羊驼毛囊干细胞分离、培养与鉴定

采用0.2%中性蛋白酶Ⅱ和0.25%胰酶∶0.02%EDTA(1∶1)"两步酶"消化法从羊驼背部皮肤分离得到羊驼毛囊干细胞。用无血清角质细胞培养基(K-SFM)培养进行形态学观察、细胞生长曲线克隆形成率及免疫组化染色检测。结果显示,细胞生长曲线表明,不同代次毛囊干细胞接种前3d生长缓慢,4⁶d进入倍增期,有无限增殖的趋势,所分离的羊驼毛囊干细胞具备毛囊干细胞特征(体积小、立体感强),呈现未分化特征;CK19、CK15、β1-integrin和CD34免疫组化染色阳性;第3、5、7、9代克隆形成率分别为(32.7±2.27)%、(47.0±3.46)%、(46.3±3.18)%和(43.3±3.76)%。结果表明,用"两步酶"消化法成功分离获得羊驼毛囊干细胞,无血清角质细胞培养基(K-SFM)可使羊驼毛囊干细胞体外维持未分化状态并传代至12代。     

羊驼毛囊干细胞分离、培养与鉴定

采用0．2％中性蛋白酶Ⅱ和0．25％胰酶：0．02％EDTA（1：1）“两步酶”消化法从羊驼背部皮肤分离得到羊驼毛囊干细胞。用无血清角质细胞培养基（K-SFM）培养进行形态学观察、细胞生长曲线克隆形成率及免疫组化染色检测。结果显示，细胞生长曲线表明，不同代次毛囊干细胞接种前3d生长缓慢，4～6d进入倍增期，有无限增殖的趋势，所分离的羊驼毛囊干细胞具备毛囊干细胞特征（体积小、立体感强），呈现未分化特征；CK19、CK15、81-integrin和CD34免疫组化染色阳性；第3、5、7、9代克隆形成率分别为（32．7±2．27）％、（47．0±3．46）％、（46．3±3．18）％和（43．3±3．76）％。结果表明，用“两步酶”消化法成功分离获得羊驼毛囊干细胞，无血清角质细胞培养基（K—SFM）可使羊驼毛囊干细胞体外维持未分化状态并传代至12代。     

山羊毛囊干细胞的分离及体外培养

试验采用2．4U／mL Dispase酶消化和机械切割法分离毛囊隆突部,经胰酶（0．5mg／mL胰酶＋0．2mg／mL EDTA）消化从山羊耳部皮肤分离得到的毛囊干细胞,然后进行形态学观察、细胞生长曲线测定、克隆形成率及免疫组化染色检测,并对毛囊干细胞的基础培养基进行了筛选。结果表明：DMEM／F12是一种适合毛囊干细胞体外增殖培养的培养基;在以DMEM／F12为基础培养液的培养体系中细胞可传代至19代。     

不同浓度的IGF-1对山羊毛囊干细胞体外培养的影响

采用2.4 U/mL Dispase酶消化和机械切割法分离毛囊隆突部,经胰酶（0.5 mg/mL胰酶+0.2 mg/mL EDTA）消化,从山羊耳部皮肤分离得到毛囊干细胞,并检测了不同浓度的IGF-1对山羊毛囊干细胞体外培养的作用。结果表明,IGF-1对毛囊干细胞体外培养作用很明显,并且最适IGF-1浓度是10 ng/mL。     

小鼠输卵管上皮细胞的原代培养及纯化方法研究

建立小鼠输卵管上皮细胞原代培养及纯化方法.小鼠输卵管上皮细胞原代培养采用组织块培养法和酶消化法.酶消化法于37℃分为4个处理组进行.处理1以2.5 g/L胰酶+0.4 g/L EDTA消化5、10、20 min;处理2以0.5 g/L胰酶+0.08 g/L EDTA消化35、50、75 min;处理3以0.3 g/L的Ⅰ型胶原酶消化60、90、240 min;处理4以2.5 g/L胰酶+0.4 g/L EDTA和0.3 g/L Ⅰ型胶原酶(1∶2)消化60 min,150 min.原代细胞纯化采用差速贴壁和反复差速贴壁法.传代采用胰酶两步消化法进一步纯化输卵管上皮细胞.组织块法原代培养成纤维细胞生长优势明显,传代纯化细胞效果不佳.用酶消化法原代培养时,处理1效果不理想;处理2采用3个消化时间时均取得比较理想的结果;处理3消化240 min时结果较好;处理4消化150 min效果较好.原代细胞纯化,反复差速贴壁得到的上皮细胞较纯,进一步传代纯化细胞取得了理想的结果.小鼠输卵管上皮细胞原代培养采用酶消化法结合反复差速贴壁分离纯化细胞,传代采用两步消化法,可以成功地进行小鼠输卵管上皮细胞的分离纯化培养.     

