新生Wistar大鼠心肌细胞的分离培养与鉴定

本试验取新生24 h内的Wistar大鼠心肌组织,无菌剪碎后采用胰酶消化法分离细胞,用含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养,逐日在倒置相差显微镜下观察。结果于培养后48 h即可观察到部分细胞搏动;72 h后,细胞逐渐展开,搏动频率在60~70次/min,从而初步确立培养的细胞为心肌细胞;进一步采用心肌细胞特异性蛋白(cTnT)抗体和α肌动蛋白(α-actin)单克隆抗体分别对培养的心肌细胞进行免疫荧光及免疫组织化学鉴定,结果均呈阳性。     

猪原代神经细胞的体外培养与鉴定

为建立猪原代神经细胞体外培养及鉴定方法,本研究选取90日龄潜江黑猪1头,分离猪脑组织,无菌剪碎后采用胰酶消化和机械分离相结合的方法制备神经细胞悬液,进行培养,逐日在倒置相差显微镜下观察,并用间接免疫荧光鉴定。结果显示,培养72h后细胞全部贴壁,并长出突起,随时间增加,突起变长并交错呈网络,培养至15~20d神经细胞状态最佳,随后逐渐老化,神经细胞可生长30d,经鉴定Nestin表达呈阳性。本研究建立的方法适合一般实验室开展猪原代神经细胞的培养与初步鉴定。     

大白鼠乳腺上皮细胞的体外培养与鉴定

 试验选取泌乳期大白鼠乳腺组织,采用机械剪切结合胰酶消化的方法,在体外进行乳腺上皮细胞原代分离培养及鉴定。结果成功培养出大鼠原代乳腺上皮细胞,经过角蛋白免疫组化鉴定染色后,呈现阳性反应。显微镜下观察,细胞呈鹅卵石样;经多次传代,细胞增殖仍然长势很好。     

苦马豆素诱导新生SD大鼠大脑皮质神经细胞凋亡

为阐明苦马豆素（SW）对新生SD大鼠大脑皮质神经细胞凋亡的影响,利用新生SD大鼠大脑皮质神经细胞体外原代培养模型,采用倒置相差显微镜、扫描电子显微镜及荧光显微镜观察sw对神经细胞的形态学损伤,运用流式细胞仪检测神经细胞凋亡率。结果显示,与对照组比较,各试验组神经细胞密度降低,神经网络减少且部分断裂;细胞表面粗糙,可见大量突起的小泡;细胞核出现浓缩、碎裂及新月形变化;随攻毒剂量的增加,神经细胞凋亡率呈明显上升趋势,与对照组相比,差异显著（P〈0．05）。结果表明,Sw能诱导新生sD大鼠大脑皮质神经细胞发生凋亡,这可能是Sw导致动物神经毒性损伤的作用机制之一。     

苦马豆素诱导新生SD大鼠大脑皮质神经细胞凋亡

为阐明苦马豆素(SW)对新生SD大鼠大脑皮质神经细胞凋亡的影响,利用新生SD大鼠大脑皮质神经细胞体外原代培养模型,采用倒置相差显微镜、扫描电子显微镜及荧光显微镜观察SW对神经细胞的形态学损伤,运用流式细胞仪检测神经细胞凋亡率。结果显示,与对照组比较,各试验组神经细胞密度降低,神经网络减少且部分断裂;细胞表面粗糙,可见大量突起的小泡;细胞核出现浓缩、碎裂及新月形变化;随攻毒剂量的增加,神经细胞凋亡率呈明显上升趋势,与对照组相比,差异显著(P<0.05)。结果表明,SW能诱导新生SD大鼠大脑皮质神经细胞发生凋亡,这可能是SW导致动物神经毒性损伤的作用机制之一。     

