不同启动子在转基因烟草中抗番茄黄化曲叶病毒的研究

为了提高植物对番茄黄化曲叶病毒的抗性,利用CaMV35S启动子、棉花韧皮部特异启动子PGHNBS、拟南芥韧皮部特异启动子SUC2分别构建了含有不同启动子控制下的烟粉虱内GroEL基因的植物表达载体P-Gro-EL、P-PGHNBS-GroEL、P-SUC2-GroEL。通过农杆菌介导转化法,获得了一批抗卡那霉素的转化再生烟草植株。RT-PCR结果表明,3个启动子皆驱动GroEL基因在转基因烟草中表达。对转化再生烟草的一次病毒注射侵染结果显示,共有19株抗性烟草植株,其中,转P-GroEL载体的有7株,转P-PGHNBS-GroEL和P-SUC2-GroEL载体的各有6株;2次病毒注射侵染的结果显示,获得7株抗性烟草植株,它们是转P-GroEL载体的1株、转P-PGHNBS-GroEL和P-SUC2-GroEL载体的各3株。2次接种的试验结果表明,PGHNBS和SUC2转基因烟草植株的抗病效果均比CaMV35S转基因植株明显。证明利用韧皮部特异表达GroEL基因可以获得抗番茄黄化曲叶病毒的转基因植物。     

GroEL基因抗番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)的研究

利用烟粉虱体内GroEL基因,构建了具有抗生素标记的SUC2-GroEL和无抗生素标记的CaMV35SPDRB10 2个植物表达载体.通过农杆菌介导法转化番茄,获得抗性再生苗.对抗性植株进行PCR、RT-PCR以及病毒检测.PCR检测结果表明:SUC2-GroEL载体和CaMV35S-PDRB10载体转化的阳性植株分别有11株和9株.RT-PCR检测结果显示:SUC2-GroEL载体和CaMV35S-PDRB10载体转化植株分别有6株和2株检测到GroEL基因特异条带,说明GroEL基因在转录水平得到表达.农杆菌病毒接种和带毒烟粉虱传毒检测结果显示,SUC2-GroEL 载体转基因植株3、4和5号和CaMV35S-PDRB10载体转基凶植株5号均未表现发病症状,证明利用GroEL基因抗番茄黄化曲叶病毒具有可行性,而且SUC2启动子诱导的GroEL抗性更加理想.     

转亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒VP1基因烟草研究

将亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒结构蛋白VP 1基因克隆到植物表达质粒pB in438中,构建了植物表达载体pB in-VP 1,通过根癌农杆菌叶盘转化法,将亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒结构蛋白VP 1基因导入NC 89烟草基因组中,对经卡那霉素筛选获得的20株抗性植株,进行PCR和RT-PCR检测。结果表明,抗性烟草植株中已整合了VP 1基因。     

转亚洲Ⅱ型口蹄疫病毒VP1基因烟草研究

将亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒结构蛋白VP 1基因克隆到植物表达质粒pB in438中,构建了植物表达载体pB in-VP 1,通过根癌农杆菌叶盘转化法,将亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒结构蛋白VP 1基因导入NC 89烟草基因组中,对经卡那霉素筛选获得的20株抗性植株,进行PCR和RT-PCR检测。结果表明,抗性烟草植株中已整合了VP 1基因。     

马铃薯Y病毒复制酶基因的转基因烟草对PVY的抗性

将农杆菌LBA4404/pAL4404、pBin438双元载体上的NIb基因正义序列、反义序列、5''-缺失序列及新霉素磷酸转移酶基因(NPTⅡ)转入烟草品种NC89的染色体,获得抗卡那霉素的转化再生烟草植株.经抗性筛选、PCR检测、无性扩繁和大量重复抗病鉴定,结果表明,转化烟草植株DNA中整合了外源目的基因;NIb基因正义序列、5''-缺失序列转化再生植株中,均出现抗10μg/mlPVY侵染的植株;NIb基因反义序列转化再生植株仅部分抗5μg/mlPVY侵染.ELISA分析认为抗性植株无病毒累积.初步筛选出对PVY侵染具有较高抗性的转基因烟草植株.     

