植物遗传转化方法及其在棉花品质改良育种中的应用

农杆菌介导法、花粉管通道法和基因枪法是植物遗传转化的主要方法，这些转化方法在植物基因工程育种和基因改良中起到了重要作用。这些遗传转化方法目前已经广泛应用于棉花抗虫、抗病和品质改良育种实践，并获得了抗虫、抗病等性状良好的转基因植株，有些已经进入商品化生产，取得了显著的经济效益和社会效益。本文重点综述了这3种应用较广的遗传转化方法及其在棉花抗虫、抗病和品质改良育种中的应用，并讨论了我国转基因棉花研究的进展。     

转几丁质酶和葡聚糖酶双价基因棉花株系对黄萎病的抗性

 采用人工病圃、重病田及苗期室内鉴定相结合的方法,研究了转双价（Chi+Glu）基因的棉花株系61217-1对棉花黄萎病的抗性。结果表明,转基因棉花株系61217-1在人工病圃连续3年达抗病水平,病指极显著低于其受体中棉所24。2009年该转基因株系在河南安阳、江苏大丰及新疆石河子棉花黄萎病重病田的病指分别为18.7、18.1和16.7,均极显著低于受体中棉所24的病指。该转基因株系对来自河北、湖北、新疆的3个强致病力落叶型菌株均达抗病水平,病指分别为16.4、16.8和15.6,也极显著低于受体中棉所24的病指。表明转双价（Chi+Glu）基因的棉花株系61217-1具有优异稳定的抗黄萎病性。     

李付广团队发现抗棉花黄萎病新基因

<正>近日,中国农业科学院棉花研究所研究员李付广团队对陆地棉核糖体蛋白基因GhRPL18A-6在棉花抗黄萎病过程中的功能和机制进行了系统研究。该研究团队发现,该基因能调控细胞壁合成、木质素合成等与抗病相关通路基因的表达,并在多个生长阶段提高转基因棉花的抗性水平。该研究为解析棉花黄萎病抗性提供了思路,并为抗病品种分子育种提供了新的抗病基因及种质资源。棉花黄萎病堪称棉花"癌症",陆地棉遗传背景狭窄,缺乏黄萎病抗性种质资源材料,通过传统育种方法     

获得抗稻瘟病和纹枯病的转多基因水稻

将多个抗真菌病基因连同筛选基因hpt一起导入一水稻品种中，共获得49个独立的整合有1～4个抗真菌病基因的转基因植株系。转基因植株中几丁质酶的酶活均高于非转化对照植株，且转多个几丁质酶基因或与β-1，3-葡聚糖酶基因一起的转基因植株较转单个几丁质酶基因的植株有更高的酶活性。抗病试验表明，这些不同组合的R2代转基因     

3种转非抗虫基因棉花田间节肢动物群落的多样性和食物网结构

以转基因耐盐碱棉花、转基因抗病棉花和转基因抗旱棉花3种转非抗虫基因棉花为材料,研究不同表达性状的转基因棉花种植对棉田节肢动物群落结构、多样性及食物网结构的影响。结果表明,3种转基因棉花在节肢动物群落Shannon-Wiener多样性指数、Pielou均匀度和优势集中性指数上与其对照受体棉花无显著差异(P0.05)。转基因棉花与其对应受体间的群落相似性指数均较高(73.18%~77.65%),食物网结构参数上也无显著性差异(P0.05)。表明3种转非抗虫基因棉花对棉田节肢动物多样性及食物网结构无显著影响。     

南瓜韧皮部特异性启动子在转基因棉花中的表达

以自行构建的重组南瓜韧皮部特异启动子dENP构建了植物表达载体pBII2.利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA44O4介导转化棉花(Gossypium hirsutum L.)品种珂字312,共获得转pBII2和对照pBI121的抗卡那霉素棉花再生植株243株,筛选出172株为转基因阳性植株.Southern blot分析确证外源Gus基因插入拷贝数在1个或2个以上.对这些转基因棉花植株进行Gus染色结果表明dENP和CaMV35S启动子一样均能驱动Gus基因的表达,前者仅在棉花的韧皮部内特异表达,而CaMV35S启动子驱动的Gus基因为组成性表达.Gus酶活力测定结果进一步表明dENP和CaMV35S启动子驱动Gus基因表达水平相当,但是转pBII2棉花植株的Gus富集在韧皮部组织.证明了dENP启动子驱动的外源基因在棉花中具有韧皮部特异而高效表达的特征,从而可用于棉花抗病、抗蚜虫转基因研究.     

