口蹄疫病毒持续感染黄牛分离毒株VP1和3ABC基因变异特征分析

摘要：为明确口蹄疫病毒持续感染黄牛期间病毒基因变异情况,本试验主要研究口蹄疫病毒持续感染分离株结构蛋白VP1和非结构蛋白3ABC基因在牛体内的动态变化规律。用O/Akesu/58毒株以104ID50/ml剂量舌面穿刺接种5头中国黄牛,出现临床或亚临床症状之后痊愈动物会成为可能的口蹄疫病毒带毒牛。用探杯定期采集实验牛咽喉部黏性液体（O/P液）,接种BHK-21细胞增殖病毒后共分离到12株毒株。RT-PCR方法扩增持续感染分离毒株VP1和3ABC基因,克隆测序后分析发现所有持续感染分离毒株的VP1基因有16个核苷酸位点发生一致的突变,但只有两个位点造成氨基酸突变(I56→T、A210→E),而持续感染分离毒株之间有4个核苷酸位点和3个氨基酸位点发生了颠换。非结构蛋白3ABC基因较为稳定,仅有13个核苷酸位点和5个氨基酸位点的颠换,没有缺失或突变。推测口蹄疫病毒持续感染的形成与主要的抗原基因VP1变异没有显著关系,宿主嗜性相关的3ABC基因也没有明显变化。     

O型口蹄疫病毒VP1基因的高效可溶表达及抗原性分析

将猪源Ｏ型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV)VP1基因克隆到原核表达载体pMBX上，成功地构建重组表达质粒pMBX-VP1。将其转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞中，经SDS-PAGE分析，融合蛋白分子量约为58 kD，表达产物占菌体总蛋白的35.5％。 经蛋白可溶性分析，目的蛋白在裂解沉淀中占6.8％，在裂解上清中占31.2％，融合蛋白绝大部分是以可溶形式表达的。经Western blot证实，可溶表达的融合蛋白与FMDV阳性血清具有良好的免疫反应性。将可溶表达的融合蛋白用50%Ni-NTA树脂纯化，用融合蛋白作包被抗原，通过ELISA方法，能特异性地检测出口蹄疫阳性血清。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC基因的克隆与原核表达

以O型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)为研究对象，通过RT-PCR扩增到非结构蛋白3ABC基因，定向克隆到原核表达载体pET-42a上。表达产物经SDS-PAGE和Western blot检测，证明重组载体pET-42a-3ABC成功地在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达了3ABC蛋白，这一研究为建立以基因工程产品为抗原、鉴别诊断自然感染和免疫动物的方法提供了技术条件。     

口蹄疫病毒3AB基因的克隆与原核表达

根据口蹄疫流行毒株设计一对包含3AB部分基因编码区的特异性引物,扩增出3AB基因550 bp的特异带,并将纯化的扩增产物克隆到pM D 18-T载体上。再用设计的酶切位点将3AB基因分别连接到两种原核表达载体上,构建了重组质粒pETCK S-3AB及pET 28a-3AB,转入BL 21菌中进行原核表达。SDS-PAGE电泳表明,3AB基因在两种表达系统中均高效表达。对表达的蛋白通过包涵体及切胶纯化的方法进行纯化,获得了高纯度的3AB蛋白。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3AB基因的可溶性表达与反应原性的鉴定

设计特异性引物扩增得到完整的口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白(NSP)3AB基因,定向克隆到表达载体pET-30a中,获得了重组质粒pET-3AB,并转化大肠杆菌(Eschenchia coli)BL21(DE3).重组菌分别在37℃和28℃条件下诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳鉴定,观察到37℃培养条件下目的蛋白形成包涵体,在28℃条件下培养目的蛋白以可溶性的形式表达.Western blot分析表明,表达的目的蛋白能与FMDV感染牛血清发生特异性反应.以纯化的3AB蛋白作为抗原,采用间接ELISA模式检测了部分FMDV感染动物血清和健康动物血清,证明表达蛋白与FMDV感染血清有很好的反应而与健康动物血清无反应.     