铅镉联合对新生大鼠大脑皮质神经细胞形态学损伤的研究

为了观察铅、镉及其联合对新生大鼠大脑皮质神经细胞的形态学影响,本试验通过对原代培养的新生大鼠大脑皮质神经细胞经提取、纯化和鉴定后,分九组进行单独或联合染毒,染毒时间为12 h,显微镜观察神经细胞形态并测量其胞体短直径和突起长度的变化.结果显示,与对照组相比,各试验组神经细胞密度降低,神经网络减少;各试验组神经细胞胞体短直径显著减小(P<0.05),突起长度显著变短(P<0.05);随铅、镉单剂量作用浓度的增加,神经细胞胞体短直径和突起长度有减小趋势,但组问差异不显著(P>0.05).与相应铅、镉单独染毒组比较.各铅镉联合染毒组神经细胞胞体短直径减小、突起长度变短更加明显,部分组间差异显著(P<0.05).结果表明,铅、镉作用浓度与神经细胞形态改变存在明显的剂量一效应关系,铅镉联合表现协同毒性效应.     

大鼠脑皮质微血管内皮细胞的分离培养及鉴定

本研究目的在于建立一种简易可行、获得细胞纯度较高的体外分离、培养大鼠脑皮质微血管内皮细胞的方法,为进一步研究其功能打好基础。新生SD大鼠,分离大脑皮质,经匀浆、两步过滤法获得大鼠脑微血管段,用胶原酶消化后,在37℃、5%CO2培养箱中进行原代细胞培养。通过差速消化和差速贴壁方法并结合倒置显微镜下形态学的观察进行传代和纯化,利用第Ⅷ因子相关抗原免疫荧光检测法对培养的细胞进行鉴定。结果显示:成功分离培养了大鼠脑微血管内皮细胞,倒置显微镜下单个细胞呈多角形,互相融合后呈"铺路石"样,单层贴壁生长;免疫荧光检测第Ⅷ因子相关抗原呈阳性。说明本研究建立的大鼠脑微血管内皮细胞的体外培养方法,程序简单,获得的细胞纯度较高。     

苦马豆素对新生SD大鼠大脑皮质神经细胞形态学损伤作用的研究

通过建立新生SD大鼠大脑皮质神经细胞原代体外培养模型,采用MTT法测定一个生长周期内神经细胞的活性分布,运用寇氏法计算苦马豆素对大鼠大脑皮质神经细胞的IC50。然后用不同质量浓度苦马豆素染毒12h,倒置相差显微镜观察神经细胞形态并测量其胞体短直径和突起长度的变化。结果显示,一个生长周期内的大鼠大脑皮质神经细胞活力最强为培养第5天,苦马豆素对大鼠大脑皮质神经细胞的IC50为0.851 1g/L。与对照组相比,各试验组神经细胞密度降低,神经网络减少;除0.5g/L试验组外,其他各试验组神经细胞胞体短直径显著减小（P〈0.05）,突起长度显著变短（P〈0.05）,但组间差异不显著（P〉0.05）。结果表明,苦马豆素能明显影响新生大鼠大脑皮质神经细胞的生长发育,苦马豆素作用质量浓度与神经细胞形态改变存在明显剂量-效应关系。     

GDNF对缺气损伤的体外培养新生儿大鼠背根节神经元的作用

运用体外缺气损的细胞模型，研究GDNF对损伤的新生儿大鼠背根节神经元（DRG）是否有保护作用。采用原代培养的方法，用N1无血清培养基分离培养DRG神经元24h后，加入含20μg/mL GDNF的无血清培养液，然后液体石蜡封闭培养液，继续培养4，8，12，24h，分别做MTT实验检测细胞活性OD值，台盼蓝染色记数，细胞部蛋白测定活性OD值，台盼蓝染色记数，细胞总蛋白测定以及形态学观察突起生长状况，结果表明：（1）封闭12h后GDNF组的DRG细胞存活数同对照组相比有显著升高（＊＊P＜0．01），其余各时间点均无显著性差异，缺气损伤8h和12h后，GDNF组的DR细胞总蛋白较对照组显著升高（＊＊P＜0．01，＊＊P＜0．05），其余各时间点均无显著性差异；（2）各时间点DRG细胞活性及突起长度的变化差异均不显著，缺气损伤一定时间的GDNF对新生大鼠DRG细胞的存活数及细胞总蛋白有明显的保护作用，而对细胞活性及突起的生长则没有明显的促进作用。     

