用CODEHOP设计简并引物克隆反刍月形单胞菌K6乙酸激酶基因片段

利用CODEHOP设计细菌乙酸激酶的简并引物,选用1对引物ACKSe以高效丙酸生成菌反刍月形单胞菌K6基因组DNA进行PCR,得到749 bp PCR产物,产物经pMD18-T载体克隆转化至DH5α大肠杆菌中,测序后经Blastx比对,此DNA产物与其他菌属来源的乙酸激酶蛋白序列具有相似性,所克隆的序列即为K6的乙酸激酶基因片段。用CODEHOP程序化设计的简并引物可信性强,阳性率高。该基因的成功克隆为丙酸生成菌K6乙酸代谢工程研究提供了依据。     

种子液传代次数对益生菌FGM株发酵黄芪转化多糖的影响

益生菌FGM株发酵黄芪后,产物粗多糖得率显著提高。为进一步提高FGM株发酵黄芪转化多糖的稳定性,本试验将连续传代的FGM株种子液接种黄芪进行液体发酵,采用细菌平板计数法和苯酚-硫酸法分别测定发酵前、后的细菌总数和发酵后黄芪多糖的含量,并对结果进行了统计学分析。结果表明菌种在多次连续传代后会产生菌种退化现象,发酵产物中多糖含量与种子液细菌总数呈极显著相关（P=0.007）,其中第4代种子液发酵黄芪转化多糖的性能最高。     

沙门菌肠毒素基因克隆及序列分析

研究常见的不同血清型沙门菌肠毒素(stn)基因核苷酸序列之间的差异及其分布情况。根据沙门菌的stn核苷酸序列设计一对引物,应用PCR技术,分别对肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌和鸡白痢沙门菌进行PCR扩增,对扩增产物进行克隆及序列分析,并用所设计的引物检测7种血清型沙门菌(42株)。结果显示,3种沙门菌经PCR均扩增出749 bp的特异条带,DNA序列分析证实,沙门菌的stn核苷酸序列比较保守,42株沙门菌stn的检出率为100%。本试验成功克隆出沙门菌的stn,调查其在不同血清型沙门菌中的分布及序列分析,为进一步研究stn致病机理及研制减毒沙门菌活菌疫苗奠定了基础。     

鹅CAT-4基因的简并引物设计及克隆

CAT-4是生物体内重要的氨基酸转运蛋白,通过CodeHop法来克隆鹅CAT-4基因片段,为今后对CAT-4基因的研究提供依据。结合BlockMaker、CodeHop、NCBI、Blastp、ClustalW2等生物信息学资源和DNAMAN、Oligo6.0等生物软件,设计鹅CAT-4基因的简并引物,对所涉及的CAT-4基因片段进行克隆。此次试验成功地克隆了鹅脑组织中的CAT-4基因,并且获得了CAT-4基因编码的cDNA部分序列,其长度为450 bp。结果表明,CodeHop法设计简并引物,能够提高引物特异性,减少假阳性率,有利于试验成功。     

CODEHOP克隆鲫鱼HSP90基因及其同源性分析

本研究旨在分析热休克蛋白90(HSP90)基因的保守性,并为寻找新的HSP基因,探索HSP90的应用提供理论数据。利用CODEHOP设计简并引物,采用PCR方法克隆鲫鱼的HSP90序列,并将扩增的序列克隆到pMD18-T载体中构建克隆载体后进行测序,再将测序结果通过BLAST进行同源性比对并构建系统进化树。结果显示,鲫鱼与鲤鱼的同源性为99%;与斑马鱼的同源性为92%。本试验设计出的引物简并度较低,Tm值的修改较为灵活,产物特异性强,为研究鲫鱼的功能基因提供基础保障,并为热休克蛋白在进化上的保守性研究奠定理论基础。     

2例犬死亡原因的实验室诊断

对昆明某犬场2例死亡犬的死亡原因进行实验室鉴定。采集犬肠内容物分别做细菌和病毒检测。细菌检测包括:犬肠内容物划线培养,纯化,分离,革兰氏染色,镜检,生化试验,血清试验,药敏试验。病毒检测包括:提取病料的总DNA,用犬细小病毒的特异引物进行PCR扩增,扩增产物经胶回收后克隆到pMD18-T载体,转化受体菌DH5α,挑取阳性克隆质粒进行序列测定,并与已知参考毒株序列进行比对,分析核苷酸的同源性。分离到一株有部分耐药性的侵袭性大肠埃希菌;检测到一株犬细小病毒,由引物P1/P2扩增的基因与参考毒株CPV-b同源性为98.58%,由引物P3/P4扩增的基因与参考毒株CPV-b同源性为92.1%。结果表明,2例死亡犬的死亡原因分别为侵袭性大肠埃希菌感染和犬细小病毒感染。     

