深黄被孢霉Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因克隆及pGAPZαA-D6D表达载体的构建

被孢霉属(Mortieralla isabellina)是目前用于微生物发酵生产γ-亚麻酸(GLA)的主要菌种。根据Δ6-脂肪酸脱氢酶基因保守区以及pGAPZαA载体的多克隆位点设计引物,上下游分别加入ECoRⅠ和XhoⅠ酶切位点,从深黄被孢霉中克隆Δ6-脂肪酸脱氢酶基因(D6D),并与pGAPZαA表达载体进行连接,经酶切与PCR鉴定重组质粒,证明成功构建了pGAPZαA-D6D表达载体。     

微小毛霉Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因的克隆与表达

微小毛霉(Mucor.pusillus)Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因的克隆与表达。以一株产γ-亚麻酸的微小毛霉为材料,通过PCR方法克隆得到的Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因,构建重组的酵母表达载体pYMpD6D,将重组载体通过醋酸锂方法导入酿酒酵母中,并利用酵母表达系统证实该基因能导致酵母合成γ-亚麻酸。通过GC分析,γ-亚麻酸占总脂肪酸量的6.53%,微小毛霉Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因在酵母中得到了正确的表达。此试验为进一步研究Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因家族和进一步利用该基因来改良作物奠定了一定的基础。     

甜味蛋白Brazzein基因合成及其在酵母中表达的初步研究

采用pGAPZαA为表达载体,SMD1168毕赤酵母为受体系统,构建分泌型的Brazzein毕赤酵母重组菌。按照毕赤酵母偏爱密码子设计Brazzein基因,共设计4对引物,采用SOE-PCR法合成Brazzein基因,构建克隆载体pUC57-Bra与酵母表达载体pGAPZαA-Bra。将重组质粒线性化,电转导入Pichia.pastoris SMD1168中,用高浓度的Zeocin筛选高拷贝转化子。将重组菌株接种于YPD培养基诱导表达,进行SDS-PAGE分析。成功构建了分泌型的Brazzein毕赤酵母重组菌,SDS-PAGE表明,目标蛋白的相对分子量与理论值一致,诱导72h后的目的蛋白表达量达0.12g/L。     

油菜pgip基因去信号肽片段在毕赤酵母中的分泌表达

为探讨PGIP蛋白与PG的互作及pgip基因在油菜抗黑胫菌病中的作用,根据Gen Bank中油菜pgip9、pgip15CDS序列设计引物,并去掉信号肽序列,以接种黑胫病病原菌Leptosphaeria biglobosa(菌株NM-1)7 d后油菜叶片总RNA反转录的c DNA为模板,PCR扩增出pgip9、pgip15除信号肽以外的编码区片段,并克隆到巴斯德毕赤酵母表达载体p PICZαA中构建重组质粒p PICZαA-pgip9、p PICZαA-pgip15。重组质粒经单、双酶切、菌落PCR筛选鉴定后热激化法转化酵母细胞PMAD16,再经ZeocinTM的YPD平板和菌落PCR筛选鉴定,经甲醇诱导表达,SDS-PAGE和Western Blot检测,均在36~37 k Da处出现单一的蛋白条带,蛋白分泌表达成功。通过对pgip基因的体外表达,为探讨PGIP蛋白与PG的互作及pgip基因在抗油菜黑胫菌病中的作用奠定基础。     

微小毛霉（Mucor.pusillus）△6-脂肪酸脱饱和酶基因的克隆与表达

目的：微小毛霉（Mucor.pusillus）△6-脂肪酸脱饱和酶基因的克隆与表达。方法：以一株产γ-亚麻酸的微小毛霉为材料,通过PCR方法克隆得到的△6-脂肪酸脱饱和酶基因,构建重组的酵母表达载体pYMpD6D,将重组载体通过醋酸锂方法导入酿酒酵母中,并利用酵母表达系统证实该基因能导致酵母合成γ-亚麻酸。结果：通过GC分析,γ-亚麻酸占总脂肪酸量的6.53％,微小毛霉△6-脂肪酸脱饱和酶基因在酵母中得到了正确的表达。本实验为进一步研究△6-脂肪酸脱饱和酶基因家族和进一步利用该基因来改良作物奠定了一定的基础。     

