猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a株核衣壳蛋白单克隆抗体的制备

本研究是利用我国PRRS病毒分离株CH-1a株浓缩的病毒抗原免疫BALB/c小鼠,经3次免疫后,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,同时以PRRS病毒作为抗原进行间接ELISA检测,共筛选到22个阳性细胞株.分别经过3轮单克隆后,最终得到了16株能稳定分泌抗体的单细胞克隆株.利用IDEXX-ELISA检测试剂盒和IFA试验对16株单克隆抗体进行鉴定,结果证实所获得的16株细胞分泌的抗体都是针对PRRSV的特异性抗体.将此16株单克隆抗体分别与用原核系统表达的PRRSV N蛋白、rtM和rtGP5蛋白进行特异性ELISA检测试验,结果表明16株单克隆抗体都仅识别表达的N蛋白,而与其它两种蛋白不发生反应,说明所获得的16株单克隆抗体均为抗PRRSV核衣壳蛋白的.单克隆抗体亚型鉴定试剂盒的鉴定结果显示,除01MAb为IgG2b、N1H11为IgG2a外,其余的单克隆抗体均为IgG1,而且所有单克隆抗体的轻链均为к链.至此证实我们获得了16株PRRV N蛋白单克隆抗体,这将为今后建立更为灵敏的检测PRRS病原的特异性诊断方法、分析PRRSV核衣壳蛋白的功能及鉴定B细胞抗原表位奠定重要基础.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备

试验通过RT-PCR法扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)核衣壳蛋白(N蛋白)基因并克隆到原核表达载体pet-30a中,转入到BL21感受态细胞,经IPTG诱导表达,使用SDS-PAGE和Western blotting分析表达产物的特性。利用Ni柱纯化该重组蛋白,采用NC膜皮下包埋法免疫Balb/C小鼠,取免疫后的脾细胞与SP2/0细胞进行融合后筛选杂交瘤细胞株,检测杂交瘤细胞株的特性并制备单克隆抗体。SDS-PAGE和Western blotting结果表明,该重组蛋白表达正确,约为20 ku,能被抗PRRSV的阳性血清特异性识别。超声后用Ni柱纯化,经SDS-PAGE分析可得单一的目的条带。NC膜皮下包埋法免疫效果良好,通过细胞融合、ELISA筛选获得3株能稳定分泌抗PRRSV N蛋白抗体的杂交瘤细胞株(H7、F7、C8),制备出高特异性的针对N蛋白的H7单抗。IFA与Western blotting结果显示制备的单抗可与病毒N蛋白产生特异性反应。亚型鉴定为IgG2b型,染色体分析证实杂交瘤细胞染色体数目正确。结果成功实现了N蛋白的原核表达,并获得高特异性的单克隆抗体,为PRRSV N蛋白抗原的检测奠定基础。     

抗PRRSV GP5蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以大肠埃希菌表达的与GST融合的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白为抗原,免疫Balb/c小鼠,经细胞融合、克隆后,获得1株能稳定分泌抗PRRSV GP5蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为52-C.52-C杂交瘤细胞染色体平均数为90条(86～96);经间接ELISA鉴定,单抗52-C为IgG2a亚型;腹水效价为100×27;与伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、圆环病毒(PCV)、猪瘟病毒(CSFV)和口蹄疫病毒(FMDV)无交叉反应;不能中和PRRSV.以表达的GP5不同突变体为抗原经间接ELISA和Western blot证实,单克隆抗体52-C针对的表位位于GP5蛋白的胞内区.     

抗犬瘟热病毒重组核衣壳蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以纯化的重组犬瘟热病毒(CDV)N蛋白免疫BALB/c小鼠,应用常规杂交瘤技术获得两株能稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞系,分别命名为A_4C_6C_(12)和A_5B_8H_7。间接ELISA检测腹水效价分别为1:10~6、1:10~5;亚类鉴定结果分别为IgG2a、IgG2b,轻链均为κ型;Western blot和ELISA分析结果显示2株单克隆抗体均能与重组N蛋白和CDV发生反应,而与犬细小病毒及犬腺病毒等无交叉反应;ELISA叠加试验的增值结果表明两株单克隆抗体识别的抗原位点不同。特异性抗CDV-rN的单克隆抗体的获得,为进一步用于临床诊断研究奠定了基础。     

