猪心型脂肪酸结合蛋白基因的克隆及不同生长阶段表达的差异

从1,30,50,70和90kg左右的杜长大猪肌肉组织中提取基因组RNA,用RT-PCR扩增猪心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因,获得1条211bp的片段,以pGEM-T为载体,将该基因片段克隆到大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α中。从筛选到的阳性克隆中分离出脂肪酸结合蛋白基因,测定其序列。分析表明,该片段为脂肪酸结合蛋白基因cDNA的部分序列,与已报道的猪肌肉组织中的H-FABPcDNA部分序列同源性达到99%。以H-FABP基因片段的克隆为基础,构建了优化的半定量RT-PCR法,以18SrRNA为内标,研究不同生长阶段猪肌肉组织中H-FABP基因表达的差异。结果表明,从出生到50kg,猪H-FABP基因表达呈下降趋势;50～90kg阶段,H-FABP基因的表达又有所上升。     

菜心BrcuFCA基因的克隆与表达分析

本文以菜心（Brassica campestris L.ssp.chinensis（L.）Makino var.utilis）为实验材料,比较了Trizol法、改进Trizol法及改良SDS法提取菜心总RNA的效果。结果表明改进Trizol法集中了操作简单、耗时短、所需试剂种类少,且完整性好,产量和纯度均高等多重优点,成为提取菜心总RNA首选方案。同时文章以甘蓝型油菜及其它物种的FCA保守区设计引物,将质量高的菜心总RNA反转录合成cDNA,通过RT-PCR从菜心的早、晚熟品种中均克隆得到与开花有关的基因片段,将之命名为BrcuFCA,片段长1001bp,GenBank登录号为EU700363,与甘蓝型油菜及拟南芥FCA氨基酸同源性分别达到了98%和82%。另一方面,本研究还利用半定量RT-PCR研究了BrcuFCA不同时空表达特性,并结合已发表的开花调控遗传途径中两个关键基因BrcuFLC和BrcuFRI时空表达特性研究结果,推测菜心主要的抽薹开花途径不是春化和FRI-依赖途径,而很可能是自主开花途径。本研究为菜心抽薹开花分子机理的研究提供理论依据。     

猪SOCS3基因克隆及其在不同生长阶段表达差异研究

从杜长大母猪的肠系膜脂肪中提取基因组RNA，用RT-PCR扩增SOCS3基因，获得1条约332 bp的片段，以pGEM-T Easy vector 为载体，将该基因片段克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α中。从筛选的阳性克隆中分离出SOCS3基因，测定其序列，分析表明，该片段为 SOCS3 cDNA的部分序列，与GenBank中登录的猪SOCS3 cDNA部分核苷酸序列同源性达到100%。以SOCS3基因片段的克隆为基础，构建了优化的半定量RT-PCR法，以18s rRNA为内标，研究不同生长阶段猪肠系膜脂肪中SOCS3基因表达的差异。结果发现，从初生到90 kg，SOCS3基因在肠系膜脂肪中表达量呈逐渐增加的趋势，其中90 kg较初生时增加了141％（p<0.05）。     

广西沼泽型水牛γ-干扰素基因的克隆与原核表达

本研究克隆了广西沼泽型水牛γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)基因,并构建了水牛IFN-γ原核表达质粒。从健康沼泽型水牛静脉无菌采血,分离外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),用刀豆素A(Concanavalin A,ConA)诱导培养13 h后,提取细胞总RNA,用水牛IFN-γ基因特异性引物通过RT-PCR扩增水牛IFN-γ成熟肽编码区cDNA序列,将其克隆到pMD18-T载体中。RT-PCR产物电泳可见约457 bp大小目的片段。经过限制性酶切分析,测序证实克隆得到的基因序列正确。将IFN-γ成熟肽编码区基因片段切下亚克隆到表达载体pET-32a 中,构建成重组表达质粒pET-mIFN-γ。PCR、双酶切电泳和序列测定结果均证实已插入约457 bp的IFN-γ基因片段。经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导,水牛IFN-γ基因在大肠杆菌中获得了高效的表达,融合蛋白的分子量为35 ku,表达量占菌体总蛋白的43.6%。     