敌百虫对大鼠大脑皮质神经细胞的形态学损伤

为探讨敌百虫对大鼠大脑皮质神经细胞的毒性作用,本研究在建立体外培养新生24h内SD大鼠大脑皮质神经细胞模型的基础上,在细胞培养液中添加0,5,20,80,100,200mg/L敌百虫染毒,于染毒后不同时间观察神经细胞形态,测定胞体短直径、突起长度。结果表明：①染毒12,24h均可不同程度抑制大脑皮质神经细胞的增殖,染毒组的细胞存活率均低于对照组;②染毒12h使细胞超微结构发生改变,表现细胞核皱缩、线粒体嵴模糊、线粒体肿胀变形;③染毒12h使细胞凋亡率明显增加;Hoechst 33258荧光染色,染毒组细胞核皱缩,呈新月形甚至核碎裂等典型的凋亡特征。表明不同质量浓度的敌百虫暴露可致大鼠大脑皮质神经细胞存活率降低,细胞形态损伤,细胞凋亡率升高。     

大鼠表皮干细胞的分离培养

为探索一种简单而又高效的分离大鼠表皮干细胞(ESCs)的方法,采用酶消化法和组织块法对大鼠表皮干细胞进行分离、培养;并用Ⅳ型胶原快速黏附法筛选大鼠表皮干细胞,免疫组织化学方法检测CK15、P63、β1-integrin和α6-integrin表达情况;同时,测定ESCs单细胞克隆与克隆形成率及表皮干细胞生长曲线.结果表明,采用组织块法和酶消化法均能分离得到大鼠表皮干细胞,获得的细胞生长良好,具有较高的克隆形成率,前者可传至第6代,而后者传至3代～4代便分化;干细胞标记物CK15、P63、β2-integrin和α6-integrin均呈阳性;酶消化法和组织块法均能成功地分离、纯化和培养大鼠表皮干细胞,组织块法相对较好.     

大鼠表皮干细胞的分离及鉴定

在试验中采用组织块法分离培养大鼠表皮干细胞,观察所培养的细胞形态,免疫组织化学方法检测CK15、P63、α6-integrin表达情况并用α6-integrin标记表皮干细胞经流式细胞仪检测其标记率,同时对1~6代表皮干细胞在不同培养时间计数。结果表明,采用组织块法能分离得到大鼠表皮干细胞,且获得的细胞生长良好;干细胞标记物CK15、α6-integrin、P63呈阳性。经流式细胞仪检测得知,黏附细胞被α6-integrin标记的几率为80%,而未黏附细胞被α6-integrin标记的几率仅为2%,二者相差较大。     

饲养层细胞对胚胎干细胞的影响及其分离培养的影响因素

胚胎干细胞及其相关研究是生命科学领域中最有活力、最有影响力、最有应用前景的研究方向之一，它与遗传工程，转基因技术等相结合具有重大的理论意义与实践价值。饲养层细胞在胚胎干细胞分离培养的过程中起着异常重要的作用。作者结合实践经验就饲养层细胞对胚胎干细胞的影响进行了概述，介绍了饲养层细胞的分类，并分析了饲养层细胞分离培养的影响因素。     