猪α1干扰素基因的克隆与原核表达

根据猪α1干扰素(pocine interferon-alpha1,poIFN-α1)的全基因序列(EU364896)设计合成1对特异引物,通过RT-PCR从三元杂交仔猪外周血淋巴细胞扩增出poIFN-α1全基因,将该基因克隆到pGEM-T载体,构建重组质粒pGEM-T-poIFN-α1,进行测序。以pGEM-T-poIFN-α1为模板,经PCR扩增带有酶切位点的poIFN-α1基因,将其定向克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,构建重组表达载体pGEX-6P-poIFNα1,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白诱导表达和鉴定,并确定蛋白最佳表达条件。序列分析表明,克隆的poIFN-α1基因全长546bp,编码181个氨基酸,前23个氨基酸组成信号肽,无糖基化位点。SDS-PAGE和Western blotting证实重组表达菌经IPTG诱导后,可表达相对分子质量约46ku的融合蛋白(GST-poIFN-α1)。当以1.0mmol/L的IPTG于37℃下诱导表达9h时,蛋白表达量最高。poIFN-α1基因的克隆与表达为进一步研究其抗病毒活性,开发病毒治疗和疫苗免疫增强用生物制剂奠定了基础。     

鸭疫里默氏菌噬菌体裂解酶的原核表达

为了原核表达鸭疫里默氏菌噬菌体RAP44的裂解酶基因,以噬菌体RAP44的基因组为模板,用PCR方法扩增裂解酶基因,与表达载体p GEX-6P-1连接,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中表达,利用谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和柱纯化表达蛋白。结果成功构建了表达载体p GEX-N,转化菌经IPTG诱导后成功表达出了分子量约为37 k D的可溶性重组蛋白。本研究获得了纯化的鸭疫里默氏菌噬菌体裂解酶重组蛋白,为裂解酶的功能研究奠定了基础。     

△6-脂肪酸脱饱和酶基因种子特异表达载体的构建

以napA基因序列设计引物，以甘蓝型油菜中油821基因组总DNA为模板，通过PCR扩增，克隆了种子特异表达napin启动子。序列分析表明，试验得到扩增片段长1148bp，含有其它napin启动子序列共有的高度保守序列。将扩增序列与真菌匍枝根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因RnD6D连接，构建了RnD6D的种子特异表达载体pCNR，为获得高产γ-亚麻酸的转基因油菜奠定了基础。     

花生△12-脂肪酸去饱和酶基因RNAi表达载体的构建

利用RNAi原理构建花生Δ12-脂肪酸去饱和酶基因的hpRNA表达载体,以抑制该基因的表达,获得高油酸/亚油酸比值的花生种质。根据花生Δ12-脂肪酸去饱和酶基因序列(GenBank:AF248739)设计引物,以豫花4号花生品种DNA为模板,克隆了该基因的启动子及长度约500 bp的外显子片段,在此基础上构建完成由自身启动子引导的花生Δ12-脂肪酸去饱和酶基因的反向重复片段RNAi载体pCAMBIA1301-Afad12Ri。     

棉花GhEPSPS基因的原核表达载体的构建及诱导表达

目的在于构建棉花GhEPSPS基因的原核表达载体,并在宿主大肠杆菌中成功诱导表达。利用RT-PCR技术从陆地棉苏棉18中克隆获得GhEPSPS基因的开放阅读框序列,连接到p EASY-Blunt平端载体,构建获得重组载体p EASY-Blunt-GhEPSPS;以该重组载体为模板,PCR获得两端含有Eco RⅠ和XhoⅠ酶切位点的GhEPSPS基因CDS序列,通过这2个酶切位点插入到p ET32a载体,构建获得原核表达重组载体p ET32a-GhEPSPS,转化到宿主菌株BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE检测目的基因的表达情况。研究结果表明,成功克隆获得了棉花GhEPSPS基因的CDS序列,并成功构建了该基因的原核表达载体,目的基因能够在宿主菌中被诱导大量表达。该研究结果将为深入研究棉花EPSPS酶的结构、功能以及酶学特性提供重要的研究基础。     

转基因烟草表达高山被孢霉△^6-脂肪酸脱氢酶基因的研究

将高山被孢霉ATCCl6266△^6-脂肪酸脱氢酶(D6D)基因亚克隆到植物表达载体pBIl21中，构建了CaMV35S启动子驱动的植物表达载体pBMACL6。经根癌农杆菌LBA4404的介导，采用叶盘法转化烟草Xanthi，得到一批转基因烟草植株。转基因植株的PCR和Southern blot分析表明，D6D基因已经整合到烟草基因组中。脂肪酸GC分析表明，与未转基因的烟草苗对照相比，转基因植株有D6D基因目标产物γ-亚麻酸的产生，说明高山被孢霉的D6D基因在烟草中得到了表达。     