Cloning of Heart-type Fatty Acid-binding Protein (H-FABP ) Gene of Swine and Difference of Its Expression at Different Stages

从1, 30, 50, 70和90 kg左右的杜长大猪肌肉组织中提取基因组RNA，用RT-PCR扩增猪心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP）基因，获得1条211 bp的片段，以pGEM-T 为载体，将该基因片段克隆到大肠杆菌(Escherichia coli ) DH5α中。从筛选到的阳性克隆中分离出脂肪酸结合蛋白基因，测定其序列。分析表明,该片段为脂肪酸结合蛋白基因cDNA的部分序列，与已报道的猪肌肉组织中的H-FABP cDNA部分序列同源性达到99%。以H-FABP基因片段的克隆为基础，构建了优化的半定量RT-PCR法，以18S rRNA为内标，研究不同生长阶段猪肌肉组织中H-FABP基因表达的差异。结果表明，从出生到50 kg，猪H-FABP基因表达呈下降趋势；50～90 kg阶段, H-FABP基因的表达又有所上升。     

猪脂蛋白脂酶基因片段的克隆及不同体重的表达差异

从杜长大母猪的肠系膜脂肪中提取基因组RNA，用RT-PCR扩增脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase LPL)基因，获得1条约689 bp的片段，以pGEM-T Easy vector 为载体，将该基因片断克隆到大肠杆菌(Escherichia coli )DH5α中。从筛选的阳性克隆中分离出LPL基因，测定其序列。分析表明，该片段为LPL cDNA的部分序列，编码229个氨基酸组成的多肽。研究得到的基因片段与报道的猪脂肪组织中LPL cDNA部分序列同源性达到98%，氨基酸序列同源性达到99.1％。以LPL基因片段的克隆为基础，构建了优化的半定量RT-PCR法，以β-actin 为内标，研究不同体重猪脂肪组织LPL基因表达的差异。结果发现，从刚出生到30 kg，LPL基因表达呈上升趋势，在30～50 kg，LPL基因表达呈下降趋势，50～90 kg，LPL基因表达又呈上升趋势。     

旱生植物梭梭actin基因片段的克隆及表达模式分析

本研究根据其它植物actin基因的保守序列设计一对简并性引物,以3周龄梭梭整株总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增出actin基因片段并克隆到PUCm-T载体,阳性克隆经PCR检测后进行测序。序列分析结果表明：该片段长约598 bp,编码198个氨基酸;该序列与GenBank中现有的植物Actin比对发现,同源性均高达84%,同时,翻译得到的氨基酸序列与其它植物的氨基酸序列同源性高达99%。表达实验分析表明在不同胁迫条件下该基因在梭梭不同组织中表达量恒定,可作为内参基因。梭梭actin基因片段的克隆可为研究重要抗逆功能基因在梭梭中的表达和调控机制奠定基础。     

猪骨髓抗菌肽 PMAP-37 基因片段的克隆及不同体重的表达差异

从杜长大母猪的股骨骨髓中提取基因组RNA，用RT-PCR 扩增抗菌肽PMAP-37 基因，获得1 条约282 bp 的片段，以pGEM-T Easy vector 为载体，将该基因片断克隆到大肠杆菌(Escherichia coli )DH5α 中。从筛选的阳性克隆中分离出PMAP-37 基因，测定其序列。分析表明，该片段为PMAP-37 cDNA 的部分序列，编码167 个氨基酸组成的多肽。研究得到的基因片段与报道的猪骨髓抗菌肽PMAP-37 cDNA 部分序列同源性达到98%。以PMAP-37 基因片段的克隆为基础，构建了优化的半定量RT-PCR 法，以18S rRNA 为内标，研究不同体重猪骨髓抗菌肽PMAP-37 基因表达的差异。结果发现，从刚出生到20 kg，PMAP-37 基因表达呈上升趋势，在20～40 kg，PMAP-37 基因表达呈下降趋势，40～60 kg，PMAP-37 基因表达又呈上升趋势，在60～90 kg，PMAP-37 基因表达呈下降趋势。     

