源性禽白血病病毒

从贵州省4个养鸡场采集出现肿瘤病变或疑似肿瘤病料样本17份,以单管套式PCR方法检测禽白血病病毒长末端重复序列(LTR),15份病料均扩增出一条213 bp的DNA带,与预期扩增长度相符合,外源性禽白血病病毒的检出率达到88.2%.同时针对禽白血病病毒的囊膜糖蛋白基因(gp85)进行PCR扩增,在被检的17份病料中,7份检出J亚群特异性的DNA带(545 bp),占41.1%;9份检出A亚群特异性的DNA带(691 bp),占52.9%;其中2份病料同时检出J亚群与A亚群特异性的病原核酸.A、J亚群的PCR检出率低于LTR的套式PCR扩增.     

用反转录聚合酶链反应检测禽呼肠孤病毒的研究

本文报告了建立反转录聚合酶链反应（ Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ）检测禽呼肠孤病毒（ Ａ Ｒ Ｖ）的方法,根据禽呼肠孤病毒 Ｓ１１３３ 毒株 Ｓ１ 基因序列,设计合成两对引物,用 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 技术对 ６ 株禽呼肠孤病毒国际标准株进进行了检测。结果两对引物对 ６ 株 Ａ Ｒ Ｖ 均可扩增出与预期大小相符 ５３２ｂｐ 和 ４３５ｂｐ 的 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 产物,而对其它 ６ 种禽病病原核酸的扩增结果均为阴性;该 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 可以检测出 １ｐｇ 的 Ａ Ｒ Ｖ Ｒ Ｎ Ａ 模板。     

Development of a Duplex PCR Assay for Detection of Avian Influenza Virus and Chicken Parvovirus

In order to establish a method to simultaneously detect avian influenza virus (AIV) and chicken parvovirus (ChPV),two pairs of specific primers were designed according to the sequences of AIV M gene and ChPV NS gene in GenBank. The duplex PCR assay was established by optimizing the reaction conditions.The tests showed that this method had high specificity, could simultaneously detect AIV and ChPV and no specific band was amplified for other subtypes avian pathogenic virus. The sensitivity result showed that the lower detection limit of this method was 100 fg. The results of 159 clinical samples were consistent with the sequencing results of PCR positive product. The double PCR methods for detection of AIV and ChPV established in this study had the characteristics of good specificity and high sensitivity, which was of great significance to the prevention control of AIV and ChPV.     

禽流感病毒与鸡细小病毒二重PCR检测方法的建立

为建立一种能同时鉴别诊断禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）和鸡细小病毒（chicken parvovirus,ChPV）的检测方法,本研究根据GenBank中AIV的M基因和ChPV的NS基因保守序列,分别设计并筛选出两对特异性引物,用于AIV和ChPV的检测。通过优化反应条件,建立了AIV和ChPV二重PCR检测方法。试验结果表明,该方法特异好,能同时检测AIV和ChPV,对其他常见的禽病病原体均未反应;该法对AIV和ChPV的检测下限均为100 fg;对159份临床样品检测结果与PCR阳性产物测序结果一致。本研究建立的AIV和ChPV二重PCR检测方法具有特异性好、灵敏度高的特点,对AIV和ChPV的防制具有重要意义。     

H3亚型禽流感病毒巢式PCR检测方法的建立

为建立一种H3亚型禽流感病毒(AIV)的检测方法,本研究针对H3亚型AIV HA基因保守序列,设计并筛选出2对特异性引物,通过优化反应条件,建立了H3亚型AIV巢式PCR检测方法。对该法进行特异性和敏感性检验,并用该法对96份临床样品进行检测。特异性试验结果表明该法只能检测到H3亚型AIV,对其他常见禽病病原体不扩增;敏感性试验结果表明该巢式PCR对H3亚型AIV检测下限为1×10³拷贝/μL,灵敏度比常规PCR高100倍;96份临床样品检测结果与病毒分离结果一致。本研究所建立的巢式PCR为H3亚型AIV的诊断提供了一种准确、有效的检测方法。     

J亚群禽白血病病毒套式PCR检测方法的建立

本试验根据GenBank中登录的禽白血病病毒(ALV)基因组序列,设计合成了2对引物,外部引物的扩增片段大小为478 bp,内部引物的扩增片段大小为314 bp,建立了适合ALV快速检测的套式PCR方法(nested-PCR)。采用该方法对ALV毒株进行了检测,试验结果表明,能扩增到314 bp的条带,禽流感病毒(H9亚型)、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、减蛋综合征病毒、禽网状内皮增生病病毒、禽呼肠孤病毒、马立克氏病病毒的扩增结果均为阴性。该方法第1次扩增的敏感性是100 pg,第2次扩增的敏感性是1 fg,第2次比第1次扩增的敏感性高10⁵倍。所建立的套式PCR方法具有敏感性高、重复性好、特异性强等优点,可用于禽白血病病毒(ALV)的临床诊断和分子流行病学调查等。     

禽源多杀性巴氏杆菌多位点序列分型研究

为了解国内禽源多杀性巴氏杆菌流行情况,对分离自18省份的84株多杀性巴氏杆菌采用荚膜多重PCR分型和多位点序列分型对其血清型和基因型进行鉴定。结果表明:禽源多杀性巴氏杆菌主要以血清A型为主,占96.4%(81/84);多位点序列分型可将禽源多杀性巴氏杆菌分为5种ST型,其中ST129为主要流行型,占94.0%(79/84)。本研究为我国禽源多杀性巴氏杆菌的流行病学监测和基因多样性提供了数据支持。     

蛋鸡血管瘤型禽白血病的诊断

为了对2008年8月发生在贵阳市乌当区某商品蛋鸡群疑似禽白血病的疫情进行确诊,采用流行病学调查、病理剖检、血清学检测及病原核酸鉴定等进行诊断,结果表明,该疫病是由A亚群禽白血病病毒引起的血管瘤型禽白血病.     

禽网状内皮组织增殖病病毒GD09株的分离与全基因组测序

从广东某鸡场送检的疑似禽网状内皮组织增殖病的病鸡中采集病料,处理后经接种DF-1细胞,经聚合酶链式反应(PCR)及特异性间接免疫荧光试验(IFA),分离并鉴定出1株禽网状内皮组织增殖病病毒(reticuloendotheliosis virus,REV),命名为GD09。依据已发表的REV前病毒全基因组序列设计并合成6对引物,采用分段扩增的方法完成了分离株的全基因组序列测定。结果显示,该分离株基因组序列全长8295 bp,符合典型的复制完全型反转录病毒的基因组结构,基因序列中不含已知致癌基因。将该分离株的亚群特异性gp90基因序列与国内外各参考株相应序列进行相似性比较分析,结果表明,GD09分离株与中国分离株HA9901亲缘关系最近,核苷酸相似性最高。     

应用聚合酶链反应检测禽多杀性巴氏杆菌的研究

根据基因库中禽巴氏杆菌病原的基因序列（U51470）,设计了一对跨幅为488bp的引物,并用这对引物对11个不同血清型的禽巴氏杆菌标准株、9株地方分离株和5株哺孔动物巴氏杆菌菌株及其它6种禽病病原进行了PCR扩增,结果11个血清型的禽源巴氏杆菌和9株禽巴氏杆菌地方分离株均得到了片段大小与实验设计相一致的PCR扩增产物,而对5个血清型的哺乳动物巴氏杆菌和其它6种禽病病原的扩增结果为阴性。该PCR能检出10pg的禽巴氏杆菌DNA模板。