黄灯笼辣椒eIF4Es基因克隆及其酵母双杂交激活域载体构建

通过对辣椒全基因组数据库分析获得黄灯笼辣椒eIF4E基因家族的四个基因,设计两端带有Eco RⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物分别扩增四个基因的ORF,克隆到LexA-酵母双杂交系统的激活域载体pB42AD中,并构建pB42AD-eIF4E、pB42AD-eIF(iso)4E、pB42AD-eIF4E-Xm、pB42AD-n CBP9090重组载体。将重组质粒导入酵母菌株EGY48(p8op-Lac Z)中,进行重组激活域载体的毒性检验和自激活验证。结果表明,扩增获得了正确的黄灯笼辣椒Cc-eIF4E、Cc-eIF(iso)4E、Cc-eIF4E-Xm、Cc-n CBP9090基因ORF,并成功克隆到pB42AD载体中,同时转化有激活域载体的EGY48(p8op-Lac Z)在SD/-Trp/-Ura营养缺陷型平板上生长良好,在SD/-His/-Ura平板上不生长,说明重组质粒表达产物对该酵母细胞无毒性,对下游报告基因无自激活作用。本研究结果证明pB42AD-eIF4E、pB42AD-eIF(iso)4E、pB42AD-eIF4E-Xm、pB42AD-n CBP9090重组载体可用于该系统的互作蛋白筛选,为下一步通过酵母双杂交系统筛选与黄灯笼辣椒eIF4E家族蛋白相互作用的病毒蛋白奠定基础。     

番茄褪绿病毒CP基因克隆、序列分析及原核表达

为制备番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,To CV)抗血清,以番茄病叶为试验材料,提取总RNA,根据To CV CP基因设计特异性引物,利用RT-PCR方法克隆目的基因,构建原核表达载体p ET32a-To CVCP,在大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中表达CP蛋白。结果表明:To CV CP基因(Gen Bank登录号:KT809400)全长774 bp,编码257个氨基酸,与Gen Bank中其他地区分离物核苷酸序列同源性为97.2%~99.6%,推导的氨基酸序列同源性为97.3%~100.0%。核苷酸序列保守位点占全部位点的91.3%,氨基酸序列保守位点占全部位点的88.3%,表明不同地理来源的番茄褪绿病毒的CP基因保守性较高。将To CV CP基因克隆到原核表达载体p ET-32a(+)上,并在体外条件下诱导表达出融合蛋白。SDS-PAGE分析表明,转p ET32a-To CVCP载体的大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株表达了分子量约33 k Da的重组蛋白。该重组蛋白在37℃,1.0 mmol/L IPTG、诱导6 h,表达量最大。     

过表达海藻糖-6-磷酸合成酶拮抗酵母菌工程菌株的构建

本研究构建了带G418抗性的载体pFL61-G418,从酿酒酵母WT303菌株中克隆了真菌抗逆境基因tps1（海藻糖-6-磷酸合成酶基因）,再将tps1基因插入到pFL61-G418载体的NotI位点,构建pFL61-G418-tps1表达载体,并将该表达载体转化进入野生型拮抗酵母膜醭毕赤酵母菌株中。构建过表达海藻糖-6-磷酸合成酶拮抗酵母菌工程菌株,增强拮抗酵母菌的抵抗逆境的生存能力,从而提高其生活力及与病原菌的竞争力。结果表明成功地构建了过表达海藻糖-6-磷酸合成酶拮抗酵母菌工程菌株,说明pFL61穿梭质粒可以用来转化野生型拮抗酵母,G418抗性可以作为转化子筛选的阳性标记。该重组表达载体的成功构建,为野生型拮抗酵母的遗传改良提供了重要的理论依据。     

牛抑制素α亚基基因克隆及表达载体的构建

为克隆牛抑制素α亚基基因,构建抑制素pET32a-成熟肽表达载体,从河北大厂县屠宰场采集卵巢,提取总RNA并反转录成cDNA,根据GenBank NM_174094.4 设计一对引物扩增出成熟肽cDNA,将所扩增基因插入到pET32a 表达载体BamHⅠ与HindⅢ酶切位点之间,构建重组质粒抑制素pET32a-成熟肽。结果成功构建出抑制素α亚基基因。笔者初步得到了抑制素重组质粒,为今后重组蛋白原核表达的研究奠定了基础。     

