螨ace/S154G突变型原核表达载体的构建及其蛋白纯化

【目的】体外表达朱砂叶螨乙酰胆碱酯酶突变型ace/S154G来探究世界性害螨AChE S154位点的功能。【方法】构建pET-30a/ace/S154G重组表达载体,诱导表达后纯化目的蛋白,并进行Western Blot检测。【结果】ace/S154G在pET-30a载体上成功高水平表达,对AChE/S154G进行大量表达和纯化,经Western Blot验证,获得纯度较高的目的蛋白。【结论】实现ace/S154G体外高效原核表达,获得AChE/S154G突变体重组蛋白,为探明朱砂叶螨AChE的S154位点的功能,研发新型选择性杀螨剂奠定基础。     

二斑叶螨几丁质酶基因的原核表达及多克隆抗体制备

以制备的二斑叶螨c DNA为模板,克隆二斑叶螨几丁质酶Se Chi基因功能结构域催化区片段,大小为786 bp。将该序列片段克隆到表达载体p ET-32a(+)中,获得多克隆原核表达载体p ET-32a-Tu Chi。重组质粒经酶切测序鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3),经0.6 mmol·L-1IPTG诱导4 h后高效表达约45 ku可溶性重组蛋白;经His亲和层析洗脱和浓缩获得高纯度的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备Tu Chi多克隆抗体。制备的多克隆抗体经Western Blot证实能特异性地识别几丁质酶而不与非特异性蛋白结合。ELISA分析表明制备的抗体效价达1??80 000,效价较高,为进一步研究二斑叶螨几丁质酶相关功能奠定基础。     

朱砂叶螨几丁质酶TecCht1基因的原核表达与纯化

【目的】朱砂叶螨是世界范围广泛分布的重要经济害螨,害螨防治十分困难。而几丁质酶是昆虫体内几丁质代谢中分解几丁质的关键酶,在更替新旧表皮和降解围食膜中起着重要的作用,几丁质酶是潜在的螨害生物防治靶标。本研究对朱砂叶螨几丁质酶TecCht1进行原核表达和纯化。【方法】克隆朱砂叶螨TecCht1基因的催化结构域,连接到pCold Ⅱ载体上,构建pCold Ⅱ/TecCht1重组表达载体,在大肠杆菌中进行高效表达,采用镍柱纯化目的蛋白,并进行Western Blot检测。【结果】TecCht1在pCold Ⅱ载体上成功高水平表达,确定最佳诱导表达时间为24 h。对TecCht1进行大量表达和纯化,经Western Blot验证,获得纯度较高的目的蛋白。【结论】实现TecCht1体外高效原核表达,获得大量的TecCht1重组蛋白。     

朱砂叶螨几丁质酶TecCht1基因的原核表达与纯化

【目的】朱砂叶螨是世界范围广泛分布的重要经济害螨,害螨防治十分困难。而几丁质酶是昆虫体内几丁质代谢中分解几丁质的关键酶,在更替新旧表皮和降解围食膜中起着重要的作用,几丁质酶是潜在的螨害生物防治靶标。本研究对朱砂叶螨几丁质酶TecCht1进行原核表达和纯化。【方法】克隆朱砂叶螨TecCht1基因的催化结构域,连接到pColdⅡ载体上,构建pColdⅡ/TecCht1重组表达载体,在大肠杆菌中进行高效表达,采用镍柱纯化目的蛋白,并进行Western Blot检测。【结果】TecCht1在pColdⅡ载体上成功高水平表达,确定最佳诱导表达时间为24h。对TecCht1进行大量表达和纯化,经Western Blot验证,获得纯度较高的目的蛋白。【结论】实现TecCht1体外高效原核表达,获得大量的TecCht1重组蛋白。     

朱砂叶螨几丁质酶TecCht1基因的原核表达与纯化

【目的】朱砂叶螨是世界范围广泛分布的重要经济害螨,害螨防治十分困难。而几丁质酶是昆虫体内几丁质代谢中分解几丁质的关键酶,在更替新旧表皮和降解围食膜中起着重要的作用,几丁质酶是潜在的螨害生物防治靶标。本研究对朱砂叶螨几丁质酶TecCht1进行原核表达和纯化。【方法】克隆朱砂叶螨TecCht1基因的催化结构域,连接到pCold Ⅱ载体上,构建pCold Ⅱ/TecCht1重组表达载体,在大肠杆菌中进行高效表达,采用镍柱纯化目的蛋白,并进行Western Blot检测。【结果】TecCht1在pCold Ⅱ载体上成功高水平表达,确定最佳诱导表达时间为24 h。对TecCht1进行大量表达和纯化,经Western Blot验证,获得纯度较高的目的蛋白。【结论】实现TecCht1体外高效原核表达,获得大量的TecCht1重组蛋白。     