改良CTAB法从采后荔枝（Litchi chinensis Sonn.）果皮中提取总RNA

成熟荔枝果实的果皮中多酚、花色素苷、多糖、蛋白质等物质含量较高。内源RNAase活性也上升，使得从中提取高质量RNA较为困难。丁晓东0999）、张以顺等（2004）曾分别探索了从荔枝果实组织中提取总RNA的方法。但用这些方法都不能从荔枝果皮中得到高产率或高质量的总RNA。在综合比较多种方法的基础上。本实验对CTAB法（山蓝等，2002）作了改良．成功地从采后荔枝果皮中提取了可用于反转录的RNA。     

猪肥胖基因片断的克隆及不同日龄猪肥胖基因表达的差异

从杜长嘉(Duroex Landracex Taihu)猪的皮下脂肪中提取基因组RNA，用RT-PCR扩增肥胖基因(obesegene；ob)，获得1条504bp的片断，以pGEM-T Easy Vector为载体，将该基因片断克隆到大肠杆菌(Eschenchia coli)中。从筛选到的阳性克隆中分离出肥胖基因，测定其序列，分析表明该片段为肥胖基因cDNA的部分序列，编码167个氨基酸组成的多肽，是成熟肽的主体部分。研究得到的基因片段与报道的猪脂肪组织中ob cDNA部分序列同源性达到99．41％。氨基酸序列同源性达到98．94％。以ob基因片段的克隆为基础，构建了优化的半定量RT-PCR法，以β-actin为内标，研究不同日龄的猪脂肪组织ob基因表达的差异，1-28日龄ob基因表达呈上升趋势，28日龄达到最高，随后，到56日龄ob基因表达又呈下降趋势。     

早酥梨病程相关基因非表达子1基因（NPR1）克隆及原核表达

本研究以成年早酥梨(Pyrus bretschneideri cv.Zaosu)叶片为材料,通过RT-PCR克隆早酥梨病程相关基因非表达子1基因(NPR1)并获得其全长序列1771 bp,开放阅读框为1761 bp,编码586个氨基酸(GenBank登录号:FJ769372).利用NCBI/Blastp和ClustalX软件进行相似性分析表明,目的基因编码蛋白质序列与日本梨(p.pyrifolia)、秋子梨(P.ussuriensis)、苹果(Malus xdomestica)、烟草(Nicotiana tabacum)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)的NPR1蛋白相似性分别为99%、98%、98%、67%和59%.将其连接pGEX-4T-1原核表达载体并转化大肠杆菌(EScherichia coli)BL21,经IPTG诱导表达获得大小约为91 kD的目的融合蛋白,融合蛋白主要以包涵体形式表达,表达量约占总蛋白17%.     

高铝低磷胁迫对胡枝子生长及矿质元素吸收的影响

限制酸性土壤作物生长的最重要、最普遍的因子是Al3+ 的毒害和 P 的缺乏.本文用溶液培养试验研究两种不同生态型的二色胡枝子在高Al低P胁迫下的矿质营养元素积累情况.试验表明,江西胡枝子比河北胡枝子更耐低 P 低 pH 的生长环境,但两者间耐Al性无显著差异;100 μm/L Al 处理显著地抑制了两种胡枝子对 Ca 的吸收,降低了根系 Mg 的积累量,对植株的 K、P、Fe、Zn、Cu 含量没有显著影响;低 P 处理没有显著降低两种胡枝子对 Ca、K、Fe、Zn、Cu 和江西胡枝子对 Mg 的吸收,但是低 P 处理显著降低了河北胡枝子对 Mg 的吸收和转运.二色胡枝子植株吸收的 Al 主要积累在根部,地上部分Al含量仅是根系的1% 左右.     