猪胎儿成纤维细胞和耳皮肤成纤维细胞培养方法的研究

为了研究猪胎儿成纤维细胞和耳皮肤成纤维细胞的分离培养体系,根据取样组织的不同,筛选出最佳的培养方法,试验以猪胎儿和耳皮肤为试验材料,用4种不同的培养分离方法,即胰酶热消化法、胰酶冷热结合消化法、胰酶室温消化法和组织块培养法,分离培养猪胎儿成纤维细胞和耳皮肤成纤维细胞,对比培养效果,筛选出最佳的培养方法。结果表明:胰酶室温消化法分离的猪胎儿成纤维细胞存活率显著高于胰酶热消化法和胰酶冷热结合消化法(P<0.05),细胞贴壁效果好,且操作简单;猪耳皮肤成纤维细胞原代培养中,胰酶热消化法和胰酶室温消化法分离的细胞数量少,组织块培养法所需的组织量少,且较胰酶冷热结合消化法操作简单。试验中培养的细胞呈典型的成纤维细胞形态,生长曲线呈"S"型,经冻存复苏后生长状态良好,说明胰酶室温消化法是猪胎儿成纤维细胞较好的培养方法,胰酶热消化法和胰酶室温消化法是猪耳皮肤成纤维细胞原代培养的理想培养方法。     

泰和乌骨鸡鸡胚皮肤黑色素细胞的分离与培养

为探讨泰和乌骨鸡鸡胚皮肤黑色素细胞的分离、培养及鉴定方法,取20日龄的泰和乌骨鸡鸡胚的背部皮肤,通过不同的消化酶处理皮肤分离乌骨鸡黑色素细胞,细胞培养于改良型的α-MEM完全培养液中,对黑色素细胞进行形态学观察,并通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)法观察黑色素细胞的生长情况,用多巴染色和抗S-100免疫细胞化学染色法对培养的细胞进行鉴定。结果表明,用Dispase+胰蛋白酶消化皮肤可获得较好的分离效果,倒置显微镜下观察细胞呈树突状。培养液中添加碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)和霍乱霉素(CT)可协同促进黑色素细胞的生长。MTT结果显示细胞生长良好,多巴和抗S-100蛋白染色呈阳性。本试验成功从20日龄泰和乌骨鸡鸡胚背部皮肤中分离得到黑色素细胞,经形态学观察、多巴和免疫细胞化学染色鉴定为黑色素细胞。     

在羊驼皮肤黑色素细胞中α-黑素细胞刺激素对诱导一氧化氮合酶的影响

为研究α-黑素细胞刺激素（α-Melanocytestimulatinghormone,α-MSH）对诱导型一氧化氮合酶（NOS2）在羊驼皮肤黑素细胞中的影响。采用体外培养正常羊驼皮肤黑素细胞,检测不同浓度α-MSH（0、10-9、10^-8、10^-7moL／L）对羊驼皮肤黑素细胞中诱导型一氧化氮合酶（NOS2）基因...     

