Q型烟粉虱化学感受蛋白基因BtabCSP1的克隆与分析

【目的】克隆Q型烟粉虱（Bemisia tabaci）化学感受蛋白基因,分析其序列特征和表达特性,为深入研究该类基因功能奠定基础。【方法】根据桃蚜化学感受蛋白OS-D2a（ABM5558）的氨基酸序列,借助生物信息学搜索烟粉虱EST序列拼接了1个烟粉虱化学感受蛋白基因（BtabCSP1）,以烟粉虱mRNA为模板,采用RT-PCR扩增克隆烟粉虱化学感受蛋白cDNA。采用半定量RT-PCR对不同发育阶段的烟粉虱样品中BtabCSP1的表达模式进行研究。【结果】BtabCSP1完整阅读框全长为2 626 bp,包含2个外显子和1个内含子,编码131个氨基酸残基,其中含有1个CX6CX18CX2结构域,为化学感受蛋白的典型特征。BtabCSP1在供试样品中均有表达,并且在2龄、3龄和伪蛹阶段表达量更高。聚类分析结果表明,烟粉虱与果蝇、桃蚜等物种遗传关系较远,化学感受蛋白基因在物种进化过程中较为活跃。【结论】从Q型烟粉虱若虫中克隆了1个化学感受蛋白基因 BtabCSP1,该基因在烟粉虱不同发育阶段中均能表达,推测其对烟粉虱的生长发育具有重要的调控作用。     

棉铃虫中肠氨基氨肽酶N基因的克隆及序列分析

 通过简并引物PCR结合RACE技术 ,从棉铃虫中肠中克隆了 1个氨基氨肽酶N基因 ,该基因全长 30 4 3bp ,阅读框包括 2 85 6bp ,编码 95 1个氨基酸。预测蛋白分子量为 10 8.3kD ,等电点为 5 .2 9。序列中具有谷氨酸锌化氨肽酶的保守结构GAMEN以及锌结合位点HEXXHX18E。N 末端 2 0个氨基酸具有信号肽的特征 ,C 末端 2 5个氨基酸具有明显的亲脂性 ,并且具有跨膜特征。该基因已经在GenBank中登记 ,序列号为 :AY1810 2 6。     

棉铃虫α-微管蛋白基因的克隆、序列分析及表达模式检测

【目的】克隆及序列分析棉铃虫（Helicoverpa armigera）α-微管蛋白基因的cDNA序列,并检测棉铃虫α、β两种微管蛋白基因的表达情况。【方法】以棉铃虫3龄幼虫为试验材料,采用RT-PCR及RACE技术克隆棉铃虫α-微管蛋白基因（HeTubA）,采用荧光定量PCR（QRT-PCR）技术分析棉铃虫α、β-微管蛋白基因在不同生长发育阶段及成虫器官中的表达模式。【结果】克隆得到棉铃虫α-微管蛋白基因（GenBank登录号为JQ069957）。序列分析表明,HeTubA开放阅读框1 353 bp,编码450个氨基酸组成的多肽,氨基酸序列包含多个α-微管蛋白保守区。与其它一些昆虫的一致性分析表明,HeTubA与八字地老虎（Xestia c-nigrum）、柑橘凤蝶（Papilio xuthus）及家蚕（Bombyx mori）的α-微管蛋白氨基酸序列同源性最高,α-微管蛋白基因在长期进化中非常保守。荧光定量PCR表明,棉铃虫α、β-微管蛋白基因不具有生长发育阶段及成虫器官特异性,且二者均在复眼表达高,腹部表达低;HeTubA在末龄幼虫期和蛹期高水平表达,HeTubB在末龄幼虫期和成虫期高水平表达。【结论】成功克隆了棉铃虫α-微管蛋白基因,对2种微管蛋白基因的表达模式进行了检测,进一步进行了蛋白质3D结构的构建,可用于深入研究2种微管蛋白基因的功能及开发新型杀虫剂。     