白沙蒿肌动蛋白基因核心片段的克隆和序列分析

本研究以荒漠植物白沙蒿总RNA为模板,运用RT-PCR方法扩增出肌动蛋白基因核心序列。将获得的片段克隆到T载体后进行测序,序列分析表明：白沙蒿肌动蛋白基因核心片段长599bp,编码198个氨基酸。将该序列在GenBank中注册,并与多种植物肌动蛋白序列进行同源性比较,发现该片段的核酸序列同源性在75％以上,氨基酸序列同源性在85％以上,具有高度保守性。     

美洲商陆抗病毒蛋白真核表达载体的构建及在毕赤酵母中的表达

摘要：从美洲商陆（Phytolacca americana）叶片中通过异硫氰酸胍法提取出了总RNA,经RT-PCR扩增出缺失突变型抗病毒蛋白PAP基因,将该基因克隆于分泌型真核表达载体pPIC9K,然后导入毕赤酵母(Pachia pastoris )菌株GS115细胞。在甲醇的诱导下,经过酵母高密度发酵进行PAP的表达,经SDS-PAGE分析。结果表明,在培养基上清液中含有一明显的特异性蛋白条带,大小为34 kD,经Western-blotting分析,该蛋白与法国PAP抗血清有特异性反应,体外活性检测表明该蛋白对病毒的侵染性具有高度的抑制性,表明该基因在毕赤酵母GS115中得到了表达。     

两种灌木根系对异质生长空间的适应分布特征

为探究灌木根系对异质空间的适应策略,以紫穗槐和胡枝子两种灌木为研究对象,采用盆栽控制生长空间的研究方法,以放置不同形状的木板在盆内模拟不同喀斯特异质空间条件(孔隙型、圆形裂缝型、条形裂缝型和孔隙+岩石阻挡型),研究了异质空间条件下两种灌木根系分布特征。结果表明:(1)异质空间条件下紫穗槐和胡枝子根系各项指标均高于均质空间,异质空间条件对根系生长有促进作用。不同植物受异质空间的影响程度不同,胡枝子在异质空间下的根系生物量显著高于均质空间。不同异质空间对根系生长的影响不同,紫穗槐和胡枝子根系均在孔隙型和圆形裂缝型两种空间条件下最为发达。(2)紫穗槐和胡枝子根生物量分布特征受异质空间影响。在异质空间下两种树种根生物量的垂直分布均集中分布在土层深度5—10 cm和15—20 cm范围内,水平分布均集中分布在距植株中心0—3 cm内。紫穗槐根系生物量的水平分布受异质空间具体形状影响较大,孔隙型空间和圆形裂缝型空间对其水平分布影响较为显著。(3)两种灌木对异质空间的适应策略不同,紫穗槐根系对异质空间的适应策略为寻找更多空间,而胡枝子根系对异质空间的适应策略为占据有限空间。综上,紫穗槐和胡枝子根系生...     

烟草扭脉病毒部分基因组特征及其分类地位分析

通过RT-PCR从烟草丛顶病发病烟株总RNA中获得烟草扭脉病毒（Tobacco vein distorting virus,TVDV）基因组部分序列。序列分析显示该片段全长1655bp,共包含TVDV的部分RdRp基因、完整的CP基因和完整的MP基因。其中RdRp基因与CP基因的间隔区（IR）长201nts,符合马铃薯卷叶病毒属病毒的归属依据;对RdRp、CP、MP基因以及IR序列的对比分析,显示了TVDV与黄症病毒科马铃薯卷叶病毒属病毒的较高同源性。根据三个ORF编码的氨基酸序列构建的分子同源树的分析,也都显示了TVDV与黄症病毒科马铃薯卷叶病毒属病毒的同源性最高,进一步证实了TVDV应该是黄症病毒科马铃薯卷叶病毒属的确定成员。     

鸡、猪BPI氨基端的基因克隆和鉴定

为了克隆杀菌/通透性增加蛋白(BP I)N端cDNA,构建重组体pM D 18-T-BP I,并进行序列鉴定,应用RT-PCR技术,参照G enB ank报道的预测序列,从鸡多形核白细胞(PM N)mRNA中扩增出杀菌/通透性增加蛋白(BP I)氨基端95个氨基酸的基因片段,并与pM D 18-T连接,构建BP I氨基端的基因重组体,进行酶切鉴定和序列测定;从猪PM N的总mRNA中扩增出BP I氨基端48个氨基酸的基因片段,进行测序鉴定。获得鸡BP I N端长度为285 bp的基因片段。序列分析证实该片段中有3个点突变,但均不在活性中心;获得猪BP IN端长度为146 bp的基因片段。成功克隆出BP I N端基因,经序列测定,确认为BP I基因,为进一步表达该基因奠定了基础。