棉花GbSTK基因调控开花和黄萎病抗性的功能研究

棉花是重要的经济作物,实现既抗病又早熟是棉花重要的育种目标,但棉花抗病与早熟基因之间的关联性研究报道甚少。本课题组前期鉴定到一个响应黄萎病菌诱导的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因GbSTK,可以提高转基因拟南芥的黄萎病抗性。本研究发现多个抗病棉花品种中STK基因的表达量显著高于感病对照品种H208。在抗病品种农大601中沉默STK基因,沉默植株在接菌后20d,其黄萎病抗性显著降低,病情指数由27.5(耐病)升高到63.2(感病),表明该基因正向调控棉花黄萎病抗性。对转GbSTK基因拟南芥表型鉴定发现,其开花时莲座叶片数平均为7.5个,显著低于空载体对照植株(11.9个),转基因植株开花时间较对照平均提早5~7 d。进一步对拟南芥开花途径标志基因FT、SOC1和LFY的转录水平检测发现,转基因不同株系中FT和SOC1的表达水平显著高于对照植株,而LFY基因的表达受影响较小,表明STK基因可以影响开花关键基因FT和SOC1的表达,进而调控植株提早开花。基于酵母双杂交互作蛋白筛选试验,初步获得30个与GbSTK具有互作关系的候选蛋白,为进一步揭示GbSTK的分子调控网络奠定了基础。本研究首次鉴定出可同时提高黄萎病抗性和提早开花的一个功能基因,为棉花抗病早熟遗传改良提供了参考依据。     

转基因抗病棉花所转抗病基因（Chi+Glu）对棉花生物学特性的影响

此研究为国家转基因抗病棉环境安全评价技术的建立而设。以转入几丁质酶和葡聚糖酶双价抗病基因（Chi+Glu）的中棉所24为试验观察品种,对应的受体中棉所24和赣棉11号非转抗病基因棉为两个对照品种,进行棉花生育性状、产量性状上生物学特性的表现对比,结果中棉所24转入双价抗病基因后,生育期比受体对照延长11天,比非转基因的常规棉赣棉11号延长3天;经LSD最小显著性差异测验,转双价抗病基因（Chi+Glu）对棉苗期株高生长变缓慢影响极显著,对蕾期株高生长缓慢影响显著,而花铃期时株高超速生长影响显著;对蕾花铃发育迟缓、第一果枝节位前移影响显著;对第一果枝高度降低、果枝节距拉大、籽棉和皮棉增产、发芽率提高效应（提高13个百分点）影响极显著;对棉花单铃重、单铃籽棉重、单铃皮棉重、衣分、籽指、衣指、单铃不孕籽粒数性状转好影响明显;对单铃壳重、单铃不孕籽重量变差也有明显影响;对棉花纤维上半部平均长度变短,整齐度指数增加,马克隆值升高,纤维伸长率下降,纤维纺纱均匀指数降低,纤维断裂比强度降低有明显影响。试验显示,所转双价抗病基因对棉花上述生物学特性有显著和极显著影响,尤其对产量性状变好影响极显著（增产籽棉1491.9 kg/hm2）。     

转epsps-G6基因棉花的Southern杂交及遗传特性分析

为鉴定epsps-G6基因成功导入棉花基因组并分析转基因抗草甘膦棉花的拷贝数和遗传特性,以花粉管通道法获得的8个转epsps-G6基因抗草甘膦棉花株系(G6-1、G6-4、G6-5、G6-7、G6-11、G6-19、G6-20、G6-25)为材料,通过Southern点杂交、双酶切和单酶切的Southern杂交后进行分析,结果表明,外源epsps-G6基因已成功整合到棉花基因组上,且其中4个转化株系含有单拷贝插入的epsps-G6基因。选用其中3个单拷贝插入、自交纯合且草甘膦抗性强的株系G6-1、G6-5、G6-19,分别与转基因遗传背景材料(中棉所49)和陆地棉标准系(TM-1)进行正反交,遗传分析结果表明,这3个转基因株系均符合3∶1的孟德尔分离规律,不受细胞质效应的影响。     

转基因技术在棉花育种上的应用

综述了转基因技术在棉花遗传改良中的应用,包括棉花抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆以及品质改良等方面的最新进展,并对棉花转基因研究中存在的主要问题和今后的研究与应用前景进行分析和展望.     