棉铃虫Gq蛋白α亚基基因的克隆及组织特异性表达

 【目的】了解棉铃虫体内Gqα的组织特异性表达情况。【方法】利用RACE技术获得了Gqα全长基因，利用半定量RT-PCR研究了该基因的时空表达情况。【结果】从棉铃虫Helicoverpa armigera触角中克隆了一条全长1 101bp的Gqα cDNA序列，命名为GqαHarm；阅读框全长1 062 bp，编码353个氨基酸残基。GqαHarm与已报道的昆虫Gq蛋白α亚基同源性在90％以上，与近缘种甘蓝夜蛾Mamestra brassicae Gqα的同源性高达96.88％，与家蚕Bombyx mori Gqα的同源性高达97.73％。半定量RT-PCR研究表明，GqαHarm在棉铃虫雌雄成虫触角中表达，在头、胸、腹、足和翅中也有表达，并且表达量差异不显著；此外，在喙、下颚须和下唇须中也有表达；在卵、幼虫、蛹和成虫体内也都有表达；在卵中的表达量最高，而在成虫中的表达量最低，在幼虫和蛹的前、中、后期的表达量差异不大。【结论】研究表明GqαHarm是一种在棉铃虫体内普遍存在的蛋白。     

昆虫化学感受蛋白基因的进化分析

从基因库中调取已完成测序的昆虫化学感受蛋白(chemosensory proteins,CSPs)基因序列和氨基酸序列,共涉及昆虫7个目23个种的59个基因.应用MEGA 5.0形成了这59个基因的系统发育关系树,并计算CSPs基因在昆虫中的核苷酸替换速率.对非同义替换速率和同义替换速率进行比较的结果显示,CSPs基因...     

中华蜜蜂化学感受蛋白基因家族克隆及表达特征分析

【目的】完成中华蜜蜂（Apis cerana cerana）化学感受蛋白（chemosensory proteins,CSPs）基因家族的序列及表达谱鉴定,解析中蜂整个CSPs家族的表达特征与分布规律,为中蜂CSPs的生物学功能研究提供参考。【方法】利用RT-PCR技术扩增,克隆获得中蜂CSPs基因家族全部6条基因序列的开放阅读框（ORF）全长,并利用real-time PCR技术对中蜂所有的CSPs序列在中蜂工蜂不同发育历期及不同器官表达特征进行研究。【结果】新克隆4条基因（Ac-CSP2、Ac-CSP4、Ac-CSP5和Ac-CSP6）的开放阅读框分别为354、387、315和378 bp,分别编码117、128、104和125个氨基酸残基,预测蛋白质分子量分别为13.01、14.61、12.46和14.63 kD,等电点分别为8.86、4.53、9.60和8.71,且均具有4个保守的半胱氨酸残基,均符合昆虫CSPs的一般生化特征。中蜂与意蜂CSPs同源基因家族间具有高达95%—99%的相似性。CSPs在中蜂不同发育时期及器官的表达特征结果显示,Ac-CSP1、2、3、4在卵、幼虫和蛹期几乎不表达,其中Ac-CSP1、2、4在触角中表达量最高,而Ac-CSP3在翅中表达量最高;Ac-CSP5在中蜂各个发育历期的表达量几乎相同;Ac-CSP6蛹期有较高表达,其余时期不表达。【结论】中蜂CSPs基因家族所有6个基因的氨基酸序列与意大利蜜蜂有较高的相似性,但二者各基因的表达谱在整体相似的情况下局部又存在着某些差异,为进一步研究该家族蛋白的生理功能机制奠定了良好基础。     

菜粉蝶气味结合蛋白和化学感受蛋白生物信息学分析

气味结合蛋白(odorant-binding proteins,OBPs)和化学感受蛋白(chemosensory proteins,CSPs)在菜粉蝶(Pieris rapae)气味识别的过程中发挥着重要作用。通过本地BLAST等方法在菜粉蝶基因组中找到了推测的OBPs和CSPs蛋白序列,采用多序列比对、半胱氨酸模式序列识别、进化发育树构建等方法,鉴定出了24个PrOBPs和38个PrCSPs基因。其中,PrOBP1-PrOBP17这17个OBPs属于Classic OBPs蛋白家族,PrOBP19-PrOBP24属于Minus-C OBPs蛋白家族。鉴定出的38个PrCSPs都具有鳞翅目CSPs的半胱氨酸模式识别序列。本实验通过对菜粉蝶基因组中OBPs和CSPs基因的查找鉴定,丰富了昆虫OBPs和CSPs基因数据库,可为菜粉蝶气味识别和化学感受相关实验和应用提供参考。     