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a株核衣壳蛋白重组鸡痘病毒的构建

从含有猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）核衣壳蛋白（N）的质粒扩增出N基因，构建禽痘病毒转移载体。该载体含有禽痘病毒早晚期启动子LP2EP2控制之下的PRRSVN基因、P11启动下的报告基因lacZ以及用于同源重组的禽痘病毒基因组的片段。在转移载体转染亲本病毒S—FPV-017感染的鸡胚成纤维细胞（CEF）之后，采用蓝色表型筛选的方法，筛选到表达N基因的重组病毒，并对其进行了6轮蚀斑纯化。PCR方法鉴定证明重组病毒的基因组中含有完整PRRSVN基因，间接免疫荧光试验证明了PRRSVN蛋白在重组病毒感染的CEF细胞中获得表达，本研究为猪繁殖与呼吸综合征非复制型疫苗的研制打下了基础。     

抗猪繁殖与呼吸系统综合征病毒重组N蛋白单克隆抗体的制备

为了研究制备抗猪繁殖和呼吸系统综合征病毒重组核衣壳蛋白(N蛋白)单克隆抗体,试验用N蛋白免疫Balb/c小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA筛选等技术制备单克隆抗体。结果表明:所制备的单克隆抗体3B5为IgG2a亚类,杂交瘤细胞培养上清液及小鼠腹水单克隆抗体的ELISA效价分别为1∶800和1∶32 000,连续培养20代后能稳定分泌抗体。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白与糖蛋白的表达纯化及鉴定

In order to gain nucleocapsid protein （N） and glycoprotein （E） of porcine reproductive and respiratory syndrome virus （PRRSV）, the total RNA was extracted,ORF7 and ORF5 genes were obtained by RT-PCR, inserted into pET-28a(+) vector, and then transformed into Escherichia coli BL21（DE3）,respectively. The expressed products were identified by SDS-PAGE and Western blotting, and purified by affinity chromatography. The results showed that N and E fusion protein were successfully expressed and the proteins had good reactionogenicities by Western blotting analysis. The purities of the purified proteins were 89% and 90%, respectively. This study could lay foundations for molecular biological function research and establishment of test methods for detection antibodies of PRRSV.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒SX-1株N蛋白单克隆抗体的制备

用纯化的重组HIS标签N蛋白免疫BALB／c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗PRRSVN蛋白的单克隆抗体（McAb）,经细胞融合获得5株可分泌特异性McAb的抗PRRSVN蛋白的杂交瘤细胞1A12,3F11,5A3,5F9,4E4。其中1A12,3F11,5A3,4E4杂交瘤上清与HIS-蛋白与GST—N蛋白两种抗原包被的ELIA反应均为阳性。5F9与HIS—N蛋白包被的ELISA反应为阳性,而与GST—N蛋白包被的ELISA反应呈阴性。单抗1A12,3F11,4E4,5A3与HIS-N与GST—N蛋白的Western blotting反应均为阳性,而5F9只与HIS-N反应。IFA检测显示1A12,3F11,5A3,4E4株单抗都有明显的荧光,说明其与PRRSV呈阳性反应。同时,ELISA检测又有很好的特异性。     

PRRS病毒核衣壳蛋白在大肠杆菌中的高效表达

用表达非融合蛋白的原核表达载体pBV220，通过PCR技术的引物设计对猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）病毒BJ-4株核衣壳蛋白（N）基因起始密码子上游进行了改造和修饰，成功地构建了含有PRRS病毒N基因的原核重组表达载体pBV-N。pBV-N转化大肠杆菌DH5α，温度诱导后菌体裂解物经SDS-PAGE分析发现，在约15000处出现1条诱导前后的pBV220载体对照和诱导前的pBV-N中均缺少的特异性的蛋白条带，分子量大小与PRRS病毒N蛋白相符，并随着诱导时间的延长而变化，在诱导后4h达到高峰。薄层扫描结果显示，重组N蛋白表达量最多可占菌体总蛋白的27.4%。Western-blotting检测，此15000的蛋白带可为PRRS病毒N蛋白的单克隆抗体所识别，表明该重组N蛋白具有良好的抗原性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白单克隆抗体的制备及生物学特性分析