野生大豆DREB基因cDNA的克隆与分析

以野生大豆Glycine soja叶片总RNA为模板，根据其他双子叶植物DREBP/AP2结构域的保守氨基酸序列设计简并引物，通过降落和巢式PCR进行扩增，获得1条190 bp的cDNA片段。以此序列设计引物，采用RACE扩增3’和5’末端未知序列，最终克隆到野生大豆DREB全长基因（GsDREB）。该基因1 191 bp编码395个氨基酸，基因内部没有内含子。氨基酸分析表明，其N 末端具有核定位信号（nuclear localization signal, NLS），并具有由58个氨基酸编码的、能够与DNA结合的保守区域 DREBP/AP2结构域。通过多序列比对分析，该基因与拟南芥Arabidopsis thaliana DREB2C氨基酸序列相似性最高，推测其为DREB2亚家族的成员。     

鸭疫里默氏菌病和大肠杆菌病鉴别诊断双重PCR方法的建立和应用

本研究从鸭疫里默氏菌提取基因组DNA,采用细菌16S rRNA基因的通用引物,用PCR方法成功扩增出鸭疫里默氏菌的部分16S rRNA基因,克隆及测序结果表明其全长1512bp,G＋C含量为51％,该序列已登人GenBank,登录号为DQ078779。同时利用生物软件对GenBank收录的鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的16S rRNA基因序列进行分析后,设计了鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的种特异性引物,分别能从各自的16S rRNA基因中扩增出长度为342和718bp的DNA片段。并据此建立了一种能快速准确鉴别诊断鸭疫里默氏菌和大肠杆菌病的双重PCR方法,该方法能从肝脏组织悬液煮沸后的上清、细菌培养物或提取的细菌基因组DNA中快速扩增出相应的片段,进行鉴别诊断。     

杜氏盐藻CDPK基因的克隆及其序列的分析

首先对拟南芥Arabidopsis thaliana等其他物种CDPK基因的同源序列进行相似性分析,设计1对简并引物,利用RT-PCR技术获得一个长636 bp的片段,经克隆测序分析发现其同拟南芥的CDPK基因有60.3%的相似性,然后再以此片段为模板设计引物,通过RACE技术构建杜氏盐藻Dunaliella salinaCDPK基因的全长序列。在GenBank中进行Blastp检索,发现该片段与许多植物CDPK基因具有较高的相似性(50.2%~73.0%)。     

CODEHOP法设计简并引物克隆鲫鱼肌钙蛋白C(TnC)基因及序列分析

本文结合生物信息学资源和生物软件的使用,针对特定的氨基酸序列设计简并引物,利用CODEHOP法设计简并引物克隆鲫鱼肌钙蛋白C(Tn C)基因,并构建系统进化树。证明该基因片段与其他鱼类Tn C基因具有较高的同源性,其中与斑马鱼同源性最高达到96%,与大西洋鲑、白斑狗鱼、虹鳟、斜带石斑鱼、斑点叉尾鮰的同源性分别为92%、92%、91%、91%、85%。研究表明,应用此种方法设计出的引物简并度相对较低,Tm值的修改较为灵活,产物特异性强。     

Development of species-specific PCR techniques for the detection of tortoise herpesvirus.

Previously, a nested polymerase chain reaction (PCR) was employed with consensus degenerate primers targeting highly conserved motifs within herpesviral DNA polymerase genes to detect a newly described tortoise herpesvirus. However, nucleotide sequence information obtained from the final amplified fragment was restricted to a small region of 181 bp. In the present study, additional sequences flanking this segment were determined from a PCR product successfully amplified using a set of known degenerate primers, which covered a 692-bp region within the tortoise herpesviral DNA polymerase gene. Polymerase chain reaction primers for specific amplification of the tortoise herpesviral DNA were designed on the basis of these nucleotide sequences and successfully amplified tortoise herpesviral DNA from the tissues of tortoises that were well characterized histopathologically with herpesviral infection. The lower limit of detection was 1,000 herpesviral DNA equivalents in the presence of normal tortoise genomic DNA. Furthermore, a more sensitive and specific PCR technique for the identification of herpesviral infections in tortoises was developed employing a heminested form, which will enable the detection of latent infections or herpesvirus carriers in tortoises.     