香料烟粉虱传双生病毒的分子检测

发生在保山香料烟生产区粉虱传双生病毒病,已严重影响到了香料烟的品质和产量。本研究利用PCR技术快速检测香料烟植株及田间其它植物如胜红蓟、赛葵及菜豆等、以及病毒介体的带毒情况。对部分样品的PCR检测及序列分析表明,感染香料烟双生病毒有中国番茄黄曲叶病毒、番茄黄曲叶病毒、云南烟草曲茎病毒、烟草曲茎病毒以及云南烟草曲叶病毒等,且一些样品存在复合侵染现象。本研究为掌握病害发生流行的基本规律,监控病害在香料烟上的发生流行提供了依据。     

烟粉虱内共生菌传毒相关groEL基因dsRNA载体的构建及其在烟草中的表达

烟粉虱内共生菌groEL基因编码一种与植物病毒传毒相关的GroEL蛋白.以B型烟粉虱为研究对象,利用1对特异引物,对B型烟粉虱体内的groEL基因进行PCR扩增,选取502 bp groEL基因片段构建dsRNA,并将其连接植物表达载体pBIN19,将重组质粒电激转化农杆菌菌株LBA4404.采用农杆菌浸染转化本氏烟草,PCR筛选表明,目的片段已整合至转基因植株的基因组DNA;RT-PCR结果表明,502 bp的groEL基因片段在转基因植株中被转录.     

多抗PVY、TMV和CMV转基因烟草的培育

 【目的】利用RNA介导抗性培育抗多种植物病毒的转基因烟草。【方法】分别以马铃薯Y病毒（PVY）、烟草花叶病毒（TMV）和黄瓜花叶病毒（CMV）全长衣壳蛋白（CP）基因为模板,通过设计PCR引物和亚克隆获得PVY CP 3′端长度100 bp、TMV CP 3′端长度100 bp和CMV CP 3′端长度200 bp的cDNA片段并拼接成嵌合基因,并以此为模板构建反向重复结构嵌合基因的植物表达载体pRHPTC。将pRHPTC通过冻融法导入农杆菌LBA4404,采用叶盘法转化烟草NC89,然后测定转基因烟草对3种病毒的抗性。【结果】经卡那霉素筛选和PCR检测,共获得276株转基因烟草。Southern和Northern blot分析表明,外源基因以不同拷贝数整合于烟草基因组中;不同转基因植株中病毒RNA的积累量存在显著差异。抗病性检测显示：23%左右的转基因植株表现出对3种病毒侵染的抗性。对转基因植株扩繁后代和T1代的抗性分析表明：多病毒抗性表现稳定。【结论】利用RNA介导的抗病毒基因工程可获得同时抗多种病毒的转基因烟草,其抗病性在T0代扩繁植株和T1代植株中得到稳定遗传。     

植物生长素合成酶iaaM基因在烟草韧皮部

为探讨生长素过度合成对植物韧皮部发育的影响,利用韧皮部特异表达的拟南芥蔗糖合成酶基因启动子与色氨酸单加氧酶基因(iaaM)重组,构建载体,通过根癌农杆菌介导的叶盘转化法将其转入烟草,获得了转化的烟草植株。大多转基因烟草都表现出叶片卷曲、植株生长异常的生长素过度表型。转基因烟草植株生长较野生型烟草(对照)植株明显迟缓,但其茎横切面韧皮部细胞显著增多,排列更加紧密整齐,木质部也较早开始分化。转基因烟草茎段有大量不定根分化,其根部则在韧皮部薄壁细胞处诱生大量根原基,在不定根上有大量侧根和根毛的分化。     