转棉花叶绿体Cu/Zn-SOD基因烟草的获得及其功能的初步验证

构建了棉花叶绿体Cu/Zn-SOD基因的植物表达载体,利用农杆菌介导法将其导入NC89烟草,PCR、Southern blotting检测结果显示有4个烟草株系中整合了棉花叶绿体Cu/Zn-SOD基因,SOD酶活性测定结果显示4株转基因烟草植株SOD酶活性都明显高于非转基因烟草,离体叶片暗处理试验结果也证明四株转基因烟草比非转基因烟草SOD酶活下降速度明显减慢,百草枯喷施试验表明,转基因烟草都比非转基因烟草对百草枯的耐性增强,这一系列试验间接地说明外源基因的导入增强了烟草的耐衰老能力,本研究为今后利用SOD基因研究作物的早衰性状奠定了基础.     

转SNC1基因棉花抗枯萎病防御酶活性分析

以转SNC1基因的棉花中35和军棉1号和对应的非转基因棉花叶片为材料,接种棉花枯萎病病菌,以分析与主要抗病性有关的5类防御酶系。接菌后,和对照相比,转SNC1基因棉花和非转基因棉花防御酶的活性变化差异明显。其中,转基因中35的PAL、SOD、POD和PPO酶活性均高于非转基因中35,并且在接菌第2,4天达到峰值,然后随时间增加呈下降趋势,而CAT酶活性低于非转基因中35,随时间增加变化趋势不明显;转基因军棉1号的PAL、SOD、PPO和酶CAT活性变化趋势同转基因中35,而POD酶活性变化趋势却相反,低于非转基因军棉1号。通过本试验表明,以抗病品种和感病品种为受体得到的转基因棉在受到病原菌侵染后,酶活性变化有差异。其中PAL、SOD、PPO和CAT酶活性变化趋势稳定,其酶活性高低可以作为转基因棉花抗病性的生化指标,同时表明SNC1基因的抗病性在陆地棉中得到体现。     

陆地棉抗黄萎病种质创新与抗病基因挖掘

抗病种质在抗病育种中的地位不可替代。远缘杂交材料创新是陆地棉黄萎病抗性种质创制的重要基础;基因工程提供了创造变异的新技术,但由于抗病机制复杂,导入一、两个主基因的效果还不明显;采用分子生物学技术揭示棉花对黄萎病的抗性机制,发掘棉花抗病基因和病程相关基因,有助于剖析棉花-黄萎病菌互作机制。本文概述了陆地棉抗黄萎病种质创制、抗病品种选育的成就,介绍了棉花黄萎病抗性机理与功能基因发掘等方面的最新进展,为抗病分子设计育种提供理论支持。     

棉花抗虫基因工程研究进展

抗虫转基因棉花的培育是近年来棉花生物技术研究的热点，它为棉花虫害的防治展示了希望。用于棉花抗虫基因转化的方法有根癌农杆菌Ti质粒介导法、聚乙二醇法、基因枪法和花粉管通道法。用于棉花抗虫植株培育的主要基因有BT基因和CPTI基因，其中BT基因应用较多，用其培育出的转基因棉花，在田间用药量减少50％的情况下而不影响产量，这些转基因棉花在美国已大面积示范推广。     

转几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶双价基因小麦的获得和鉴定

利用农杆菌介导法将几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶双价基因导入小麦品种扬麦10号和Bobwhite,共得到了13株T0代转基因植株,2个小麦品种的转化效率分别为1.4%和1.0%.T1代植株赤霉病抗性鉴定结果表明,转基因植株对赤霉病具有一定抗性,小穗发病率4.76%～11.76%,低于抗病对照和感病对照.T1代植株分子检测结果表明,外源基因分离比例为2.33∶1,较低的分离比例可能与外源基因的丢失有关.     

