RAPD技术在苜蓿耐盐遗传育种中的应用

以中苜一号苜蓿和繁盐苜蓿大西洋为材料,应用RAPD技术,对14组280条随机引物进行筛选,结果表明:OPW三条引物、OPV三条引物、OPM四条引物、OPT五条引物、OPQ五条引物、OPZ三条引物、OPP三条引物、OPK三条引物、OPL一条引物、OPO七三条引物,共37条都呆作炎DNA多态性引物,为耐盐苜蓿的耐盐基因分子遗传标记的研究奠定了基础。     

利用SSR、ISSR和RAPD技术构建苜蓿基因组DNA指纹图谱

在建立可靠的苜蓿基因组DNA提取分离和PCR扩增技术体系的基础上,筛选具有稳定多态性位点的RAPD、SSR和ISSR引物,建立苜蓿基因组DNA的SSR、ISSR和RAPD分子标记技术体系,并利用分子标记检测苜蓿品种(系)的DNA分子标记多态性,构建苜蓿品种的DNA指纹图谱.筛选出36个RAPD引物,8个SSR引物和12个ISSR随机引物,通过PCR扩增在55个国内外苜蓿品种(系)中获得了182个RAPD多态性位点和丰富的SSR和ISSR多态性位点,构建了55个苜蓿品种(系)的SSR、ISSR和RAPD指纹图谱.结果表明,不同苜蓿品种(系)的SSR多态性有较大差异;苜蓿品种ISSR指纹图谱多态性丰富,稳定性比RAPD强;可以通过2～3个引物鉴别我国主要苜蓿品种和引进品种,SSR和ISSR指纹图谱可以更好地用于苜蓿品种鉴定和遗传多样性分析.     

结缕草属植物耐盐性SRAP分子标记研究

本研究应用混合集群分析法,通过建立结缕草属植物耐盐性两极端类型材料DNA池对400对SRAP引物组合进行筛选,得到111对多态性引物组合,再以日本结缕草耐盐两极端材料DNA对111对具有特异带的引物组合进行进一步筛选,从中获得22对多态性引物组合,最后用群体各单株对具有耐盐特异带的引物组合进行验证,获得了7个与结缕草属植物耐盐性紧密相关的SRAP分子标记,依据扩增条带的大小分别命名为:Me9-Em4₂₆₀、Me9-Em18₇₂₀、Me13-Em18₅₀₀、Me5-Em20₁₈₀、Me14-Em7₂₂₀、Me6-Em17₆₀₀、Me2-Em18₂₆₀,以上筛选得到的SRAP分子标记将为深入开展结缕草属植物分子标记辅助育种及耐盐基因克隆奠定基础。     

利用SSR和EST-SSR技术研究不同秋眠级苜蓿遗传多样性

用SSR和EST-SSR两种分子标记方法相结合,对25份不同秋眠等级苜蓿材料进行遗传多样性分析.结果表明:筛选出的7对SSR引物和10对EST-SSR引物经PCR扩增后获得175条多态性带,在此基础上构建了25份苜蓿材料的SSR和EST-SSR DNA指纹图谱;采用类平均法(UPGMA)Nei氏遗传距离进行聚类,将25份材料聚成4个复合组,表明供试苜蓿材料具有较高的异质性和较丰富的遗传背景.     

鸭疫里氏杆菌鸭源致病性大肠埃希氏菌和鸭沙门菌的RAPD研究

以4株不同血清型的鸭疫里氏杆菌、5株不同血清型的鸭源致病性大肠埃希氏菌和5株同一血清型的鸭沙门为研究对象，分别提取基因组DNA，利用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对其基因组DNA进行了分析。结果，从20条随机引物中筛选出了38条能在这3种菌中有较好多态性的随机引物，8个有效引物共扩增出了102个DNA片段，其中14个菌株共有的谱带仅有1条，显示多态性的片段有101个，占99．0％；对RA的4个菌株扩增出的谱带数为51条，共同片段有12条，多态性片段39条，占76．5％；对沙门菌的5个菌株扩增出的条带数为46条，共同片段为13条，多态性片段33条，占71．79／6；对大肠埃希氏菌的5个菌株扩增出的条带数为48条，共同片段4条，多态性片段44条，占91．7％。在8条引物中进一步筛选出1条引物G12，其图谱中535bp的条带为鸭疫里氏杆菌所特有，330bp的条带为沙门菌所特有，1227bp的条带为大肠埃希氏所特有，表明G12可作为分子标记用来鉴别这3种细菌。     