马铃薯Y病毒6kD和NIa基因转化的烟草介导抗病性

将马铃薯Ｙ病毒中国分离株（ＰＶＹ－Ｃ）的６ｋＤ和ＮＩａ基因拼接和改造，分别构建了其正向表述和反向转录的植物表达载体。借助土壤农杆菌ＬＢＡ４４０４将在此双元载体上的６ｋＤ和ＮＩａ基因及新霉素磷酸转移酶基因（ＮＰＴⅡ）转入到烟草品种ＮＣ８９的染色体上，从而获得了抗卡那霉素的转化再生烟草植株。用ＰＶＹ－Ｃ对这些转化烟草进行抗性接种试验，结果表明部分转基因植株能够抵制ＰＶＹ－Ｃ的侵染，对抗病植株的子一代（Ｒ１）进行进一步的抗性分析发现，其Ｒ１代通过遗传也获得了这种抗病性。     

Detection of GLV, OYDV and LYSV in potato onion （Allium cepa L., Aggregatum group） by RT-PCR

Three pairs of primers were designed and synthesized from nucleotide sequences of garlic latent virus (GLV), onion yellow dwarf virus (OYDV), and leek yellow stripe virus (LYSV) by using PCR primer design software. The expected fragments about 170 bp, 287 bp, and 191 bp were amplified by RT-PCR for GLV, OYDV, and LYSV, respectively in disease-infected plants of potato onion (Allium cepa L., Aggregatum group), but such fragments were not obtained from healthy-looking plants and virus-free seedlings of shoot-tips. The amplified products of GLV, OYDV and LYSV were cloned into pGEM-T vectors, and transformed into Escherichia coli. JM109. The recombinant plasmids were obtained and sequenced. The nucleotide sequences were compared with corresponding viral nucleotide sequences reported in GenBank by performing a NCBI BLAST. The analysis showed that their homology attained 75% to 90%,89.5% to 96.1%,and 91.6% to 96.3% in GLV, OYDV, and LYSV, respectively. The total RNA of 6.34 μg·μL~(-1) from infected plants was diluted to a series of 10~(-1) to 10~(-5) and the detection sensitivity of RT-PCR was 10~(-4) (about 4 ng). Thus, a method of identification and detection by RT-PCR of GLV, OYDV, and SLYV was established.     

柑橘黄化花叶病毒侵染性克隆构建及应用

【目的】构建柑橘黄化花叶病毒（citrus yellow mosaic virus,CYMV）侵染性克隆,为深入研究其分子特性及致病机理打下基础。【方法】利用In-Fusion同源重组技术将分段扩增的CYMV基因组序列与三元表达载体pCY重组连接,构建该病毒1.4倍基因组全长DNA克隆并开展序列分析。将所获克隆通过农杆菌介导接种尤力克柠檬实生苗,通过分子检测、症状和病毒粒子观察及再嫁接实验鉴定其侵染性。利用所获侵染性克隆接种不同的柑橘品种及草本植物,通过RT-PCR检测确定侵染率,观察不同柑橘品种受侵染后的症状差异。基于侵染性克隆构建ORFⅠ和ORFⅡ分别替换为绿色荧光蛋白基因（green fluorescent protein,gfp）的突变体,分析突变对病毒侵染性的影响。【结果】利用In-Fusion同源重组技术获得CYMV 1.4倍基因组全长DNA克隆7个。其中,CYMV-3与已登录GenBank的9个CYMV分离株基因组相应核苷酸序列一致性为90%—100%,与分离株CYMV-SO(AF347695)同源性最高并在遗传进化树上聚为一簇。侵染性鉴定结果表明,CYMV-3接种的14...     