α-苦瓜素蛋白的原核表达及其抗体制备

α-苦瓜素是一种典型的Ⅰ型核糖体失活蛋白,具有多种生物活性,有着广泛的应用前景。本研究通过原核表达技术成功获得α-苦瓜素蛋白及制备了血清抗体。首先通过RT-PCR方法从苦瓜籽中克隆到α-苦瓜素全长基因,然后将该基因连接至原核表达载体p ET-28a(+)上,导入大肠杆菌Rosetta菌株中并少量诱导表达,筛选出重组蛋白的最适表达条件。在37℃、终浓度1 mmol/L IPTG的诱导条件下,可成功诱导出分子量约为29.7 k D左右的可溶性重组蛋白,与预期α-苦瓜素大小一致。按照最适条件进行大量诱导α-苦瓜素蛋白的表达,利用Ni-NTA柱对α-苦瓜素重组蛋白进行纯化,最后以纯化的α-苦瓜素蛋白免疫注射新西兰大白兔制备抗血清。Western blotting分析表明,制备的抗血清具有较好的特异性和灵敏度,可以特异性检测苦瓜籽中的α-苦瓜素蛋白。本研究结果为下一步探究α-苦瓜素调控植物防御生物胁迫的分子机理提供指导。     

小麦TaGAPC定点突变体基因载体构建及其原核表达

为了研究催化活性半胱氨酸Cys154、Cys158残基对小麦细胞质甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Ta GAPC)蛋白酶活性的影响,利用重叠延伸PCR法分别将这2个位点的半胱氨酸突变成丝氨酸,并分别连入p ET28a(+)原核表达载体。在25℃条件下,Ta GAPC及其定点基因Ta Cys154S/Ta Cys158S经0.25 mmol/L IPTG诱导后高效表达,SDS-PAGE电泳检测结果显示,目标重组蛋白均为可溶性且大小约为40 k Da,与预测结果一致。在此基础上,经超声波破菌及镍柱纯化获得3种纯化重组蛋白。这为后续Ta GAPC及其定点突变体蛋白酶活性测定及活性位点分析提供试验材料。     

转基因烟草表达高山被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的研究

将高山被孢霉ATCC16266 Δ6-脂肪酸脱氢酶（D6D）基因亚克隆到植物表达载体pBI121中,构建了CaMV35S启动子驱动的植物表达载体pBMACL6。经根癌农杆菌LBA4404的介导,采用叶盘法转化烟草Xanthi,得到一批转基因烟草植株。转基因植株的PCR和Southern blot分析表明,D6D基因已经整合到烟草基因组中。脂肪酸GC分析表明,与未转基     

转GbVe1基因在棉花基因组中的整合与定位分析

【目的】明确转GbVe1基因棉花的插入位点序列特征。【方法】Southern杂交筛选低拷贝基因插入的转基因棉花株系,以hiTAIL-PCR(Polymerase chain reaction)获取其T-DNA侧翼序列,然后根据获得的T-DNA侧翼序列设计特异PCR引物,验证插入位点的准确性。【结果】Southern杂交候选了T-DNA低拷贝插入的3个转基因棉花株系,hiTAIL-PCR分离到RB端侧翼序列(119~1 018 bp)、LB端侧翼序列(243~516 bp);侧翼序列的AT碱基含量在63%以上。转基因株系7/100826-152和12/100826-393插入位点都位于Gohir.D01G157600.1内含子上。转基因株系1/w-ch14插入位点分别位于Gohir.D01G157600.1内含子和A12染色体的基因间隔区中。T-DNA在Gohir.D01G157600.1内含子的插入事件造成了21 bp碱基的基因组序列缺失。T-DNA到侧翼序列的PCR产物证明Gohir.D01G157600.1上的插入位点真实可靠。【结论】hiTAIL-PCR获取了转GbVe1基因棉花的T-DNA侧翼序列,提供了T-DNA插入位点位于Gohir.D01G157600.1基因内含子的特异性检测引物。     

酵母双杂诱饵表达载体pGBKT7-ufgt的构建与表达

构建葡萄赤霞珠(Vitis vinifera L.cv Cabernet Sauvignon)花色苷合成前体酶——类黄酮葡萄糖基转移酶(UDPG-flavonoid-3-O-glycosyltranferase,Ufgt)诱饵表达载体。通过RT-PCR扩增获得葡萄ufgt基因CDS序列,与p GBKT7酵母诱饵载体连接;经测序和双酶切鉴定后,转化酵母菌株AH109,分析Ufgt蛋白在酵母菌株中的表达情况。成功扩增出ufgt基因CDS全长,并成功构建了p GBKT7-ufgt,重组载体p GBKT7-ufgt成功的转化到AH109酵母菌株中,且无毒和自激活性,能够正确稳定的表达。p GBKT7-ufgt酵母诱饵蛋白表达载体被成功构建,为后续Ufgt蛋白互作筛选奠定基础。