利用RAPD标记对不同秋眠级苜蓿种质的聚类和评价

利用RAPD标记对25份不同秋眠等级的苜蓿材料进行分析,构建了25份苜蓿材料的DNA指纹图谱,用两种方法(特异的谱带类型和不同引物谱带类型的组合)可以有效的鉴别苜蓿单株,说明RAPD标记是鉴定苜蓿的一种有效方法。通过计算25份苜蓿材料的遗传距离,进行聚类分析,探讨它们之间的亲缘关系。结果如下:25份苜蓿材料间的遗传距离介于4.69-8.14之间,说明材料间的遗传距离较大,亲缘关系较远,遗传基础较宽;从50条RAPD引物中筛选出19条引物,总共扩增出144条带,其中134条呈多态性,占93.05%,10条为单态性带,占6.94%;遗传距离为7.39时,试验材料可以分为差异明显的4类,苜蓿材料间有较大的遗传差异,这为苜蓿引种、亲本选配,分子标记辅助选择育种提供良好的理论基础和科学依据。     

抗褐斑病苜蓿RAPD多态性研究

运用RAPD技术,采用集群分离分析法对5个苜蓿品种进行抗褐斑病基因连锁的分子标记研究。结果表明,在160个随机引物中有107个有扩增产物,其中54个扩增出的产物的电泳图谱较稳定、清晰,再从中筛选出8个能够同时在3个以上苜蓿品种内的抗、感材料间显示多态性的随机引物,其RAPD标记的大小为600～1400bp。     

新品系Dy-2006苜蓿同工酶酶谱表征及与其它苜蓿品种的差异

对新品系Dy-2006、龙牧801、中苜1号和肇东苜蓿的酯酶(EST)、过氧化物酶(POD)酶谱表征进行了分析.酯酶分析共检测到9条酶带,新品系Dy-2006检测到4条酶带,2条特征谱带,其它3个苜蓿品种分别检测到6条、5条和4条酶带,特征谱带依次为1条、1条和0条;过氧化物酶分析共检测到13条酶带,Dy-2006共检测到6条酶带, 3条特征谱带,其余3个苜蓿品种检测到的酶带依次为7条、4条和4条,特征谱带均为 1条.新品系Dy-2006与其它3个苜蓿品种存在明显的遗传差异.     

苜蓿遗传多样性和亲缘关系的SSR和ISSR分析

在苜蓿(Medicago sativa L.)基因组SSR和ISSR分析的基础上,筛选出8对SSR引物和12个ISSR随机引物,通过PCR扩增在55个国内外苜蓿品种(品系)中获得126条多态性位点.利用SSR和ISSR标记对其DNA指纹图谱和遗传多样性进行研究.采用类平均法(UPGMA)Nei氏距离进行聚类分析,将55个苜蓿种质划分为4个大类群和7个类型,为苜蓿引种、亲本选配和种质资源评价提供依据.分子标记分析结果表明:我国苜蓿地方品种遗传基础广阔,在基因型表现特异性的同时又有较强的地域性;我国苜蓿育成品种间的遗传距离大,表现出遗传基础的异质性.     

30份苜蓿种质萌发期耐盐性评价

选用30份来源不同的紫花苜蓿种质为试验材料,采用不同浓度(0、100mM、150mM、200mM)的NaCl盐溶液对萌发期的种子进行胁迫处理,通过对胁迫后各材料相对发芽率、相对发芽势、相对芽长等指标的测定分析和隶属函数的综合排序,鉴定评价试验材料的耐盐性,为耐盐材料筛选和新品种选育提供依据。研究结果表明,紫花苜蓿种子发芽率、发芽势、芽长和根长随着盐浓度提高呈明显下降趋势,低浓度盐胁迫对种子萌发具有促进作用,胁迫强度增强则会抑制种子萌发。不同材料之间耐盐性差异较大,具体可划分为耐盐、中度耐盐和敏盐3个类型,其中中苜1号苜蓿耐盐性最强,陇东苜蓿耐盐性最弱。     

