基于RNA-Seq测序的高、低产双黄蛋高邮鸭卵巢组织SNP筛选分析

试验旨在进一步完善高邮鸭基因组结构信息,探索高邮鸭双黄蛋产蛋性能的调控机制。通过高通量测序技术对高邮鸭双黄蛋高、低产组卵巢组织转录组进行RNA-Seq测序,对测序数据进行质控和注释,筛选与高邮鸭双黄蛋产蛋性能相关的SNP位点。测序获得的初始数据（raw reads）进行系列质控筛选,6个高邮鸭卵巢组织分别获得84 540 140~87 479 660个有效数据（clean data）,70.79%以上的测序数据被已注释的鸭基因组数据覆盖;在所覆盖的基因组数据中,检测到位于基因外显子区域的108 260~116 478个SNP位点（转换和颠换类型）,转换类型总数极显著高于颠换类型总数（P<0.01）。利用KEGG数据库对筛选出的SNP位点所在基因进行信号通路分析,筛选出前20条信号通路,其中包括核糖体信号通路、碳代谢信号通路和氨基酸生物合成信号通路等。试验对双黄蛋高、低产组高邮鸭的卵巢进行了RNA-Seq测序分析,为发掘高邮鸭双黄蛋产蛋性能相关SNP位点提供了基础,为进一步研究高邮鸭双黄蛋产蛋性能的调控机制提供了新的数据支撑。     

高、低产双黄蛋高邮鸭卵巢组织差异分析

本试验以高邮鸭为研究对象,选择双黄蛋高、低产组高邮鸭各6只,颈动脉放血致死后立即采集下丘脑、垂体、肝脏、输卵管及卵巢组织,将采集的卵巢组织通过组织切片、HE染色观察卵巢形态结构,并对双黄蛋高、低产组高邮鸭卵巢中等级卵泡进行统计对比;进行特异性标记蛋白卵泡刺激素受体(FSHR)免疫组化染色,观察两组高邮鸭卵巢阳性细胞表达情况及卵巢颗粒细胞分布;同时提取下丘脑、垂体、肝脏、输卵管及卵巢组织RNA,采用实时荧光定量PCR技术检测FSHR基因的表达。结果显示,双黄蛋高产和低产组高邮鸭卵巢在组织结构及卵泡发育上存在明显差异,高产组卵巢上的卵泡繁密且发育良好,密布着众多小黄卵泡、大白卵泡及小白卵泡,各级卵泡大小差异明显;而低产组卵巢上的卵泡稀疏且发育较为迟缓,小黄卵泡、大白卵泡及小白卵泡数量较少。实时荧光定量PCR检测结果表明,高产组高邮鸭下丘脑、垂体、肝脏及输卵管中的FSHR基因表达量极显著高于低产组(P0.01),而卵巢中FSHR基因表达量在两组中差异不显著(P0.05)。本试验结果表明,双黄蛋高、低产组高邮鸭的卵巢结构及卵泡发育存在显著差异,卵巢上的微环境可能是影响高邮鸭双黄蛋产蛋性能的影响因素。     

高、低产双黄蛋高邮鸭卵巢组织差异分析

本试验以高邮鸭为研究对象,选择双黄蛋高、低产组高邮鸭各6只,颈动脉放血致死后立即采集下丘脑、垂体、肝脏、输卵管及卵巢组织,将采集的卵巢组织通过组织切片、HE染色观察卵巢形态结构,并对双黄蛋高、低产组高邮鸭卵巢中等级卵泡进行统计对比;进行特异性标记蛋白卵泡刺激素受体（FSHR）免疫组化染色,观察两组高邮鸭卵巢阳性细胞表达情况及卵巢颗粒细胞分布;同时提取下丘脑、垂体、肝脏、输卵管及卵巢组织RNA,采用实时荧光定量PCR技术检测FSHR基因的表达。结果显示,双黄蛋高产和低产组高邮鸭卵巢在组织结构及卵泡发育上存在明显差异,高产组卵巢上的卵泡繁密且发育良好,密布着众多小黄卵泡、大白卵泡及小白卵泡,各级卵泡大小差异明显;而低产组卵巢上的卵泡稀疏且发育较为迟缓,小黄卵泡、大白卵泡及小白卵泡数量较少。实时荧光定量PCR检测结果表明,高产组高邮鸭下丘脑、垂体、肝脏及输卵管中的FSHR基因表达量极显著高于低产组（P<0.01）,而卵巢中FSHR基因表达量在两组中差异不显著（P>0.05）。本试验结果表明,双黄蛋高、低产组高邮鸭的卵巢结构及卵泡发育存在显著差异,卵巢上的微环境可能是影响高邮鸭双黄蛋产蛋性能的影响因素。     