马铃薯卷叶病毒外壳蛋白基因克隆转化及其转基因后代的表达

根据GenBank中的马铃薯卷叶病外壳蛋白基因(PLRV-CP)全序列,设计一对特异性引物,以马铃薯卷叶病毒RNA为模板,克隆了马铃薯卷叶病外壳蛋白基因,在pBI121的基础上构建了植物表达载体。利用PLO(Poly-L-Ornithine)将PLRV-CP基因导入到马铃薯加工型品种大西洋的原生质体中,获得了转基因后代。在5株转化后代中扩增出长度为610bp的目标DNA片断,说明导入的外源PLRV-CP基因已经整合到马铃薯基因组中。Southern blot分析结果进一步证明了PCR结果的正确性。RT-PCR结果表明,在3株转化后代叶片中具有阳性表达。马铃薯卷叶病毒接种实验结果表明,转基因植株比对照有明显的马铃薯卷叶病抗性。     

六种禽病原检测的基因诊断芯片的研制及临床应用

利用RT-PCR或PCR技术扩增出新城疫病毒（newcastle disease virus）、低致病性禽流感病毒（avian influenza）、传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus）、减蛋综合征（egg drop syndrome）、传染性喉气管炎病毒（infectious laryngotracheitis）、鸡毒支原体（mycoplasma gallisepticum）基因的各一段保守序列,以纤维素膜作为生物芯片制作的基质,通过微量点样技术产生二维DNA探针阵列,即基因芯片（gene chip）。从可疑病料中提取病原核酸,通过RT-PCR掺入法标记bio-11-dUTP,将获得的标记PCR产物和基因芯片进行杂交,通过检测杂交信号的强弱来实现对生物样品的快速、高效检测及分析。芯片灵敏度高于RT-PCR和病毒分离,分别为RT-PCR和病毒分离的102倍和104倍,有忠实的特异性,动物实验结果符合率在95%以上。     

草莓植株中病毒dsRNA的分离和鉴定

 【目的】病毒核酸分离是病毒基因组解析的基础，本研究旨在建立草莓病毒的dsRNA分离方法，获得草莓主要病毒的部分基因组序列。【方法】采用改进的dsRNA分离方法，对草莓病毒指示植物和栽培品种中的病毒dsRNA进行分离，通过琼脂糖凝胶电泳和RT-PCR来鉴定。【结果】不同草莓品种中病毒dsRNA的含量不同，试管苗叶片中dsRNA含量高于露地苗幼叶，而露地苗幼叶中dsRNA含量明显高于完全成熟叶。dsRNA对DNase Ⅰ具有很强的耐性；当酶解缓冲液中含0.5 mol·L-1 NaCl时，dsRNA对RNase A具有较强的耐性。利用DNA凝胶回收试剂盒，能够有效回收凝胶中的dsRNA片段。应用RT-PCR技术，从凝胶回收的dsRNA及DNase Ⅰ/RNase A两酶酶解处理后的dsRNA中分别扩增出草莓斑驳病毒和草莓轻型黄边病毒的特异片段。【结论】建立了从草莓植株中分离和鉴定病毒dsRNA的完整技术体系，为草莓病毒中国分离物的基因组解析奠定了重要基础。     

百合无症病毒的RT-PCR和IC-RT-PCR检测

 应用DAS-ELISA,RT-PCR和IC-RT-PCR技术检测百合无症病毒（LSV）。 结果表明:RT-PCR和IC-RT-PCR分别可从2 ng和200 ng百合叶片组织中检测出LSV,分别是DAS-ELISA敏感度的1 000倍和10倍。百合鳞茎的不同取样部位对PCR检测结果的影响较大,RT-PCR难以从鳞片和根部检测出病毒,但IC-RT-PCR可以检测出病毒。     

双重RT-PCR同时检测兰花两种主要病毒的研究

以利用Trizol试剂盒提取的蝴蝶兰组培苗叶片总RNA为模板,根据已报道的建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CyMV)和齿兰环斑病毒(Odontoglussm ringspot virus,ORSV)外壳蛋白基因(cp)的保守序列设计特异性引物,探索RT-PCR反应条件,建立了可同时检测CyMV和ORSV的双重RT-PCR体系。