西门塔尔牛表皮干细胞的分离培养与生物学特性研究

旨在建立西门塔尔牛表皮干细胞(epidermal stem cell, EpSCs)分离培养体系,探究其生物学特性,为西门塔尔牛种质资源保存提供新方法,为干细胞治疗研究提供种子细胞。采用3～4月龄西门塔尔牛背部表皮,通过酶消化法和组织贴壁法两种方法分离培养西门塔尔牛EpSCs,绘制EpSCs生长曲线探讨其增殖能力。通过免疫荧光鉴定EpSCs表面标记物(ITG β1、P63和CD71),通过RT-PCR分析EpSCs特异性基因(ITG β1、KRT19和ITG α6)表达情况。通过体外诱导EpSCs分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞检测其分化潜能。结果显示,组织块贴壁法获得的EpSCs纯度较低,酶消法获得的EpSCs纯度较高,细胞传代至P28代时开始逐渐老化。EpSCs细胞生长曲线呈“S”型。免疫荧光结果显示EpSCs表面特异性标记物ITG β1、P63和CD71呈阳性表达,RT-PCR结果显示EpSCs高度表达ITG β1、KRT19和ITG α6,不表达CD31基因。EpSCs诱导分化脂肪细胞时,产生可被油红O着色的脂滴,经鉴定细胞阳性表达脂肪细胞PPAR-γ和LPL特异性基因。Ep...     

猪雄性生殖干细胞的分离培养及鉴定

本试验旨在探索猪雄性生殖干细胞(mGSCs)体外分离、培养的适宜条件,建立猪雄性生殖干细胞体外培养体系。采用两步酶消化法对新生小猪睾丸生殖干细胞进行了体外分离和初步的培养鉴定,并利用层黏连蛋白和明胶的不同贴壁特性,比较2种差易贴壁分选方法的富集效果,并对传代后的干细胞培养1周后进行碱性磷酸酶染色鉴定,通过免疫荧光技术检测培养细胞是否表达干细胞标志蛋白OCT-4。试验结果表明,层黏连蛋白更适用于猪生殖干细胞的富集、培养,细胞分选效率及增殖生长明显优于采用明胶分选的方法。培养的mGSCs拥有与小鼠mGSCs相同的形态、增殖及表达特征。鉴定结果显示,生长细胞克隆碱性磷酸酶染色呈阳性,支持细胞碱性磷酸酶染色呈阴性;培养的生殖干细胞克隆表达转录蛋白OCT-4,而饲养层支持细胞OCT-4抗体染色则呈阴性。结果表明培养的干细胞克隆仍保持较好的干细胞活性,保持正常的自我复制和分化潜能,初步建立了生殖干细胞培养体系。     

家禽胚胎干细胞分离培养的影响因素及其细胞生物学特性鉴定

家禽的胚胎干细胞与遗传工程，转基因技术相结合的综合性研究具有重大的理论意义与实践价值。文章就家禽胚胎干细胞、胚胎生殖细胞研究背景，分离培养的影响因素。生物学特性的检测方法进行了阐述，较为详细地分析了分离培养的影响因素及细胞生物学特性鉴定，并对家禽胚胎干细胞的前景进行了展望。     

盘羊脐带间充质干细胞的分离培养及诱导分化

试验旨在研究野生盘羊脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs）的分离、培养及体外多向分化潜能等生物学特性。取盘羊分娩后的新生雄性胎儿脐带,采用组织块培养法分离盘羊UC-MSCs后进行体外培养,并对UC-MSCs进行成骨、成软骨和成脂诱导分化,检测其多向分化潜能。结果显示,应用组织块培养法获得的盘羊UC-MSCs具有UC-MSCs特有的呈簇、成纤维状的特性,细胞呈"S"型曲线生长,细胞的倍增时间平均为33.50 h,且可以向成骨细胞、成软骨细胞和成脂细胞分化。诱导分化特异性染色结果表明,野生盘羊UC-MSCs经诱导后的成骨细胞经茜素红S染色呈现典型的橙红色钙沉积物聚集,成软骨细胞经阿利新蓝染色呈现蓝色的软骨基质,成脂细胞经油红O染色呈现深红色的脂滴。实时荧光定量PCR检测结果发现,随着诱导时间的延长,成骨分化的细胞中骨内γ-羧基谷氨酸蛋白（BGLAP）、骨桥蛋白基因（OPN）、Runt相关转录因子2（RUNX2）基因的相对表达量极显著升高（P<0.01）;成软骨分化的细胞中光蛋白聚糖（LUM）基因的表达量明显增加,而双糖链蛋白多糖（BGN）和Y染色体性别决定区基因盒9（SOX9）基因表达量极显著提高（P<0.01）;成脂分化的细胞中脂蛋白酶（LPL）和过氧化物酶体增殖因子活化受体γ（PPAR-γ）基因的相对表达量极显著上升（P<0.01）。试验结果表明,用盘羊胎盘附带的脐带组织可以分离到盘羊UC-MSCs,且分离到的UC-MSCs具有分化为成骨细胞、成软骨细胞及成脂细胞等多向分化潜能。     