基于RNA-Seq筛选鸭肠炎病毒感染鸭脾差异表达免疫相关基因

为挖掘鸭肠炎病毒(duck enteritis virus,DEV)感染鸭的差异表达免疫相关基因,本研究以DEV GZ株经腿部肌肉接种50d鸭后,于接种后66、90和114h采集鸭脾组织样本,提取总RNA,通过高通量RNA-seq技术测序,应用GO和KEGG数据库进行比对注释,并采用荧光定量PCR对部分差异表达基因进行验证,结果显示:DEV接种66h时鸭脾的差异表达基因有511个,参与免疫相关生物学过程的为70个,其中上调基因46个,下调基因24个;90h时差异表达基因有485个,参与免疫相关生物学过程的为64个,其中上调基因49个,下调基因15个;114h时差异表达基因有531个,参与免疫相关生物学过程的为66个,其中上调基因35个,下调基因31个。GO数据库分析显示,差异表达免疫相关基因主要涉及细胞黏附、抗原加工和呈递、补体激活等免疫反应过程;KEGG数据库分析显示,差异表达免疫相关基因主要富集在细胞黏附分子、ECM受体互作、PPAR等信号通路;荧光定量PCR对7个差异表达基因进行检测显示,差异表达基因相对表达量与RNA-Seq技术测序结果基本一致。这些结果为进一步阐明DEV感染机制和机体免疫应答机制奠定了基础。     

基于重测序技术筛选工作犬OR基因SNP位点

正鉴于犬的嗅觉能力突出,各国警方广泛应用训练有素的工作犬搜查爆炸物、毒品等违禁品打击和预防犯罪。工作犬的嗅探能力从根本上讲是受犬嗅觉受体(Olfactory receptor,OR)基因调控的,因此如果能够运用分子生物学技术开展工作犬嗅探能力与OR基因之间的关联性研究工作,发现主要的分子标记来挑选     

基于RNA-Seq筛选新型鸭细小病毒感染鸭胚成纤维细胞的差异表达基因

为筛选鸭细小病毒(DPV)感染鸭胚成纤维(DEF)细胞后的差异表达基因,本研究利用DPV接种DEF细胞作为试验组,对照组加入相同体积的2%DMEM,培养至72 h后提取2组样品的总RNA,利用RNA-Seq技术筛选出DEF细胞感染DPV后的差异表达基因,并对其进行生物信息学GO功能分类和KEGG分析。结果显示,差异表达水平变化倍数(fold change,FC)在2倍以上的基因共有4 073个,其中上调表达基因1 904个,下调表达2 169个。GO功能分析显示,这些基因主要涉及到炎症反应、免疫反应、蛋白结合、转运活动等功能。KEGG信号通路分析表明,这些差异表达基因参与细胞因子受体相互作用、新陈代谢、TNF、NF-κB、Jak-STAT、Toll样受体等信号通路。应用荧光定量PCR(Real-time FQ-PCR)验证部分差异表达基因的检测结果显示,差异基因的相对表达量与RNA-Seq技术测序结果基本一致,表明了RNA-Seq检测结果的可靠性。本研究为进一步研究DPV的致病作用及宿主抗病机制奠定了基础。     