口蹄疫病毒3D蛋白在T4噬菌体衣壳表面的展示

本文通过PCR技术获得3D基因,使用拼接重叠延伸聚合酶链反应对3D基因内部的EcoRⅠ位点进行定点突变,将突变后的3D基因克隆至原核表达质粒pSOC和T4噬菌体的穿梭质粒pR中,通过PCR及质粒酶切鉴定,分别获得阳性重组子pSOC-3D和pR-3D。将含有3D基因的重组质粒pSOC-3D质粒转化大肠杆菌BL21进行表达,SDS-PAGE检测表达产物。将含有3D基因的重组质粒pR-3D转化T4噬菌体的宿主菌E2,通过同源重组获得重组噬菌体T4-3D,经SDS-PAGE及Western- blot检测,证明展示在T4噬菌体表面的3D融合蛋白能与FMDV感染血清发生特异性反应。     

烟草丛顶病毒(TBTV)ORF3和ORF4的原核表达、抗血清制备及应用

为制备烟草丛顶病毒(TBTV)ORF3和ORF4多克隆抗体,采用RT-PCR方法克隆了TBTV保山龙陵分离物(TBTV-BSLLi)的ORF3和ORF4,亚克隆至pMD18-T载体中,经测序正确后,将该基因插入原核表达载体pET28a(+)中,通过热击转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(plysS),以IPTG诱导6×His融合蛋白的表达,并经Ni2+亲和柱层析纯化,成功地克隆了TBTV的ORF3和ORF4,建立了其原核表达和表达产物的纯化体系,获得了高纯度的ORF3、ORF4蛋白.用纯化的蛋白免疫大白兔,获得高效价的特异性抗血清.DAS-ELISA检测结果表明,制备的抗血清可用于田间烟草(Nicotiana tabacumL.)样品及传播介体的检测.本研究为用血清学方法检测该病毒提供了基础条件.     

半滑舌鳎转化生长因子TGF-β1和TGF-β3基因的克隆及受哈维氏弧菌感染后表达分析

转化生长因子β (transforming growth factor β,TGF-β)是一类具有多种功能的蛋白超家族,在细胞免疫、细胞增殖分化和组织损伤的修复中起着关键性作用.本研究从半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)肝脏中克隆获得了TGF-β1和TGF-β3基因.推导的TGF-β1和TGF-β3氨基酸序列均含有多个N糖基化位点和一个TGF-β家族标签.系统进化树分析显示,半滑舌鳎TG F-β1和TGF-β3分别与鱼类的TGF-β1和TGF-β3亲缘关系最为密切.qRT-PCR结果表明,半滑舌鳎TGF-β1和TGF-β3基因在健康鱼的多个组织中均有表达,二者在皮肤中表达量最高,在肌肉中表达量最低.经哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)感染后,TGF-β1在肝脏、脾脏和肾脏中呈现先上升后下降的表达趋势,在感染48 h后的肝脏中表达量达到最大值,是对照组的3.17倍;TGF-β3在脾脏、肾脏和鳃中也呈现先上升后下降的表达趋势,在感染24 h后的鳃中表达量达到最大值,是对照组的4.71倍.以上结果提示,TG F-β1和TGF-β3可能在半滑舌鳎抵御细菌感染的免疫中发挥了重要作用,本研究为证明二者参与机体免疫调节提供了有力证据,为半滑舌鳎分子免疫研究提供了理论依据.     

11株鸡新城疫病毒强毒株的分子特性

选取2002～2007年从上海市分离鉴定的11株鸡新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）强毒株,克隆其融合蛋白（Fusion,F）基因片段,测序后登录GenBank,序列号分别为NDV 022433（EU258661）、022435（EU258662）、0210149（EU258653）、0210154（EU258654）、0210227（EU258656）、0210252（EU258658）、03024（EU258637）、04011（EU258639）、05013（EU258640）、07011（EU258642）和07023（EU258643）。序列分析结果显示：上述分离株的F基因扩增片段为1 654 bp,编码551个氨基酸,其核苷酸序列同源性为94.6%～100%,推导的F蛋白氨基酸序列同源性为93.0%～100%;各分离株F蛋白裂解位点序列均为112R-R-Q-K-R-F117,为基因Ⅶ型NDV强毒株。系统发育分析表明：这11株NDV分离株之间的遗传距离较近,而与传统疫苗株B1、La Sota、V4和F48E9的遗传距离较远。此外,这11株NDV强毒株均具有大多数鹅源NDV毒株特有的973和1 249 nt RsaⅠ位点。     

黄河河龙区间水沙变化的水文分析

黄河河龙区间总面积129654km~2,年均输入黄河泥沙量达9.08亿t,占全河沙量的57％。70年代特别是80年代以来,本区来水、来沙量呈现出明显减少趋势。采用不同系列对比分析法、双累积曲线分析法、降雨指标法等水文分析方法,分析区间内降雨、径流、输沙实测资料可知:70、80年代在河龙区间总减水量分别为21.36亿m~3、37.56亿m~3中,人类活动影响的约占80％,在减沙总量分别为2.86亿t、6.68亿t中,人类活动影响的约占50％左右,因降水减少而减少的水沙量分别占总减水、减沙量的20％和50％左右。     

黄河中上游地区半个世纪降水与温度变化分析

采用黄河流域中上游地区85个气象观测站点的逐月温度和降水数据(1956年1月-2006年12月),依据小波变换,对黄河流域中上游地区的气候因子进行不同时间尺度的分析.研究结果表明:黄河流域中上游地区51a的气温和降水变化存在随时间尺度而变化的规律,不同时间尺度的规律相瓦作用,共同构成黄河流域中上游地区气候变化特征.依据小波分析的结果,定性预测未来黄河流域中上游地区的将继续升温,降水略有增加.     