昆虫化学感受蛋白研究进展

为了研究昆虫嗅觉系统中化学感受蛋白(CSPs)在昆虫体内所发挥的作用,综述了国内外30年来对CSPs蛋白的研究。发现CSPs蛋白不仅存在于昆虫的嗅觉器官触角中,而且在非嗅觉器官中也被鉴定出来,如在小地老虎的性腺中。CSPs蛋白除了行使嗅觉功能外,还具有抗药性、视觉色素载体、营养吸收、再生和发育等功能。在一些昆虫中,同一种CSPs蛋白在性腺和触角中同时表达,因此具有接受信号和释放信号的双重功能。然而,研究还存在不足,今后还需要研究CSPs参与嗅觉识别的具体过程和发挥的作用,以及CSPs参与提高昆虫抗药性的功能。     

棉铃虫CYP4家族基因片段克隆及序列分析

以5龄实验室品系棉铃虫的总RNA为模板,采用一对昆虫细胞色素P450简并引物,利用反转录—多聚酶链式反应(RT-PCR)扩增并筛选出10个新的长度约450bp的cDNA片段,并对这些序列与GeneBank中已知序列进行相似性分析,初步推测这10个P450基因片段属于CYP4家族的CYP4M和CYP4S2个亚家族。     

小菜蛾化学感受蛋白突变体的构建

[目的]研究半胱氨酸(Cys58)对小菜蛾(Plutella xylostella)化学感受蛋白1(PlxyCSP1)与农药化合物结合特性的影响。[方法]利用重叠延伸PCR法,将PlxyCSP1中Cys58突变成色氨酸(Trp58),获得突变体PlxyCSP1-M2。构建表达载体,表达突变蛋白,并进行Western Blot检测。[结果]构建了突变基因的原核蛋白表达载体pET32a-PlxyCSP1-M2,并表达了大小为35 kDa的融合蛋白。[结论]利用重叠延伸PCR法成功在原核系统中表达了PlxyCSP1突变蛋白。     

Cloning and Sequencing of a Gene Encoding Aminopeptidase N in the Midgut of Helicoverpa armigera (Hübner)

A cDNA encoding aminopeptidase N was cloned by degenerated PCR combined with RACEtechnique in this paper. The full-length of APN-Harm is 3 043 bp. Open reading frame is 2 856 bp inlength, encoding 951 amino acid residues. Its predicted molecular weight and isoelectric point are 108.3kDa and 5.29, respectively. This deduced amino acid sequence shares some common structural features withaminopeptidase N from several moth species, including the consensus zinc-binding motif HEXXHX18 E and the GAMEN motif common to gluzincin aminopeptidases. The first 20 amino acid residues at N-termini ishydrophobic transmembrane helix. The sequence of APN-Harm was deposited in GenBank and the accessionnumber is AY181026.     

Purification of Aminopeptidase N Protein and Differences in cDNAs Encoding APN1 Between Susceptible and Resistant Helicoverpa armigera Strains to Bacillus thuringiensis Toxins

The brush border membrane vesicles (BBMVs) in midgut of Helicoverpa armigera were successfully separated, and most of the Aminopeptidase N (APN) activities in BBMV were preserved. The 3-[(3-chlor-amidopropyl) dimethylammonio]-l-propane-sulphonate (CHAPS)can enhance the dissolution of BBMV, and phosphatidylinositol-specific phosopholipase C (PI-PLC) can cleave the APN from midgut membrane. The APN was primarily purified using a Mono-Q column. The results of immunoblotting showed that the 120 and 170 kDa proteins in the BBMV could bind CrylAc, and 120kDa APN was a glycosylphosphalidylinositol(GPI)anchored protein. Two Bt-resistant strains (Bt-P, Bt-M) were obtained after being selected for more than five years in laboratory using Bt insecticides and Bt transgenic cotton incorporated into diet separately. The resistance of Bt-P and Bt-M were 1 083.3and 48.7 times that of susceptible strain. The genes encoding APN1 in midgut of susceptible and resistant H.armigera were cloned by PCR and RACE techniques. The inferred amino acid sequences of APN1 possessed the common character of APN family in insects. In comparison with APN1 in susceptible strain, three nucleotide mutations were observed in the APN1 of Bt-M strain and resulted in two amino acid replace in the putative protein sequences, and eight nucleotide mutations were observed in Bt-P strain and resulted in five amino acid replace.     

