海岛棉A亚组和草棉及阿非利加棉单染色体鉴定

 以1套13个陆地棉A亚组染色体特异的BAC克隆为探针, 与海岛棉Pima90-53、红星草棉和阿非利加棉染色体进行荧光原位杂交。这些探针均在染色体上产生了特异信号,从而鉴别了这3个棉种基因组的单染色体。因此,这套BAC克隆也可以作为这3个基因组染色体的细胞遗传学标记。在此基础上,对3个棉种的A（亚）组染色体物理序号进行了命名。根据这些分子标记和连锁群的关系,染色体物理序号和遗传连锁图谱间可实现相互转化。这将有助于研究棉属不同棉种间的起源演化关系,以及新的遗传标记的染色体物理定位和构建染色体物理图谱等。     

硬粒小麦Glu-B3基因家族新成员的克隆及其分子标记的开发

获得小麦低分子量谷蛋白基因家族新成员, 为深入研究该基因家族的组成及其在染色体上的分布与进化奠定基础。本研究根据已发表的小麦低分子量麦谷蛋白基因序列设计了1对简并引物, 以从硬粒小麦品种Langdon BAC文库中筛选的携带小麦低分子量谷蛋白基因的BAC为模板, 利用同源序列克隆技术克隆了1个MET类型的小麦低分子量谷蛋白基因LMWLDN-M, 该基因编码350个氨基酸。利用LMWLDN-M与本实验室克隆的Langdon品种其他类型的小麦低分子量谷蛋白基因之间的SNP, 设计了该类型基因特异的引物。以Langdon代换系和中国春小麦缺体-四体为模板进行PCR扩增, 将该基因定位到小麦B基因组上。序列分析表明, LMWLDN-M为Glu-B3基因家族的一个新成员。     

硬粒小麦Glu-B3基因家族新成员的克隆及其分子标记的开发

获得小麦低分子量谷蛋白基因家族新成员, 为深入研究该基因家族的组成及其在染色体上的分布与进化奠定基础。本研究根据已发表的小麦低分子量麦谷蛋白基因序列设计了1对简并引物, 以从硬粒小麦品种Langdon BAC文库中筛选的携带小麦低分子量谷蛋白基因的BAC为模板, 利用同源序列克隆技术克隆了1个MET类型的小麦低分子量谷蛋白基因LMWLDN-M, 该基因编码350个氨基酸。利用LMWLDN-M与本实验室克隆的Langdon品种其他类型的小麦低分子量谷蛋白基因之间的SNP, 设计了该类型基因特异的引物。以Langdon代换系和中国春小麦缺体-四体为模板进行PCR扩增, 将该基因定位到小麦B基因组上。序列分析表明, LMWLDN-M为Glu-B3基因家族的一个新成员。     

甘蓝基因组细菌人工染色体文库的构建

细菌人工染色体（ BAC）文库是克隆甘蓝抗病优质重要基因的基础,以抗枯萎病、富含硫代葡萄糖苷的结球甘蓝自交系R4P1为材料,美国Epicentre公司的CopyControl TM pCC1BACTM为载体,构建了甘蓝细菌人工染色体文库。该文库有73344个克隆,插入片段平均大小约97 kb,空载率＜3％,覆盖甘蓝基因组约10．9倍,筛选到甘蓝任一基因的概率为99．99％,这些结果表明,构建的文库质量较好,可用于后续分析。构建的甘蓝BAC文库不仅可用于枯萎病基因的克隆,而且为克隆其他重要的功能基因及基因组学等的研究奠定了基础。     

棉花细菌人工染色体文库构建方法探讨

 细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosome, BAC）文库是开展基因组测序、基因图位克隆、分子标记、物理作图等研究的重要基因组资源。本文在构建了二倍体野生棉阿非利加棉（Gossypium herbaceum var. africanum）BAC文库的基础上,就棉花细菌人工染色体基因组文库构建过程中高分子量基因组DNA的提取、部分酶切片段选择、DNA的回收、连接转化以及BAC文库的保存等过程中一些细节和注意事项进行了比较详细的分析比较,希望能为棉花BAC文库的构建提供一些可供借鉴的经验。     