不同代次羊驼皮肤黑素细胞TYR基因表达变化的研究

为了探讨TYR基因在体外培养的羊驼皮肤黑素细胞不同代次间表达变化差异,根据Gen Bank中已发现的序列(EU293064)设计引物和探针,以羊驼皮肤黑素细胞的RNA为模板,采用QRT-PCR Taq Man探针法研究羊驼酪氨酸酶基因在不同代次间羊驼皮肤黑素细胞中m RNA表达量.结果表明,经过内参基因校正后,第10代羊驼黑素细胞中TYR基因的相对表达量是第3代细胞相对表达量的25倍(P0.01),第10代细胞与第5代细胞表达差异不明显(P0.05)。表明TYR基因表达量的差异与羊驼皮肤黑素细胞传代可能存在一定的相关性。     

小鼠脾细胞的原代培养方法改良

为了确定较好的小鼠脾细胞分离培养方法,在不同培养时间(培养当天、第3天、第6天、第9天)条件下,分别采用改良胰酶消化法、组织块直接培养法和机械分离培养法培养小鼠脾细胞,试验进行细胞形态学、增殖生长曲线和细胞活力曲线对比研究。结果表明:不同培养方法对小鼠脾细胞的细胞学形态和细胞活力均有影响。改良胰酶消化法培养的细胞其细胞活力比组织块直接培养法和机械分离培养法培养的细胞活力好,而在细胞形态学的比较中,改良胰酶消化法培养的原代小鼠脾细胞与其他两组相比,培养情况最好,数量较多,形态完整,贴壁较好。证明改良胰酶消化培养法能够较好地培养小鼠脾细胞,进一步完善了小鼠脾细胞原代培养的方法。     

山羊毛囊干细胞分离、培养及鉴定

采用2．4U／mLDispase酶消化和机械切割法分离毛囊隆突部,经胰酶（0．5mg／mL胰酶＋0．2mg／mLEDTA）消化从山羊耳部皮肤分离得到毛囊干细胞,用自制无血清培养基培养,并用形态学观察、细胞生长曲线、克隆形成率及免疫组化染色检测,探讨毛囊干细胞体外分离培养方法及生物学特性。结果表明,所分离细胞具备毛囊干细胞特征：体积较小、表面光滑、立体感强,呈现未分化细胞特征;K19、integrin-β1以及p63免疫组化染色阳性;第3、5、7代干细胞克隆形成率分别为25．6％&#177;2．6％、31．8％&#177;1．9％和27．0％&#177;3．9％,极显著高于对照组角质细胞克隆形成率（P〈0．01）。采用配制的无血清条件培养液可使山羊毛囊干细胞体外维持未分化状态并传代至19代。     

组织块再移法分离培养奶山羊乳腺上皮细胞

通过比较组织块贴壁培养法、组织块再移法、胰蛋白酶消化法、胶原酶Ⅱ消化法和胶原酶消化配合组织块贴壁法分离、培养、纯化山羊乳腺上皮细胞,绘制细胞生长曲线并计算细胞群体倍增时间,研究乳腺上皮细胞培养效果。结果显示,利用胶原酶消化配合组织块贴壁法不能获得正常生长的乳腺上皮细胞;利用组织块贴壁培养法、组织块再移法和胶原酶Ⅱ消化法获得大量的乳腺上皮细胞,所得到的上皮细胞生长曲线呈典型的＂S＂型,符合细胞生长的一般规律。组织块再移法不仅可快速获得大量纯化的乳腺上皮细胞,而且所得到的细胞经传代后,细胞群体倍增时间最短、增殖能力最强,表明,该法是获得山羊乳腺上皮细胞最适宜的方法。     

Primary culture of chicken bursal plical epithelium

Plical epithelial cells were obtained by trypsin-EDTA treatment of chicken bursa of Fabricius and cultured in the presence of type IV collagen. The culture became confluent six to seven days after seeding. The grown cells showed a positive reaction for cytokeratin by immunostaining and had ultrastructural characteristics of the epithelial cells in vivo. The cell culture will be useful for parasitological and virological studies.     

周期素依赖性蛋白激酶-5在不同毛色羊驼皮肤中的表达

本研究旨在探索周期素依赖性蛋白激酶-5(CDK5)在羊驼皮肤中的表达与功能。以不同毛色的成年羊驼为研究对象,采用免疫组织化学法对CDK5在羊驼皮肤中的表达进行定位和定性研究,并利用实时荧光定量PCR技术分析了不同毛色羊驼皮肤CDK5基因的相对表达量。免疫组织化学结果显示CDK5在羊驼皮肤毛囊的外根鞘和毛球部呈阳性表达,根据光密度值分析得出CDK5在不同毛色羊驼毛囊中的表达差异显著(P0.05)。实时荧光定量PCR结果显示棕色羊驼中CDK5mRNA相对基因表达量是白色羊驼的1.6245倍。结果提示CDK5可能与羊驼毛色形成相关。     