朱砂叶螨抗药性测定及防治

玻片法测定表明，朱砂叶螨对三氯杀螨醇，水胺硫磷，克螨特的抗药性为３．６６－３９．７７倍。温室，大棚内的冬秧等寄主上越冬的个体达９２．６６％；每年有４－５个危害高峰，种群高峰出现在种群增长高峰后７－１０天。中雨，大雨，暴雨对种群增长有抑制作用。     

牵牛子种子提取物对朱砂叶螨触杀活性的测定

 【目的】研究牵牛子石油醚提取物中流分8对朱砂叶螨生物活性的作用机理。【方法】采用玻片浸渍法和叶片残毒法测定了流分8对朱砂叶螨成螨和卵的室内毒力,并采用生化方法测定了谷胱甘肽-S-转移酶、乙酰胆碱酯酶、单胺氧化酶、Ca2+-ATP酶活性的影响,通过透射电镜观察流分8对螨体内亚显微结构的破坏。【结果】流分8对朱砂叶螨成螨和卵均有很强的生物活性,对成螨和卵的LC50分别是0.4686 mg?ml-1和1.2212 mg?ml-1,LC90分别是2.5935 mg?ml-1和3.1234 mg?ml-1。牵牛子流分8处理朱砂叶螨后,螨体内解毒酶谷胱甘肽-S-转移酶被激活,这说明流分8中存在对朱砂叶螨有毒的物质;而乙酰胆碱酯酶、单胺氧化酶、Ca2+-ATP酶均受到不同程度的抑制,这可能引起神经传递的阻断,从而导致螨体的死亡。透射电镜下可见,流分8对螨体内表皮结构、肌纤维、细胞核膜、线粒体、内质网等均有不同程度的破坏。【结论】牵牛子可以有效杀死朱砂叶螨,作为新型植物源农药具有一定的开发价值。     

原核表达牦牛朊蛋白的纯化及其活性测定

以原核表达的GST-BoPrP(23～242)融合蛋白为抗原,免疫BALB/C小鼠,制备抗牦牛朊蛋白的特异性抗血清。经Western blotting和间接ELISA鉴定,该抗血清可与牦牛重组成熟PrP(23～242)和牛脑组织提取物发生反应,蛋白酶K消化各抗原可消除免疫反应,但不与GST蛋白和E.coli BL21(DE3)的菌体蛋白发生反应,表明该抗血清为抗牦牛重组成熟PrP(23～242)的抗血清,其效价高达1∶12800,并能识别黄牛脑组织中的天然朊蛋白。原核表达的GST-BoPrP(23～242)融合蛋白能有效地刺激免疫动物产生PrP特异性抗体,所制备的抗血清可适用于天然朊蛋白的检测。     

5种植物提取物对朱砂叶螨的触杀活性测定

为筛选高效的植物源杀螨活性物质,采用玻片浸渍法测定了泽漆、牛至、车前草、龙葵和铁苋5种植物乙醇提取物对朱砂叶螨的触杀活性。结果表明:当提取物质量浓度为2 mg/mL时,铁苋乙醇提取物对朱砂叶螨的触杀效果在24 h和48 h均极显著于其他4种植物(P0.01),校正死亡率分别为33.63%和85.21%。根据初筛结果对铁苋进行不同极性溶剂的生物活性测定,得到氯仿提取物杀螨活性(48 h)极显著高于石油醚和乙醇提取物(P0.01),校正死亡率为90.28%。进一步采用喷雾法对铁苋氯仿提取物进行毒力测定,结果表明随着触杀时间的延长,LC50逐渐降低,在处理48 h时LC50最小,为2.81 mg/mL。由此可知:铁苋氯仿提取物有较高的杀螨活性。研究为开发高效的植物源杀螨剂提供理论依据。     

百部根中提取物对朱砂叶螨触杀活性的测定

摘 要：[研究目的]研究中药材百部根石油醚提取物中最佳流分9对朱砂叶螨生物活性的作用机理。[方法]运用玻片浸渍法测定了流分9对朱砂叶螨成螨的室内毒力,并运用生化方法对乙酰胆碱酯酶、单胺氧化酶、Ca2+-ATP酶、超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响进行了测定。[结果]表明百部流分9 对朱砂叶螨成螨有很强的生物活性,对成螨的LC50是0.6339 mg/mL。百部流分9 处理朱砂叶螨后,螨体内超氧化物歧化酶(SOD)被激活,而单胺氧化酶、Ca2+-ATP酶、乙酰胆碱酯酶均受到明显的抑制,这一系列变化可能会引起螨类神经系统传递的阻断,因此导致害螨的死亡。[结论]由此可见百部可以有效杀死朱砂叶螨,作为新型植物源农药具有很大的开发潜力。     