樟树细菌人工染色体(BAC)文库的构建及质量检测

樟树(Cinnamomum camphora(L.)Presl)是一种具有材用、药用、油用、香料和生态环境建设等多种用途的樟科植物代表种。本研究以樟树幼嫩叶片为材料,通过提取高分子量核DNA(HMW-DNA)构建了第一个樟树细菌人工染色体(BAC)文库。该文库一共有36 960个克隆,平均插入片段为120 kb,覆盖樟树全基因组5.7倍左右,空载率小于1%。随机挑选10个BAC克隆进行末端测序说明BAC克隆为正常可用的单克隆。以此为基础,对樟树的BAC文库进行了测序,最终得到287.28 G的数据。樟树基因组BAC文库的构建,为樟树重要功能基因的克隆、功能验证、物理图谱的构建和全基因组测序等研究工作奠定了基础。     

小麦贮藏蛋白中高分子量谷蛋白基因的5＇上游调控序列克隆

以小麦品种东农7742的基因组DNA为模板，用PCR的方法克隆了小麦贮藏蛋白中高分子量谷蛋白12亚基基因（HMW-GS12）的上游调控序列。序列测定结果表明：所克隆的启动子片段大小为917bp，该片段的498～922bp序列与Thomspon报道的同一亚基对应区段序列比较，同源性为97．9％，有9个核苷酸发生了改变。推测的TATA box位于836～841bp，有3个CAAT-like box，分别是693bp处的CCAA；730bp处的CAAAT和808bp处的CCAT。另外，在684bp存在E-box（TGCAAAG），还有2个E-like box，分别是608bp处的TGCAAAC和510bp处的TGCAAAA。认为该元件可能与转录速率和胚乳特异性的表达调控有关。     

Bph15在非洲栽培稻、药用野生稻和宽叶野生稻中的BAC-FISH比较物理定位

用覆盖抗褐飞虱基因Bph15的两个BAC克隆,即20M14 (27 kb)和64O9 (36 kb)作为探针,对非洲栽培稻、药用野生稻和宽叶野生稻体细胞染色体进行荧光原位杂交(FISH)。两个BAC克隆均被定位于非洲栽培稻和药用野生稻第4染色体的短臂上,杂交信号的百分距离分别为37.03±4.11和81.22±3.62,相应的信号检出率为41.18%和38.22%。在宽叶野生稻中,有两对同源染色体同时检出信号,分别定位于染色体的短臂和着丝粒区,信号距着丝粒平均百分距离分别为87.78±5.23和0,信号检出率为52.58%。由此推知,这两个BAC克隆在非洲栽培稻和药用野生稻的第4染色体分布同线且同区,并且在宽叶野生稻的DD基因组也存在Bph15基因的同源序列。在未封阻的情况下,BAC克隆在非洲栽培稻的多条染色体上有杂交信号,表明它和栽培稻C_0t-1 DNA在一定程度上具有同源性。上述结果初步显示Bph15在3个稻种染色体中的相对位置。文章讨论了Bph15在3个种间的关系,为有效分离和利用Bph15基因提供了有益的依据,对不同基因组及二倍体和四倍体中功能基因可能进化机制的分析提供了线索。     

籼稻背景的单片段代换系群体的构建

以国内、外12个水稻品种（包括8个籼稻品种和4个粳稻品种）为供体亲本，利用回交和微卫星标记辅助选择相结合的方法构建了一个以籼稻品种“华粳籼74”为遗传背景的单片段代换系（SSSL）群体。该群体由260个不同的SSSL组成，其代换片段分布在水稻的12条染色体上，长度分布于0.2～109.9 cM，平均长度为19.9 cM；代换片段的总长度为5 166.0 cM，相当于水稻基因组总长度的3.4倍，代换片段在水稻基因组上的覆盖率为83.8%。这些SSSL的代换片段包含了水稻基因组丰富的等位基因变异，将在基因（QTL）的定位、克隆、功能分析及水稻分子育种中具有重要的利用价值。     

Bph15在非洲栽培稻、药用野生稻和宽叶野生稻中的BAC-FISH比较物理定位

用覆盖抗褐飞虱基因Bph15的两个BAC克隆，即20M14 (27 kb)和64O9 (36 kb)作为探针，对非洲栽培稻、药用野生稻和宽叶野生稻体细胞染色体进行荧光原位杂交(FISH)。两个BAC克隆均被定位于非洲栽培稻和药用野生稻第4染色体的短臂上，杂交信号的百分距离分别为37.03±4.11和81.22±3.62，相应的信号检出率为41.18%和38.22%。在宽叶野生稻中，有两对同源染色体同时检出信号，分别定位于染色体的短臂和着丝粒区，信号距着丝粒平均百分距离分别为87.78±5.23和0，信号检出率为52.58%。由此推知，这两个BAC克隆在非洲栽培稻和药用野生稻的第4染色体分布同线且同区，并且在宽叶野生稻的DD基因组也存在Bph15基因的同源序列。在未封阻的情况下，BAC克隆在非洲栽培稻的多条染色体上有杂交信号，表明它和栽培稻C_0t-1 DNA在一定程度上具有同源性。上述结果初步显示Bph15在3个稻种染色体中的相对位置。文章讨论了Bph15在3个种间的关系，为有效分离和利用Bph15基因提供了有益的依据，对不同基因组及二倍体和四倍体中功能基因可能进化机制的分析提供了线索。     