紫花苜蓿耐盐测序扩增区段标记条件优化

以中苜一号紫花苜蓿(Medicago sativa L.cv.Zhang mu No.1)为材料,对SCAR反应中的引物浓度、退火温度、Mg²⁺、dNTP浓度、模板DNA用量及Taq酶用量进行优化。结果表明:在3对SCAR中有2对引物出现目标扩增带,其中以SCAR1的效果最好;适宜反应体系总体积为25μL、Mg²⁺浓度2.5mM、dNTP浓度200μM、引物浓度0.5μM、Taq酶1.5U、模板DNA为50~100ng;优化后的反应体系能得到清晰稳定的SCAR扩增条带,可用于苜蓿耐盐性分子标记鉴定分析。     

中苜1号紫花苜蓿高效共生根瘤菌的筛选

研究8株根瘤菌对"中苜1号"紫花苜蓿(Medicago sativa L.cv.Zhongmu No.1)的接种效果。结果表明:8株根瘤菌接种效果差异明显;接种后干草重、根瘤数、干根重、粗蛋白质含量比对照分别增加了3.8%~26.12%、2.9%~41.43%、5.8%~41.38%和2.39%~8.5%;筛选出与中苜1号最佳共生匹配的根瘤菌ACCC17544,该菌株能增强其共生固氮效果,既提高干草产量,又增加粗蛋白质含量,具有一定的生产应用价值。     

不同抗虫性苜蓿根围土壤线虫群落研究

为探索不同抗虫性苜蓿品种根围土壤线虫群落的特征，本试验以线虫为生物指标，对‘草原2号’杂花苜蓿（Medicago varia Martin. ‘Caoyuan No.2’）和‘草原4号’紫花苜蓿（Medicago sativa L. ‘Caoyuan No.4’）根围土壤线虫群落特征进行了研究。结果表明：‘草原2号’感虫苜蓿根围土壤线虫种类及数量显著高于‘草原4号’抗虫苜蓿；‘草原4号’土壤线虫富集指数（Enrichment index，EI）显著高于‘草原2号’；‘草原4号’0~10 cm土层的土壤线虫区系位于土壤养分好且以细菌降解为主的A区，其它位于D区。综上所述，种植抗虫性不同的苜蓿品种会对其根围土壤线虫群落组成、数量及营养类群产生不同的影响。在建立人工苜蓿草地及土壤恢复过程中应优先选择抗虫性强的苜蓿‘草原4号’。     

苜蓿基因组DNA提取和RAPD反应条件优选

采用CTAB法、N2-SDS法、SDS法和改进的CTAB法,提取苜蓿基因组DNA,比较其分离效果.结果表明,改进的CTAB法为最佳提取法.对RAPD反应程序中的一些重要参数进行摸索和优化试验,建立适合苜蓿RAPD分析应用的体系组成为:反应液总体积25μL,14ng/μL模板DNA,2.5μL10x反应缓冲液,10碱基引物浓度0.1μmol/L,TaqDNA聚合酶1U,dNTP浓度0.3mmol/L,Mg²⁺浓度2.5mmol/L.PCR反应循环为:94℃4min,36℃30s,2℃1min;94℃30s,36℃30s,2℃1min,45个循环;2℃延伸10min.     

苜蓿抗寒性与根系抗氧化酶活性相关性分析

为探究不同苜蓿材料的抗寒性与低温胁迫下苜蓿根颈抗氧化酶活性变化的关系,本研究在科尔沁沙地种植黄花苜蓿(Medicago falcata L.)和4个紫花苜蓿(Medicago sativa L.)品种,越冬前挖取越冬器官并进行-10℃,-15℃,-20℃,-25℃,—30℃低温胁迫处理,以低温(4℃)贮藏为对照,测定苜...     

紫花苜蓿MsZIP基因超表达载体的构建及转基因苜蓿检测

根据已经克隆得到的MsZIP基因(GenBank序列号:HQ911778),扩增编码区cDNA,构建植物超表达载体PBI-MsZIP。酶切鉴定表明,目的基因已经正确的插入到载体中,超表达载体构建成功。采用CaCl₂冻融法将其转入农杆菌菌株中,然后采用农杆菌介导的方法,转化紫花苜蓿,共得到11株抗性苗,对其中的4株进行卡那霉素基因PCR检测,均得到了目的条带。同时对这4株抗性苗进行目的基因的RT-PCR检测,均得到了目的条带。说明MsZIP基因已经成功在苜蓿中超表达。为了进一步验证该基因的功能,分别用200 mmol/L NaCl和25 μmol/L PEG-6000处理转基因苜蓿,3 d后进行生理指标的测定。结果表明,MsZIP基因在苜蓿中超表达可以提高苜蓿的耐盐性和耐旱性。     