红鳍东方鲀白介素15的原核表达及其活性测定

为了开发红鳍东方鲀Takifugu rubripes免疫基因及其重组表达,生产重组免疫因子蛋白,通过提取红鳍东方鲀肾脏组织总RNA,利用RT-PCR技术扩增得到白介素15(interleukin15,IL15)基因序列,将IL15成熟肽序列与原核表达载体p ET-32a(+)连接,成功构建重组表达载体(重组子)p ET-32a(+)-IL15,并将其重组子转化至Escheria coli BL21(DE3)感受态细胞中获得重组表达IL15的基因工程菌,再经IPTG诱导,p ET-32a(+)-IL15在BL21中得到了融合表达。结果表明:通过对表达产物的纯化和Western Blotting检测,红鳍东方鲀IL15在大肠杆菌中的表达量较高,蛋白浓度为294.6μg/m L;用MTT法对该蛋白进行活性鉴定显示,加入稀释10倍和100倍的重组红鳍东方鲀IL15蛋白时,CTLL-2细胞的增殖率相对较高,分别为71%和73%。研究表明,重组红鳍东方鲀IL15蛋白具有体外促进CTLL-2细胞增值的能力。     

松材线虫效应蛋白Bx-FAR-1的原核表达与活性测定

[目的]纯化获得松材线虫效应蛋白Bx-FAR-1并验证其体外活性,为后续研究效应蛋白Bx-FAR-1参与松材线虫侵染松树的分子机制打下基础.[方法]利用PCR技术从松材线虫cDNA中扩增出效应基因Bx-FAR-1,用同源重组的方式将目的片段连接至原核表达载体pET-32a(+).通过原核表达系统诱导并纯化获得大量效应蛋白Bx-FAR-1,利用SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blotting对纯化获得的蛋白进行鉴定,同时通过本氏烟瞬时表达系统验证蛋白活性.[结果]从松材线虫cDNA中成功扩增出Bx-FAR-1基因(BXY_1685000.1);通过同源重组成功获得重组表达载体pET32a-BxFAR,并转化至大肠杆菌BL21感受态细胞.当诱导条件为15℃下150 r/min诱导16 h时重组蛋白以可溶性形式表达,且蛋白表达量高.效应蛋白Bx-FAR-1活性测定结果显示,当蛋白浓度达100 nmol/L时,可抑制致病疫霉的病原相关分子模式(PAMP)INF1引起的烟草细胞坏死.[结论]松材线虫效应蛋白Bx-FAR-1可抑制寄主植物的免疫反应.     

星豹蛛乙酰胆碱酯酶（AChE）活性测定及药剂对其活性的抑制作用

[目的]系统研究星豹蛛（Pardosa astrigera）乙酰胆碱酯酶（AChE）的性质,确定其抗药性的发生和发展及其抗性水平,建立快速、准确的AChE活性检测方法。[方法]采用正交试验设计确定星豹蛛不同部位AChE活性测定的最优条件组合,并在此基础上进一步研究豹蛛AChE的体躯分布及其对4种常用药剂的敏感度。[结果]星豹蛛头胸部、腹部和附肢AChE活性测定的最优条件组合是：酶浓度分别为12、18、29 g/L;底物浓度分别为0.6、1.0、1.0 mmol/L;反应体系pH值均为7.0;反应温度分别为30、35、35℃;反应时间均为5min。AChE主要分布在星豹蛛的头胸部,提取液中含有Triton X-100时,AChE的比活力要比无Triton X-100时大。灭多威、辛硫磷、高效氯氰菊酯、毒死蜱对星豹蛛头胸部中AChE的抑制中浓度（IC50）分别为7.76×10-5、1.76×10-4、4.12×10-4、4.94×10-4mol/L。[结论]星豹蛛体内AChE是膜结合的;4种药剂对星豹蛛头胸部中AChE的抑制具有很好的剂量效应,表明星豹蛛头胸部AChE可以作为环境中有机磷、氨基甲酸酯和拟除虫菊酯类农药污染的生物化学标记。     