牛骨骼肌卫星细胞的分离鉴定和诱导分化

为了在体外研究西门塔尔牛的肌肉生长发育过程并建立牛骨骼肌卫星细胞的原代细胞模型。本研究采用0.2%的Ⅱ型胶原酶消化后再使用0.25%胰酶消化获得牛骨骼肌卫星细胞（bovine skeletal satellite cell，BSSC），并利用差速贴壁法分离获得纯化后的BSSC，使用RT-PCR、免疫荧光染色和Western blotting等方法鉴定BSSC，使用成脂诱导剂诱导其分化为脂肪细胞，油红O染色鉴定分化后细胞的成脂能力，使用2%马血清诱导其分化为肌细胞，RT-PCR鉴定静止期PAX7基因和肌细胞的标记基因MyoG在诱导前后表达量的变化。结果发现，分离纯化得到的BSSC呈梭形或纺锤形，细胞形态饱满，折光性强，随着培养时间的延长，细胞由原来的无序生长变为有序生长；RT-PCR检测发现，BSSC表面标志基因Desmin、c-Met、Myf5和特异性标志基因PAX7均呈阳性表达；免疫荧光染色及Western blotting结果显示，PAX7和MyoD基因均呈阳性表达；成脂细胞诱导分化后被油红O大量染色并观察到大量脂滴出现；成肌细胞诱导分化后静止时期PAX7基因表达量诱导前高于诱导分化后，而成肌标记基因MyoG表达量诱导前低于诱导分化后。综上，本研究成功分离获得BSSC，并证明BSSC具有分化成脂肪细胞和肌细胞的能力，为体外研究西门塔尔牛肉制品调控机制提供原代细胞模型。     

羊驼Bclaf1基因cDNA部分序列的克隆及组织表达特征分析

为了获得羊驼Bclaf1基因cDNA序列,研究该基因在羊驼皮肤中的表达特征.本研究对已构建的羊驼皮肤cDNA文库进行筛选和ESTs分析,并运用免疫组化技术对Bclaf1在羊驼皮肤中的表达进行组织定位.结果,羊驼Bclaf1基因与褐鼠、小鼠、狗、人和黑猩猩Bclaf1基因相应cDNA序列的相似性分别为100%,92.9%、86.0%、81.1%和77.9%.Bclaf1在幼年羊驼毛囊中没有阳性细胞,在成年羊驼、白色和棕色羊驼毛囊的外根鞘处集中表达;根据光密度值分析得Belaf1在不同毛色羊驼毛囊中的表达差异显著.结果表明,Betaf1基因在羊驼皮肤中的表达和定位随年龄和毛色而变化.     

Wnt3a在不同毛色羊驼皮肤中的表达和定位

本研究旨在探索Wnt3a在羊驼皮肤中的表达与定位.以不同毛色的成年羊驼为研究对象,应用荧光定量PCR技术分析不同毛色羊驼皮肤Wnt3a基因的相对表达量,并运用Western blotting及免疫组织化学法对Wnt3a蛋白在不同毛色羊驼皮肤中进行表达和定位研究.结果:荧光定量PCR结果显示棕色羊驼中Wnt3a mRNA相对表达量是白色羊驼的2.9702倍;Western blotting结果表明,羊驼皮肤组织组蛋白提取物中存在相对分子质量约39 ku的产物,棕色羊驼皮肤平均蛋白表达量显著高于白色羊驼;免疫组织化学结果显示Wnt3a在羊驼皮肤毛囊的根鞘和毛球部呈阳性表达,根据光密度值分析得出Wnt3a在棕色和白色羊驼毛囊中的表达差异显著(P＜0.05).通过以上研究显示Wnt3a可能与羊驼毛色形成具有相关性.     

马皮肤成纤维细胞的分离与体外培养

研究用小组织块直接培养法和酶消化法成功地分离了马皮肤成纤维细胞,并对其进行了体外培养,同时筛选出消化马皮肤组织块的适宜酶及酶浓度,获得了马皮肤成纤维细胞的生长曲线,并发现至少在传至第12代时有81.3%的染色体还保持正常的倍数(2n=64)。