烟青虫气味结合蛋白基因的克隆与序列分析

 根据已经报道的棉铃虫普通气味结合蛋白I（GOBP1）和性信息素结合蛋白（PBP）基因的cDNA序列，设计了2对引物，以烟青虫Helicoverpa assulta触角cDNA为模板，分别进行PCR扩增，获得2条特异性条带，约400 bp。将以上两条片段分别连接到T-easy载体上，获得重组子T-GOBP1-Hass和T-PBP-Hass。序列测定和结构分析表明，Hass-GOBP1开放阅读框全长441bp，编码147个氨基酸残基，预测分子量和等电点分别为17.2 kD和4.71。Hass-PBP开放阅读框全长405 bp，编码135个氨基酸残基，预测分子量和等电点分别为15.1 kD和5.2。Hass-GOBP1和Hass-PBP具有昆虫气味结合蛋白的典型特征，即氨基酸序列中具有6个保守的半胱氨酸残基，呈酸性。这2个基因已在GenBank中登记，序列号分别是AY864774和AY864775。     

梭梭过氧还蛋白基因（PrxQ）克隆与序列分析

采用RT-PCR、RACE方法从超旱生、耐盐植物梭梭中扩增出PrxQ基因cDNA序列,该序列全长966bp,包含654bp的开放阅读框,推测氨基酸序列全长为218个氨基酸残基,该蛋白分子量为24 106.0,等电点为9.78,含有2个保守的Cys残基。序列同源性分析结果显示,核苷酸序列与藜科几种盐生植物如碱蓬等的同源性为70.01%,与其他植物佛甲草等的同源性为55.30%。说明,PrxQ基因在藜科盐生植物中是一种较高保守的基因。     

棉铃虫鞣化激素基因克隆及分子特性分析

【目的】获得棉铃虫鞣化激素2个亚基(α亚基和β亚基)基因序列,分析其分子特性和表达模式,研究棉铃虫鞣化激素的作用机制奠定基础。【方法】通过生物信息学和分子生物学技术分别得到棉铃虫鞣化激素α和β亚基cDNA序列,将棉铃虫及NCBI中公布的已知其它昆虫鞣化激素α和β亚基氨基酸序列分别整理分析,利用MEGA7(7.0.14)软件的Jones-Taylor-Thornton(JTT)模型构建系统进化树并进行聚类分析,qRT-PCR分别检测两亚基在棉铃虫不同生长发育阶段的表达模式。【结果】分别获得了棉铃虫鞣化激素 α亚基与β亚基核苷酸序列。其中α亚基(GenBank登录号:AHM0247472.1)cDNA片段长694 bp,开放阅读框480 bp,编码159个氨基酸残基,预测该蛋白质分子量为17.7 kDa。该基因在卵期第3 d、1龄幼虫第1 d、3~5龄幼虫第1 d、2和3龄末蜕皮期(3M和4M)、蛹期第0 d、第3 d和第7 d表达量相对较高。β亚基(GenBank登录号:AHM0247473.1)cDNA片段长779 bp,开放阅读框420 bp,编码139个氨基酸残基,预测该蛋白质分子量为15.9 kDa。该基因在卵期至2龄末蜕皮期(3M)、3龄幼虫第2 d、4~5龄幼虫第1 d、蛹期第1 d至羽化前表达量相对较高。鞣化激素α亚基和β亚基基因均在棉铃虫胸神经节中相对表达量最高,咽下神经节次之,脑部和腹部相对表达量较弱。【结论】鞣化激素在鳞翅目昆虫中具有较高的保守性;α亚基和β亚基基因主要在棉铃虫卵期、初孵幼虫期、蛹期和新羽化成虫期发挥作用;鞣化激素在棉铃虫幼虫体内主要由胸部神经节转录合成。