β-谷甾醇对朱砂叶螨的触杀活性及杀螨机理初探

本研究旨在探究β-谷甾醇对朱砂叶螨的触杀活性及其对叶螨体态、内部结构的破坏。通过玻片浸渍法和叶片药膜法确定β-谷甾醇对朱砂叶螨杀螨的毒力,通过扫描电镜和透射电镜观察β-谷甾醇对螨亚显微结构的破坏,通过酶活检测方法,检测β-谷甾醇对乙酰胆碱酯酶和羧酸酯酶酶活的作用,通过荧光定量PCR方法测定β-谷甾醇对乙酰胆碱酯酶基因和羧酸酯酶基因相对表达量的影响。测定β-谷甾醇对朱砂叶螨雌成螨的LC30为1.0mg/mL。由扫描电镜和透射电镜观察可见,β-谷甾醇处理后朱砂叶螨表皮、肌纤维、线粒体、内质网、高尔基体等均受到不同程度的破坏。β-谷甾醇对朱砂叶螨乙酰胆碱酯酶基因表达量和酶活都没有影响。β-谷甾醇对解毒酶羧酸酯酶酶活没有直接影响,但诱导羧酸酯酶基因的表达。研究结果表明了β-谷甾醇可以有效杀死朱砂叶螨,并且对螨体造成不同程度的破坏,作为新型植物源农药具有一定的开发价值。证实乙酰胆碱酯酶不是β-谷甾醇的作用靶标,但β-谷甾醇处理会诱导螨体内解毒酶的表达。     

山楂叶螨和李始叶螨药剂敏感性测定的试验

对山楂叶螨（ＴｅｔｒａｎｇｃｈｕｓＶｉｅｎｎｅｎｓｉｓＺａｃｈｅｒ）和李始叶螨（ＥｏｔｅｔｒａｎｇｃｈｕｓＰｒｕｎｉＣｏｕｄｅ ｍａｎｓ）的药剂敏感性测定表明：药剂之间的死亡率有显著性差异；虫种之间的死亡率无显著性差异；不同药剂的作用不因虫种的不同而改变；经多重比较，只有氧化乐果、ＤＤＶ、石硫合剂有显著性差异，而其它药剂之间均无显著性差异；同时还测出：不同药剂对同一种螨的杀伤率不因采集地方不同而不同，更说明李始叶螨的抗药性强。     

新疆植物活性物质对朱砂叶螨的活性及天敌安全性测试

采用冷浸法提取新疆23种植物活性成分,分别测定其对朱砂叶螨24 h的毒杀活性,0903T2等14种植物的甲醇提取物对朱砂叶螨的杀活性都比较高,24 h校正死亡率均在90%以上。进一步测定了5种植物甲醇提取物对朱砂叶螨的触杀毒力,以1221J提取物的毒力最高,LC50仅为0.041 g/L,其次是0910T4和1126D2提取物的毒力较高,LC50分别达0.554 g/L和0.641 g/L,杀螨活性较稳定。0910T4提取物对天敌安全性测定表明,在40.00 g/L高浓度下对两种棉田优势天敌七星瓢虫和多异瓢虫的校正死亡率为12.47%和23.08%,显示出较高安全性。     

交替氧化酶的原核表达、纯化及活性研究

利用原核表达系统BL21和FN102表达交替氧化酶,用镍-NTA(Ni-NTA)琼脂糖凝胶层析柱纯化交替氧化酶可溶蛋白,利用SDS-PAGE检测纯化蛋白电泳纯度,用分光光度法测蛋白活性.结果表明:FN102表达的交替氧化酶量高于BL21;在BL21表达系统中的蛋白电泳纯度＜10％,而在FN102中表达的纯化蛋白电泳纯度达到90％～95％;BL21中表达交替氧化酶纯化蛋白活性为165.1 nmol/(min· mg),FN102中表达的交替氧化酶纯化蛋白活性为64.0 nmol/(min·mg).     

朱砂叶螨黄素单加氧酶TcFMO5基因克隆及表达

【目的】为了找到有效防治朱砂叶螨的生物学方法。【方法】克隆朱砂叶螨黄素单加氧酶TcFMO5基因，对其序列进行特征分析；通过实时荧光定量PCR技术分析TcFMO5在不同发育时期的表达规律。【结果】成功克隆TcFMO5基因(GenBank登陆号：OP901690),全长1 397 bp,阅读开放框1 302 bp,编码433个氨基酸；TcFMO5在朱砂叶螨的卵、幼螨、若螨、成螨四个时期均有表达。其中卵时期表达量最高，成螨时期其次，幼螨和若螨时期表达量较低。【结论】克隆得到TcFMO5基因，明确其不同时期的表达特征，为今后研究黄素单加氧酶的生理功能及以其为靶标的新型杀螨剂研制奠定基础。     

天然辣椒碱类物质对朱砂叶螨杀螨活性的影响

[目的]明确天然辣椒碱类物质对敏感朱砂叶螨各发育阶段的杀螨活性、对谷胱甘肽S-转移酶活性(GSTs)及基因表达量的影响.[方法]采用叶碟喷雾法处理样品,用酶标仪及荧光定量PCR仪测定酶活性及基因表达量.[结果]辣椒碱类物质对朱砂叶螨的杀螨活性随药剂浓度升高而增强,杀螨效率从高至低为幼螨＞若螨＞成螨＞卵,故选用低浓度的辣...