高邮鸭GNRHR基因克隆及卵巢中mRNA表达分析

为了探究GNRHR基因在双黄蛋形成过程中的作用,本研究以高邮鸭为试验素材,应用克隆测序技术获得了高邮鸭促性腺激素释放激素(GNRHR)基因的全序列,并分析该基因的结构;采用荧光定量技术检测258日龄和330日龄高、低产双黄蛋鸭卵巢组织GNRHR基因mRNA的表达量,并分析了两者之间的差异。结果表明,鸭GNRHR基因序列全长为1 944 bp,共有3个外显子和2个内含子;258日龄和330日龄,高产双黄蛋鸭卵巢GNRHR基因mRNA的表达量高于低产双黄蛋鸭的表达量(P0.05)。     

基于重测序技术的塔河马鹿特异性SNP位点筛选

【目的】 筛选出塔河马鹿高质量的单核苷酸多态性位点(SNP),构建特异性分子遗传标记,为塔河马鹿的纯种鉴别提供参考。【方法】 对国家特种经济动物资源共享平台1999年收集整理的32份塔河马鹿血液DNA样本进行全基因组重测序,与梅花鹿染色体级别的参考基因组进行比对,统计比对率、覆盖度和测序深度。用SNPEff统计每条染色体上SNP位点的分布,用SNPhylo基于位点构建分子进化树,用VCFTOOLS计算遗传分化指数(Fst),按降序排序并设定阈值Fst≥0.25,淘汰不符合条件位点,用R语言进行主成分分析(PCA),统计33条染色体排名前1 500的SNPs位点,提取前100个SNPs集合的特征值,分别进行主成分分析。【结果】 全基因组重测序结果表明,32份质检合格的塔河马鹿血液基因组DNA有效数据量为868 791 354 600 bp,测序质量均符合后续数据分析要求。32份样品测序数据的平均比对率为98.06%,平均覆盖度为97.66%,平均深度为6.787。过滤后得到20 139 122个高质量的SNPs位点,其中4号染色体上SNPs分布最多,90%以上的变异位于基因间和外显子区域。建树后候选特异性SNPs位点数为12 050 781个。使用VCFTOOLS筛选得到544 717个SNPs位点。选取每条染色体排名前1 500的SNPs位点进行主成分分析,主成分分析结果显示,当SNPs从49 500降至100时区分效力没有下降,最终筛选出100个特异性强、稳定性高的塔河马鹿SNPs位点。【结论】 通过全基因组重测序技术和生物信息学分析得到了100个塔河马鹿特异性SNPs位点,为塔河马鹿的纯种鉴别以及核心种质的筛选工作提供了理论依据。     

高邮鸭与金定鸭GnRHR2基因组织表达差异分析

克隆鸭GnRHR基因序列,并研究其对产蛋性能的调节作用.采用RT-PCR技术从鸭生殖轴组织总RNA中克隆GnRHR基因cDNA序列,并利用Real-time PCR技术分析GnRHR基因在不同产蛋期高邮鸭和金定鸭生殖轴组织中的表达.序列分析结果表明克隆序列长度约500 bp,属Ⅱ型GnRHR基因序列,与家鸡cGnRHR...     

简化基因组测序评价高邮鸭保种效果的研究

研究旨在评价高邮鸭原种场的保种效果,为高邮鸭保种提供理论依据。利用简化基因组测序方法ddRAD鉴定高邮鸭原始群体(GS)和原种场群体(GC)的SNP标记,比较分析两个群体的遗传多样性差异,并使用遗传分化指数(F_(ST))和核苷酸多样性比值(π ratio)比率联合筛选选择信号区域及其相关基因,对得到的受选基因进行GO和KEGG功能富集分析。结果显示:与原始群体相比,原种场群体遗传杂合度保持不变,近交系数有所下降;原种场群体与环境应激和甲基化调控相关的基因受到了一定程度的选择。结果表明高邮鸭原种场群体保种效果较好,可以继续沿用现有的小群保种方法。     

高邮鸭的健康、生态养殖

随着人民生活水平的提高,人们对家禽的要求越来越高。通过生态、有机方式生产出来的畜禽产品供不应求。我们应根据市场需求,开发、研究高邮鸭的生态、健康养殖技术,推广高邮鸭生态、健康养殖的模式,进一步做好大面积的推广。如何做到健康养殖?那就要采取全面综     