西门塔尔牛牙龈间充质干细胞的分离鉴定及诱导分化

本研究旨在建立西门塔尔牛牙龈间充质干细胞（gingival mesenchymal stem cells,GMSCs）体外分离培养体系,并对其生物学特性进行探讨,为细胞治疗、再生医学等提供种子细胞。取14周龄西门塔尔牛牙龈,采用0.1%Ⅳ型胶原酶消化法分离GMSCs,进行体外培养和冷冻保存,测定冻存前后细胞活率,MTT检测法绘制GMSCs生长曲线;通过免疫荧光、流式细胞术和PCR等方法鉴定西门塔尔牛GMSCs特异性标记物（CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166和STRO-1）,并通过体外成脂、成骨诱导检测其多向分化潜能。结果表明,西门塔尔牛GMSCs折光性强、贴壁后呈长纺锤形;冻存前和复苏后细胞的活率检测结果显示,细胞复苏后的活率均小于冻存前的活率,但均维持在85%以上,细胞生长曲线呈典型的S型;免疫荧光结果显示,西门塔尔牛GMSCs表达CD29、CD105和STRO-1,不表达CD31;PCR结果显示,西门塔尔牛GMSCs表达CD44、CD73、CD90和CD166,不表达CD34和CD45;流式细胞术结果显示,西门塔尔牛GMSCs高表达CD73（99.94%）、CD90（99.87%）和CD105（99.90%）,几乎不表达CD34（1.16%）和CD45（1.18%）;成脂诱导分化后,可见大小不一的脂滴,脂滴可被油红O染色,且PCR检测结果表明其表达成脂关键基因过氧化物酶体增殖因子活化受体-γ（PPAR-γ）和脂蛋白酶（LPL）;成骨诱导分化后,可见被茜素红染色的矿化结节,且PCR检测结果表明其表达成骨关键基因Ⅰ型胶原蛋白（CollagenⅠ）和骨桥蛋白基因（OPN）。综上,本研究成功分离出西门塔尔牛GMSCs,建立了西门塔尔牛GMSCs体外分离、培养体系,并通过成脂和成骨诱导分化证明其具有多向分化潜能,结果可为再生医学和牙齿修复等研究提供参考。     

猪精原干细胞体外分离培养及移植的研究进展

精原干细胞（spermatogonial stem cells,SSCs）位于睾丸曲细精管基底小室内,因其具有持续的自我更新能力和分化为精子的能力,被认为是雄性哺乳动物体内唯一能将自身遗传物质传递给后代的成体干细胞。对SSCs的研究已成为干细胞学科研究的热点之一,但目前SSCs的研究多集中于啮齿类动物,而猪SSCs（porcine SSCs,pSSCs）的研究进展相对落后,主要是由于存在以下几个问题：睾丸中pSSCs本身数量极少,且缺乏特异的分子标记;pSSCs的分离纯化技术仍不成熟;pSSCs体外培养体系仍不够完善。这些问题的存在导致pSSCs分离纯化效率低,并且难以在体外长期稳定培养及传代,以至于pSSCs的相关机理研究缺乏稳定的材料,为其体外研究及应用带来了不便。基于以上现状,文章总结了pSSCs体外分离培养及移植的研究进展,详细介绍了pSSCs的分子标记、分离纯化和体外培养的相关方法,以及pSSCs移植技术的研究现状,旨在为pSSCs研究提供参考,以期加快pSSCs在猪的遗传育种与繁殖领域以及男性生殖医学领域的研究和应用。