陆地棉雄性不育恢复系18R的BAC文库构建

 18R雄性不育恢复系农艺性状优良,恢复性状稳定,对不育系能够100%恢复,是研究棉花三系互作的重要材料。本研究以pCC1BAC(BamHI)为载体,构建了18R的细菌人工染色体（BAC）文库。建立的文库包含139,200个BAC克隆。分析结果表明, BAC文库DNA插入片段为50～200 kb,91%的克隆插入片段为80～150 kb,平均102 kb,空载率<2%,覆盖6.3倍基因组。     

雷蒙德氏棉细菌人工染色体文库的构建

细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)文库是开展基因组测序、基因图位克隆、分子标记开发、物理作图等研究的重要基因组资源。本研究以二倍体野生棉雷蒙德氏棉(G.raimondii,D5)为材料,从成株期暗培养的黄化幼嫩叶片中得到纯净、完整和高质量的基因组DNA。经脉冲场凝胶电泳检测,所提取基因组DNA大于700 kb。经酶切、片段选择、连接转化,构建了雷蒙德氏棉的基因组BAC文库,文库共包含26 880个克隆,平均插入片段为127 kb,覆盖该棉种全基因组的3.7倍左右,克隆空载率小于5%。该文库的构建,为雷蒙德氏棉基因组物理图谱的构建、功能基因的定位与克隆、以及比较基因组研究提供了重要的基因组资源。     

植物SNP数据库及转化CAPS的方法

单核苷酸多态性(SNP)在植物基因组中广泛存在,基于SNP的分子标记也正越来越广泛地应用到植物基因定位、图位克隆及分子标记辅助育种等方面。模式植物拟南芥和水稻的全基因组序列测定已经完成,拟南芥有两种生态型完成了全序列测定,水稻有两个品种完成了全序列测定。许多植物有来自不同品种或不同组织器官或生长发育阶段的大量的EST序列。这些序列是植物SNP开发的重要资源。利用生物信息学手段对全基因组序列或EST序列进行分析已经形成了许多SNP位点数据库,这些数据库的建立为基于SNP的基因功能研究及分子标记开发提供了宝贵的资源。本文对植物SNP位点开发涉及的数据库资源及已经形成的SNP位点数据库进行了总结,并讨论了将SNP位点转化成CAPS或dCAPS标记的方法和相应的工具软件。     

栽培花生中基因表达序列标记的产生和标记开发

本试验用抗叶片斑点病和番茄斑枯病毒的花生品系C34—24的叶片以及耐干旱胁迫和收获前黄曲霉素污染的花生品系A13的未成熟荚果制备成mRNA，然后用其mRNA构成两种cDNA文库，最后用这两种cDNA文库来开发出了栽培花生（Arachishy pogaea L．）中的表达序列标记（Expressed Sequcncetag，Esr）文库。对随机选择的cDNA克隆进行部分地排序，以便产生总共1825个ESTs，     

国家科技计划支撑我国分子育种强力推进

植物功能基因组学研究成果显著。2001年公布了世界上第一张籼稻全基因组工作框架图，2002年12月完成了籼稻品种9311的全基因组“精细图”的测序，并预测出约6万个水稻基因，随后完成了粳稻（日本晴）4号染色体的精确测序，精确度为99．99％，覆盖染色体全长序列98％，是国际上最先完成精确测序的两条水稻染色体之一。目前我国已获得具有重要应用价值并拥有自主知识产权的抗病虫、抗逆、抗除草剂以及与产量、品质改良相关新基因400多个，取得了一系列具有原创性的研究成果。     

水稻Xa-5基因在水稻和玉米中的比较物理定位

比较基因组分析证明，玉米和水稻基因组间存在广泛的同线性和共线性。对水稻和玉米基因的原位杂交定位可以揭示禾本科植物基因组结构的共同特点和进化规律。用与Xa-5连锁的RG556及RG556筛选出的BAC克隆44B4作探针对水稻广陆矮四号和玉米自交系黄早四进行了原位杂交，在水稻第5号染色体短臂和玉米第8号染色体长臂检出了杂交信     