高邮鸭PRL基因内含子1的SNP检测及其与产蛋性状的相关分析

利用PCR—RFLP技术对高邮鸭催乳素（Prolactin，PRL）基因内含子1进行了SNP检测和测序分析，并对该基因与高邮鸭产蛋性状的相关性进行了研究。结果表明：PRL基因内含子1存在两个Dra Ⅰ酶切位点，其中1个位点具有DraⅠ多态性。该位点由于在1326位点发生了T→C的碱基突变，产生了AA、AB和BB3种基因型。基因型BB和等位基因B的频率最高；BB基因型个体30周龄蛋重极显著高于AB基因型个体（P〈0．01）；AB基因型个体的双黄率显著高于BB基因型个体（P〈0．05）；3种基因型间产蛋数、最长连产天数和开产体重无显著差异。     

鸭不同品种特异性分子标记SNP的筛选与鉴定

为开发和鉴定鸭品种特异性分子标记,试验选取樱桃谷鸭、北京鸭、枫叶鸭、金定鸭、绍兴鸭、山麻鸭、高邮鸭7个群体共56只鸭通过Illumina Hi Seq 2500平台进行了重测序,筛选出686个存在于特定群体中的单核苷酸多态性突变(SNP)和插入缺失标记(INDEL),并随机选取了7个SNP位点进行PCR验证,结果完全符合预期,说明通过二代测序筛选出的特异性SNP可以作为鸭品种鉴定的分子标记。     

高邮鸭MSTN 5′端非编码区SNP突变与生长性状的关联分析

研究利用连接酶检测反应,在高邮鸭群体中筛选出了对肌肉行负调控作用的MSTN基因5′端非编码区的一个SNP位点,该位点为C627452T(BGI_duck_1.0)的突变。此突变位点处于中度多态,具有较高的遗传多样性。其中CC基因型群体在49日龄的体重、胸大肌重、胸大肌横截面积以及胸大肌纤维直径均显著高于TT基因型群体(P0.05),CT基因型上述表型值均介于CC基因型和TT基因型之间,且显著高于TT基因型(P0.05)。结果表明,在肉用性能上C等位基因明显优于T等位基因,可以通过精准剔除T等位基因达到加速育种进程的目的。     

基于RNA-Seq技术的京海黄鸡卵巢组织转录本预测及新基因挖掘

鸡及许多物种的全基因组测序及相关基因图谱都已宣告完成,但由于注释方法的局限性,还存在许多遗漏的新基因及对现有基因的误差注释。RNA-Seq技术是基于第2代测序技术的转录组学研究方法,该研究利用高通量测序技术对8只（高产组4只、低产组4只）300日龄体重一致、饲养条件相同、产蛋数存在差异的京海黄鸡的卵巢组织所有RNA反转录而成的cDNA文库进行测序,通过分析RNA-Seq获得的京海黄鸡卵巢组织转录组数据,共发现4 431个新转录本,并将所有新转录本与GO、NR、Swiss-Prot、KEGG数据库进行比对和分析,发现了很多潜在的新基因并进行功能注释,为鸡基因组的进一步完善及功能基因的挖掘提供了数据基础。     

高邮鸭血浆生化指标与体重、体尺的相关性分析

为了探讨高邮鸭血浆极低密度脂蛋白(VLDL)、总三酰甘油(TG)与体重、体尺性状之间的关系,试验测定了8周龄高邮鸭公母鸭血浆极低密度脂蛋白、TG浓度及体重、体尺性状。结果表明:8周龄高邮鸭公母鸭之间血浆VLDL浓度和TG浓度均差异不显著(P0.05);公鸭胫长、体斜长、半潜水长、胸宽极显著高于母鸭(P0.01),公鸭胫围、龙骨长显著高于母鸭(P0.05),公母鸭体重差异不显著(P0.05);血浆VLDL浓度与体重、胫围、龙骨长及半潜水长呈一定程度的正相关趋势(P0.05);血浆TG浓度与体重、胫围、龙骨长呈一定程度的正相关趋势(P0.05),与胫长、体斜长呈一定程度的负相关趋势(P0.05)。     