定西地区苜蓿根和根颈腐烂病病原研究

对定西九华沟两年生苜蓿根和根颈腐烂病的156个样品分离鉴定,幼苗接种致病性测定采用Booth的分类标准和系统,确认发生在甘肃中部干旱定西地区的苜蓿根和根颈腐烂病的优势病原菌为三种镰刀菌,即尖孢镰刀菌、锐顶镰刀菌和半裸镰刀菌,其中锐顶镰刀菌和半裸镰刀菌是中国苜蓿上的新记录。     

干旱和高温胁迫下紫花苜蓿PEPC酶活性变化及其基因序列分析

紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是一种分布极其广泛的多年生优质豆科牧草，分析干热胁迫下其磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC)酶活性变化及PEPC蛋白的生物信息学。本研究以‘阿尔冈金’紫花苜蓿和云南德钦县野生紫花苜蓿为材料，测定其在干旱胁迫和高温胁迫下的PEPC酶活性的变化，同时扩增了PEPC基因，并对PEPC蛋白进行了生物信息学分析和系统发育分析。结果表明，在胁迫第12 h酶活性达到峰值，两种胁迫下野生紫花苜蓿的酶活性基本高于‘阿尔冈金’紫花苜蓿，两种紫花苜蓿PEPC蛋白均为不稳定蛋白和亲水性蛋白。干旱胁迫与高温胁迫都对紫花苜蓿PEPC酶活性产生了较大的影响，且两种紫花苜蓿PEPC氨基酸序列保守性均较高。本研究可为提高高温和干旱条件下紫花苜蓿的光合特性进而增加产量提供理论依据。     

苜蓿品种鉴定及其遗传多样性分析

为快速有效地鉴定苜蓿属（Medicago）在内蒙古地区种植较广泛的10个品种,为后续研究奠定基础。本试验利用SRAP（Sequence Related Amplified Polymorphism）标记初步建立了10个苜蓿品种的指纹图谱,并分析了其中3个苜蓿品种的遗传多样性。试验结果表明,SRAP标记FR12,FR14,FR16,FR18,FR21引物组合在10个苜蓿品种中的多态性较好;利用SRAP标记FR6和FR21组合、FR21和FR17组合,制作出2套指纹图谱,均可有效鉴定出10个苜蓿品种。通过对‘呼伦贝尔’黄花苜蓿、‘草原3号’杂花苜蓿、‘敖汉’苜蓿的遗传多样性进行分析,得到这3个苜蓿品种的平均Nei's遗传多样性指数H和平均Shannon's信息指数I变化规律均一致,且不同产地和利用年限的2份‘草原3号’杂花苜蓿材料的遗传多样性指数达到显著差异（P<0.05）;表明杂花苜蓿的遗传变异程度较大,多样性水平较高。本研究构建了2套苜蓿指纹图谱,有利于从分子水平鉴定不同苜蓿种质资源,同时苜蓿3个种的遗传多样性变异分析可为合理利用苜蓿种质资源和推广应用提供理论参考价值。     

河北地区22个紫花苜蓿品种的生产性能比较研究

2013-2016年通过田间试验,在中国农业大学涿州教学实验场对22个紫花苜蓿品种的产量性能进行比较分析,以期筛选出适宜河北地区种植的苜蓿品种。结果表明,不同年份的苜蓿年干草产量具有极显著差异（P<0.01）;建植当年各苜蓿品种平均年产量最低,随着生长年限的延长,产量总体呈增加趋势;‘中苜5号’的4年总干草产量最高,‘SR4030’等6个品种的总产量低于对照品种‘中苜1号’,但与对照差异不显著;第1茬产量最高,随着茬次的增加产量呈下降趋势,第1茬与年产量之间的关联度最高;秋眠性3～6级的品种丰产性和产量稳定性综合评价较高。综合4年试验结果,‘中苜5号’、‘中苜1号’、‘SR4030’、‘巨能551’、‘BR4010’、‘MF4020’、‘SK3010’和‘WL363HQ’产草量高,具有潜在的推广价值,适宜在河北地区大面积推广应用。