栽培小麦Brock中抗白粉病相关基因TaRPP13-1B的克隆及功能分析

白粉病是小麦生产中的主要病害之一,发掘抗病基因并实现抗病基因转育是提高作物抗病性的最经济有效的方法。本研究克隆了一个位于小麦染色体1B上、具有典型CC、NBS和LRR结构域的基因TaRPP13-1B。接种白粉菌后, TaRPP13-1B基因在抗病小麦Brock和BJ-1中表达量虽然出现上下调波动,但平均表达水平一直高于感病小麦品种京411。采用病毒诱导的基因沉默和转基因过表达技术进行功能分析,发现抑制目标基因表达,抗病小麦品种Brock对白粉菌的抗性显著降低;过表达TaRPP13-1B的转基因小麦津强5号对白粉菌抗性明显提高。说明TaRPP13-1B基因参与小麦抗白粉病的防御反应过程。该研究为小麦抗病品种的选育提供了有价值的备选基因。     

棉花抗黄萎病分子机制研究进展

黄萎病(Verticillium wilt)已严重影响棉花的可持续生产,研究并明确棉花对黄萎病的抗病机制对于黄萎病的防控至关重要。本研究从诱导抗病性(induced disease resistance,IDR)、抗病相关基因介导的抗病性(resistance related gene induced disease resistance,RGIR)以及小RNA的抗病机制(micro RNA mediated disease resistance,MDR)这3个方面综述了棉花黄萎病抗性机制的研究进展,概述了激发子、抗病基因和转录因子的分类与特点以及诱导免疫和理想诱导物的特点;并在棉花抗病基因的发掘上重点作了展望,以期对棉花抗病育种提供理论参考。     

一个棉花β-1,3-葡聚糖酶基因全长cDNA的克隆与特征分析

利用本实验室分离的防卫基因类似物片段,通过5’和3’RACE,从海岛棉海7124中克隆了一个β-1,3-葡聚糖酶基因全长cDNA,命名为GbGLU。其全长1 266 bp,含一个编码361个氨基酸残基的开放阅读框。该基因编码产物理论分子量和等电点为MW = 39.66 kD,pI = 9.15,含有糖基水解酶家族17的保守结构域,N端有26个氨基酸残基组成的信号肽。Southern结果显示,GbGLU在棉花基因组中以单拷贝形式存在,研究发现,GbGLU的表达受黄萎病菌的诱导。聚类分析表明,棉花葡聚糖酶基因可分为3类,分别含有糖基水解酶家族3、9、17的保守结构域。无论棉花中的还是本研究中参考的其他作物中,受病菌诱导的葡聚糖酶基因都含有糖基水解酶家族17的保守结构域,故推断其为此类基因参与抗病反应的功能域。     

农杆菌法转化茎尖获得转SNC1基因棉花及其T_1植株对棉花枯萎病的抗性

以陆地棉中35和军棉1号的茎尖为外植体,利用农杆菌介导法将含有拟南芥抗病基因SNC1(sup-pressor of npr1-1,constitutive 1)转入棉花。对外植体培养时期、农杆菌侵染时间和共培养时间进行改良,实验结果表明,在外植体培养1d,菌液侵染20min,并且共培养保持在2d能够获得较高的遗传转化效率。PCR以及RT-PCR对再生植株T0代和T1代棉花的检测结果表明,SNC1基因已经整合到棉花的基因组中并得到表达。利用浸根法,对T1代转基因棉花接种棉花枯萎病菌强致病力菌株(Fusarium oxysporum f.sp.Vasinfectum),与对照比较,T1代转基因棉花的枯萎病抗性明显提高。     

棉花FAD2-1基因的RNAi载体构建及高油酸新种质的获得

【目的】在棉花纤维产量和品质不受影响的前提下,创造高油酸、低亚油酸棉花新种质。【方法】棉花FAD2-1基因是催化单不饱和脂肪酸的油酸形成多不饱和脂肪酸的亚油酸的关键基因,采用信息分析学方法分析其蛋白质性质、结构、功能;克隆GhFAD2-1的保守片段381 bp,构建RNA干涉载体,采用农杆菌介导的下胚轴侵染方法将干涉载体转入棉花。利用气相色谱-质谱联用仪(Gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)测定转基因T_2～T_4植株种子的脂肪酸成分及含量。对T_4转基因株系进行拷贝数鉴定、目的基因表达量检测、农艺性状及纤维品质考察。【结果】成功构建GhFAD2-1的RNA干涉载体并转入棉花,转基因株系目的基因GhFAD2-1的表达量显著低于对照,具有高油酸、低亚油酸的表型并且能稳定遗传给后代;转基因株系可将棉花种子油酸提高224.1%,将亚油酸降低237.5%。与对照材料相比,转基因株系的农艺性状、纤维品质没有明显差异。【结论】验证了棉花GhFAD2-1基因的功能并且为培育高油酸棉花品种提供了帮助。