节律基因Clock和Per2在高邮鸭不同组织中的表达分析

Clock和Per2为两个重要的节律基因,在调节昼夜节律中具有重要作用。为弄清节律基因Clock和Per2在鸭组织中的表达情况,本文采用荧光定量PCR的方法检测了Clock和Per2两基因在鸭下丘脑、垂体、卵巢、肾上腺、肝脏、胸肌、腿肌,以及不同大小的卵泡颗粒细胞中的表达情况。结果表明,Clock和Per2两基因在所检测的几种组织和卵泡颗粒细胞中均有表达,而且两基因在组织中表达量高低水平变化趋势一致。提示,Clock和Per2两基因可能共同调节鸭昼夜节律。本研究为鸭Clock和Per2基因研究奠定理论基础。     

基于RNA-Seq分析食欲素A对绵羊卵巢黄体化颗粒细胞基因表达的影响

食欲素A(orexin A)作为一种重要的神经肽类激素,通过与G蛋白耦联受体结合影响生殖功能。为了研究orexin A对绵羊黄体化颗粒细胞基因表达的影响及其信号网络,培养绵羊卵巢黄体化颗粒细胞进行鉴定,提取黄体化颗粒细胞组和添加Orexin A的黄体化颗粒细胞组的RNA,采用lllumina测序技术进行测序,利用生物信息学方法对转录组数据进行分析,在测序数据质量控制的基础上,对差异表达的基因进行筛选、功能注释和富集分析。结果表明,黄体化颗粒细胞组的孕酮分泌量显著高于未黄体化颗粒细胞组;转录组测序共获得了50个差异基因,其中上调表达20个,下调30个;发现多个与细胞周期调控、繁殖及代谢相关的高表达基因,如PRRT2、ID1、RRM2、ATP6、ATP8、KIRREL、SOX4、TBX3等基因,结合GO分析和KEGG通路分析表明,差异基因主要参与代谢途径、氧化磷酸化、癌症信号通路、GnRH信号通路、cGMP-PKG信号通路、Rap1信号通路、Wnt信号通路以及Ca离子信号通路等。本试验为进一步阐明orexin A影响绵羊的生殖调控提供了依据。     

基于RNA-Seq技术筛选影响猪肌纤维性状的候选基因

旨在探究影响肌纤维性状的候选基因和信号通路。本研究以马身猪和大白猪为研究对象,采用HE染色法分析6月龄马身猪和大白猪背最长肌肌纤维直径和密度,利用RNA-Seq分析马身猪和大白猪背最长肌组织中基因表达情况,并对差异表达基因进行GO和KEGG富集分析,再通过qRT-PCR验证RNA-Seq结果的准确性。结果显示,马身猪背最长肌肌纤维直径极显著低于大白猪(P<0.01),而肌纤维密度极显著高于大白猪(P<0.01)。转录组测序结果显示,在6月龄马身猪和大白猪背最长肌中,差异倍数在2倍以上的基因共105个,其中,马身猪相对于大白猪上调的基因有55个,下调的基因有50个。GO富集分析表明,差异表达基因主要富集在与线粒体相关的细胞组分和骨骼肌分化有关的生物学过程中;KEGG分析结果显示,这些差异表达基因主要参与到与氧化磷酸化有关的信号途径。qRT-PCR和RNA-Seq对6个DEGs表达情况的检测结果表明它们的表达趋势相同,说明RNA-Seq结果准确可靠。结合差异基因表达丰度、GO和KEGG富集分析结果,本研究发现,MYL3、MYH3、MYH6基因通过影响肌纤维的组成而影响肌纤维特性,ND6基因通过参与线粒体氧化磷酸化过程影响肌纤维类型,MICU2基因通过维持线粒体Ca²⁺浓度的稳态影响细胞功能,编码转录因子的EGR1和FOS基因通过调节细胞增殖、分化和凋亡等过程影响肌肉生长发育。本研究初步揭示了造成马身猪和大白猪肌纤维性状差异的主要原因,为猪肉品质的改善提供了相应的理论依据。