伪狂犬病病毒HS株tk基因的PCR扩增与克隆

参照伪狂犬病病毒（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓｖｉｒｕｓ,ＰＲＶ）ＮＩＡ－３株ｔｋ基因序列,设计并合成１对长２２ｍｅｒ的引物,引物间距１．５ｋｂ,其内包含完整的ＰＲＶｔｋ基因。以ＢＨＫ２１细胞繁殖的ＰＲＶ湖北地方强毒株（ＨＳ－９３０４）基因组为模板进行ＰＣＲ扩增。琼脂糖凝胶电泳检测显示扩增主带清晰,长约１．５ｋｂ,符合设计要求。扩增片段克隆至由ｐＵＣ１８质粒改制而成的Ｔ载体中,限制性内切酶ＢａｍＨＩ、ＳｍａⅠ、ＸｈｏⅠ、ＨｉｎｄⅢ酶切分析证实,扩增片段的酶切位点与ｔｋ基因一致,说明扩增和克隆片段包含ＰＲＶｔｋ基因。     

猪肝脏HMG-CoA还原酶基因的部分序列克隆及分析

从杜长嘉猪的肝脏中提取基因组RNA ,进行反转录 聚合酶链式反应 (RT PCR) ,获得 1条近 175bp的片段 ,克隆于pUCm TVector后进行序列分析结果表明 ,该片段为HMG CoA还原酶催化域cDNA的部分序列 ,与GenBank登录的序列基本一致     

鹅细小病毒VP3基因真核表达载体的构建及其在Vero细胞中表达

根据已发表的鹅细小病毒(GPV)B株核苷酸序列,设计并合成了1对引物,PCR扩增GPV吉林分离株主要结构蛋白VP3基因,获得大小为1605bp的核苷酸片段。将该片段纯化后克隆入pMD18-T载体,转化感受态大肠杆菌JM109,双酶切鉴定,筛选阳性重组质粒并测序。经过酶切和连接反应,将VP3基因克隆入真核表达载体pVAX1,转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,提取质粒,进行了PCR和酶切鉴定。通过脂质体法将pVAX1-VP3转染Vero细胞,RT-PCR和间接免疫荧光法检测。结果显示,VP3基因克隆成功,与GPVB株核苷酸序列同源性为96.2%;PCR和酶切鉴定结果证实,成功构建了含VP3基因的GPV真核表达载体pVAX1-VP3。提取转染该质粒的Vero细胞RNA,RT-PCR扩增,在1000～2000bp可见一明显DNA条带;间接荧光抗体染色转染细胞,在细胞表面可见特异荧光。     

Development and evaluation of a polymerase chain reaction assay using the 16S rRNA gene for detection of Eperythrozoon suis infection.

The 16S ribosomal RNA (rRNA) gene of Eperythrozoon suis was amplified using gene-specific primers developed from GenBank sequence accession U88565. The gene was subsequently cloned and sequenced. Based on these sequence data, 3 sets of E. suis-specific primers were designed. These primers selectively amplified 1394, 690, and 839 base-pair (bp) fragments of the 16S rRNA gene from DNA of E. suis extracted from the blood of an experimentally infected pig during a parasitemic episode. No polymerase chain reaction (PCR) products were amplified from purified DNA of Haemobartonella felis, Mycoplasma genitalium, or Bartonella bacilliformis using 2 of these primer sets. When the primer set amplifying the 690-bp fragment was used, faint bands were observed with H. felis as the target DNA. No PCR products were amplified from DNA that had been extracted from the blood of a noninfected pig or using PCR reagents without target DNA. The detection limits for E. suis by competitive quantitative PCR were estimated to range from 57 and 800 organisms/assay. This is the first report of the utility of PCR-facilitated diagnosis and quantitation of E. suis based on the 16S rRNA gene. The PCR method developed will be useful in monitoring the progression and significance of E. suis in the disease process in the pig.     