雷蒙德氏棉一段单拷贝序列的FISH分析

雷蒙德氏棉基因组草图的完成为棉花的基础研究奠定基础,然而该基因组草图仍需要后续的补充和完善。利用雷蒙德氏棉基因组草图信息,分别在6条较长染色体的端部选取了4 kb的序列。通过生物信息学分析这些序列在基因组中的拷贝情况,发现2号染色体一端的序列Chr2D属于单拷贝序列,且其内部没有重复序列。随后以该段序列为探针,对雷蒙德氏棉有丝分裂中期染色体进行荧光原位杂交,结果显示在1号染色体和4号染色体的一端有明显的杂交信号,信号大小远远大于4 kb序列所能产生信号的大小,而信号的强度则比正常的杂交信号暗弱。试验结果说明该4 kb序列Chr2D可能在1号染色体和4号染色体的1个端部有较高的拷贝数,而信号强度的暗弱则说明该序列在染色体上的分布方式可能为散漫分布。杂交信号在1号染色体和4号染色体上的相似性说明,这2对染色体可能有一定的亲缘关系。该结果将对雷蒙德氏棉基因组草图的补充完善有帮助。     

小麦新品种“成电麦1号”α-醇溶蛋白基因的分离与序列分析

以染色体工程方法培育小麦新品种“成电麦1号”基因组DNA为模板,用小麦种子醇溶蛋白保守引物进行PCR扩增。扩增产物经克隆测序,获得978-1310 bp的6个序列（CD-1、CD-9、CD-11、CD-12、CD-17和CD-21）,其中3个序列（CD-1、CD-12、CD-17）编码284~301个氨基酸的α-醇溶蛋白基因,所编码的氨基酸序列在多聚谷氨酰胺区和重复区出现较大差异,在编码序列的半胱氨酸的数量和位置上,CD-1和CD-12序列具有特殊性。与乳糜泻（celiac disease）病人毒性抗原相关序列的比对结果表明CD-12不具有Glia-α20表位,而CD-1和CD-17序列只具有Glia-α9,Glia-α20的抗原序列。根据已发表的小麦A、B或D染色体组的α-醇溶蛋白基因的序列建立系统树,发现所克隆的“成电麦1号”α-醇溶蛋白基因序列具有特殊性,说明染色体工程方法培育的小麦新品种具有较大的种子蛋白基因变异,这些基因对小麦品质育种的作用值得进一步研究。     

柑桔线虫抗性主基因座Tyr1的特异标记开发与遗传作图改进(英文)

本文利用先期从BAC文库获得的NBS-LRR类候选抗病基因克隆序列Pt8a和Pt9a,进一步开发与柑桔线虫抗性主效基因位点Tyr1连锁的分子标记。以Pt8a和Pt9a序列作探针,通过高密度克隆印迹杂交,从BAC文库筛选出200个以上的阳性克隆,以阳性克隆插入序列设计引物,对柑桔抗线虫材料和感线虫材料开展以PCR扩增为基础的集群分离分析,发现一部分克隆序列与柑桔线虫抗性主效基因位点Tyr1紧密连锁;再通过染色体步行测序,分别从3个克隆（7A4,4L17和29F20）获得3个完整的NBS-LRR类候选抗病基因序列。从此类序列开发更高特异性的分子标记,并在利用原有分子标记的基础上,对柑桔线虫抗性杂交后代群体（9145 family）构建较高密度的遗传图谱;同时,将新开发的分子标记应用于柑桔衰退病抗性杂交后代群体（9401 family）,以初步估算柑桔线虫抗性主效基因位点Tyr]与柑桔衰退病抗性基因Ctv的遗传距离。     

对水稻褐飞虱抗性相关的数量性状位点和表达序列标记的制图

为了绘制负责水稻褐飞虱抗性的基因，我们用褐飞虱抗性品系与敏感性品种Ninghui63杂交，育成—个重组自交系群体，以该群体为基础绘成了一个水稻遗传图。检测到了褐飞虱抗性的4个数量性状位点。采用有限的相减混杂法分离出了由褐飞虱进食所调节的表达序列标记(EST)，并且通过RFLP制图和收索水稻基因组数据库，把这些标记限定在了几个染色体上。EST标记的分布表现为几组，有些EST标记与已知QTL和已知抗性基因有关系。这些发现说明，绘制不同的EST标记可能是鉴定植物后备保卫基因的一种有用方法；而其保卫基因对培育褐飞虱抗性品种是有益的。