猪肺泡巨噬细胞感染PRRSV进程中差异表达基因及基因功能富集分析

猪呼吸和繁殖综合症病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）感染猪后会引起妊娠母猪严重繁殖障碍和仔猪呼吸困难及高死亡率,给养猪产业造成了巨大经济损失,因此挖掘PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞进程中差异表达的基因及机理有重要意义。本研究对来自GEO数据库的PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞sage表达谱数据GSE10346进行后续挖掘。先用sage软件处理,经sagemap注释得到上调已知基因49个,下调已知基因41个。利用AgBase网站上的GORetriever工具和GOSlim Viewer工具进行细胞组分（cellular component）、分子功能（molecular function）及参与的生物过程（biological process）分类后发现有4个基因与病毒的复制相关：其中IL8已有报道认为与抗PRRSV相关;TNF-α能够抑制PRRSV复制;PPIA可能与GP5蛋白胞外区中和决定簇与抗体发生作用的24位脯氨酸有关;ICAM-1在嗜中性粒细胞的产生中起关键作用,与病毒吸附相关。这4个基因与PRRSV的致病机制相关,可望用于抗PRRSV研究。进一步利用David在线工具进行基因功能富集分析后,发现几个免疫通路,如趋化因子通路,Toll-like受体信号通路和NOD-like受体信号通路具有检验显著性,这些免疫通路在PRRSV感染过程中起着一定作用,有望成为抗PRRSV的靶通路。     

牛BoLA-DRB3基因第2外显子多态性及其序列分析

BoLA-DRB3基因是牛主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex,MHC)基因家族中的Ⅱ类基因,它是该基因家族中最主要的功能基因,所编码的MHC抗原与免疫应答和抗病性密切相关。其第2外显子编码抗原的主要功能区。实验采用PCR-RFLP方法对鲁西牛、南阳牛和晋南牛3个群体的BoLA-DRB3基因第2外显子扩增产物进行多态性分析,检测到A、B和C3个等位基因,出现6种基因型。χ2适合性检验结果表明,鲁西牛和晋南牛在HaeⅢ酶切位点均达到了Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05),而南阳牛未达到Hardy-Weinberg平衡状态(P<0.01)。结合测序,结果显示在BoLA-DRB3基因第2外显子的第154、155、156和157位的碱基产生突变使得产生HaeⅢ酶切多态。序列比对后发现有13.70%的核苷酸发生突变,相对应有14.61%的氨基酸发生了替代。     

窟野河、孤山川、秃尾河 近期入黄泥沙及未来变化趋势分析

窟野河、孤山川、秃尾河三流域,是黄河中游多沙粗沙区的核心部分。三条河自1953年有观测资料以来,平均每年输入黄河的泥沙量为1.65亿t,其中粗沙量为0.89亿t。三条河各站1970年以来输沙量均为减少,其主要原因并非水土保持发挥了作用,而是由于降雨总量和降雨强度减少所致。神府煤田开发,至公元2000年平均每年将增加入黄泥沙量450万t。随着全球的增温,流域内的降雨量将会增加,植被的生境条件将得到改善,侵蚀产沙强度会随之减弱。但是,由于人口的增加,土地利用结构与垦殖指数都不会有明显的变化,所以流域的产沙不可能有大幅度的减少。     

黄河中游多沙粗沙区水沙分布及变化特征分析

黄河中游多沙粗沙区年均降水总量331.01亿m3,年均水资源量33.93亿m3,其中年均地表水资源量31.18亿m3,年均水资源模数为4.32万m3/km2,产水系数为0.10;多沙粗沙区年均降水量第三期治理区最大、第一期治理区最小,年均水资源模数和产水系数第一期治理区最大、第三期治理区最小;1956~2000年,多沙粗沙区各年代年均降水量和水资源总量总体呈递减趋势;多沙粗沙区全沙和粒径≥0.1mm的粗泥沙输沙模数、单位地表水资源全沙和粒径≥0.1mm的粗泥沙产沙量、单位降水粒径≥0.1mm的粗泥沙产沙量均是第一期治理区最大、第三期治理区最小。第一期治理区是当前向黄河输送粗泥沙的集中区域,应当首先作为黄河“治沙”工程的重点地区,尽快安排实施。