绵羊肺腺瘤病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立检测绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)实时荧光定量PCR(Real-time qPCR)方法,根据外源性JSRV-NM株env基因序列,选其保守序列作为目的片段,设计引物和TaqMan探针,以自然病例的肺肿瘤组织基因组DNA为模板,经PCR扩增目的基因、克隆,重组质粒鉴定,并严格定量后,梯度稀释作为阳性标准品,优化反应条件进行Real-time qPCR扩增,获得的标准曲线为:Y=-3.308X+47.848,线性相关系数为0.991;Ct值变异系数小,并且灵敏度高,初步建立了检测JSRV前病毒DNA的Real-time qPCR方法。应用该方法对不同来源(A、B、C、D、E组)的绵羊外周血及其他组织样品进行测定其前病毒载量。结果显示B组和C组外周血白细胞、肺脏、肺门淋巴结以及鼻液中检测均为阳性,并发现前病毒DNA的载量在肺脏中明显高于外周血白细胞;D组虽未发现有绵羊肺腺瘤(SPA)临床症状,但在肺门淋巴结里可以检测到;E组中1只绵羊的肺脏也检出低拷贝数的前病毒DNA,而在A组中检测结果均为阴性。本研究对检测未知羊群JSRV感染程度及研究SPA流行病学等均有重要意义。     

嗜水气单胞菌弹性蛋白酶基因的克隆表达

为了研究嗜水气单胞菌重组弹性蛋白酶的酶学性质,试验根据GenBank中的嗜水气单胞菌弹性蛋白酶基因ahyB设计1对含酶切位点的特异引物,以嗜水气单胞菌J-1(AhJ-1)株为模板,经PCR扩增得到不含信号肽的成熟弹性蛋白酶基因片段(787 bp),并与pMD18-T载体连接、测序,再用DNAStar软件分析。结果表明:该基因片段与豚鼠气单胞菌胞外蛋白酶同源性高达95%,与嗜水气单胞菌AG2株弹性蛋白酶ahyB基因同源性为92%,与铜绿假单胞菌LasB基因同源性为82%;将PCR产物连入表达载体pET-32a,转化至大肠杆菌BL21菌株中进行诱导表达,出现50 ku的融合表达蛋白,该表达产物纯化复性后表现出酶的活性。     

表达鸡传染性喉气管炎病毒GB基因重组鸡痘病毒转移载体的构建

根据文献设计2对引物,PCR扩增FPV复制非必需区中外源基因插入位点两侧翼的片段,分别克隆到pUC19和pSK质粒中,并命名为pFP1和pFP2。根据文献设计引物,PCR扩增鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)的GB基因的编码区。将GB基因克隆到质粒pFP1中获得重组质粒pFP1-GB;用酶切质粒pEGFP,得到GFP片段并克隆到质粒pFP2中,得到重组质粒pFP2-GFP。双酶切pFP1-GB得到FP1-GB片段,并克隆到质粒pFP2-GFP中,得到重组质粒pFP1GB-FP2GPF。酶切质粒pE/L-7.5,获得背向连接的2个鸡痘病毒启动子片段——PE/L-7.5,并将该片段克隆到重组质粒pFP1GB-FP2GPF获得重组质粒pGB-GFP,该质粒即为鸡痘病毒的转移质粒。在质粒pGB-GFP中,2个背向连接的启动子被克隆到的GB和GFP基因之间,分别启动GB和GFP基因的表达。经酶切和测序鉴定pGB-GFP,启动子PE/L和P7.5已分别正确地插入到GB和GFP基因之间,分别启动外源表达基因GB和筛选标记基因GFP的表达,从而证明已获得表达鸡传染性喉气管炎病毒GB基因重组鸡痘病毒转移载体pGB-GFP。该载体为下一步获得表达鸡传染性喉气管炎病毒GB基因的重组鸡痘病毒奠定基础。     

鸡毒害艾美耳球虫LZ株MIC5基因的重组表达及其表达产物的抗原性分析

根据已发表的鸡柔嫩艾美耳球虫（Eimeriatenella）微线蛋白5（Micronemeprotein5,MIC-5）基因的核苷酸序列设计引物,以毒害艾美耳球虫（E．necatrix）DNA为模板,利用PCR方法扩增出EnMIC-5部分基因片段。将基因片段与pMD18-Tsimple载体连接,重组质粒测序结果表明EnMIC-5基因大小为1470bp,编码490个氨基酸。EnMIC-5与pET-28a（＋）载体构建重组表达质粒pET-EnMIC-5,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达。经SDS-PAGE检测,表达产物为相对分子质量约57．5ku的融合蛋白。Western-blot分析结果表明表达蛋白可被鸡感染E．necatrix阳性血清识别。用重组蛋白免疫昆明鼠,一免后15d即可检测到相应抗体,且抗体在三免后40d仍维持较高水平,证实重组蛋白具有良好的免疫原性,可诱导小鼠产生高滴度的特异性抗体。