分别用纯化的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和纯化的重组N蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗PRRSV N蛋白的单克隆抗体(McAb)。用纯化的PRRSV免疫小鼠,经细胞融合获得2株可分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为4B8、4D8。用重组N蛋白免疫的小鼠,经细胞融合获得3株可分泌特异性McAb的抗PRRSV N蛋白的杂交瘤细胞2F3、4D5、5D11。间接ELISA检测4D8、4B8、4D5和5D11杂交瘤上清效价为1∶32~1∶512,而2F3的腹水效价为1∶12 800。单抗2F3、4B8和4D8与纯化病毒的Western blotting反应都为阳性,而4D5和5D11为阴性。IFA检测结果5株单抗都有明显的荧光,与PRRSV呈阳性反应。2F3的Ig亚型为IgM。5株单抗杂交瘤细胞连续传代至20代,分泌相应McAb的效价基本一致。本研究为PRRSV生物学诊断和方法研究提供有用工具。     

牛副流感病毒3型NP单抗的制备及初步应用

为制备牛副流感病毒3型(BPIV3)核衣壳蛋白(NP)单克隆抗体(MAb),本研究利用原核表达并纯化的重组NP (rNP)免疫BALB/c小鼠,取免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合.采用以BPIV3为检测抗原的间接ELISA方法筛选阳性细胞克隆,经3次克隆纯化后获得1株稳定分泌抗NP特异性MAb的杂交瘤细胞株(5E5)并制备腹水,采用rNP及BPIV3包被的ELISA效价分别是2×106和1.28×105.间接ELISA、western blot、IFA试验表明该MAb具有良好的反应性和特异性.经抗体亚类鉴定该MAb亚类为IgGl/κ.特异性试验表明该MAb不与牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒反应.免疫组化试验表明该MAb可以检测BPIV3感染动物体内的病原.该MAb还可用于建立检测BPIV3病原及抗体的诊断方法,同时为研究NP的结构和功能提供了条件.     

猪繁殖与呼吸道综合征病毒(PRRSV)单克隆抗体的研制

利用猪繁殖与呼吸道综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）国内分离株Ｊ１,采用反复差速离心法制备免疫抗原,长程免疫法免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,用间接ＥＬＩＳＡ方法检测抗体,通过细胞融合技术,并经３次亚克隆获得了１０株能稳定分泌抗ＰＲＲＳＶ单抗的杂交瘤细胞单克隆株（Ａ１Ｄ７Ｈ１０,Ａ１Ｄ７Ｈ１１,Ａ１Ｅ７Ｈ９,Ａ１Ｅ７Ｄ９,Ａ２Ｄ８Ｅ７,Ａ２Ｄ８Ｂ１１,Ｂ３Ｄ１１Ｄ６,Ｂ２Ｇ９Ａ９,Ｂ２Ｇ９Ｆ２）。这些细胞经体外连续传     

Development and characterization of stable cell lines constitutively expressing the porcine reproductive and respiratory syndrome virus nucleocapsid protein

Despite global efforts to control porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) infection, the virus continues to cause economic problems in the swine industry worldwide. In this study, we attempted to generate and characterize a panel of stable BHK cell lines that constitutively express the nucleocapsid (N) protein of type 1 or type 2 PRRSV. The established BHK cell lines were found to react well with N-specific antibodies as well as the hyperimmune serum of pigs raised against each genotype of PRRSV. Taken together, the data implicate a potential usefulness for the newly generated stable cell lines as a diagnostic reagent for PRRSV serology.     

猪流行性腹泻病毒M蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗M蛋白单克隆抗体(MAb),本研究以截短表达的His-M重组蛋白免疫BALB/c小鼠;以截短表达的GST-M重组蛋白作为包被抗原,采用常规的淋巴细胞杂交瘤技术制备杂交瘤细胞,通过间接ELISA进行筛选,得到一株稳定分泌抗M蛋白MAb.MAb亚类鉴定为IgG2b型,轻链为к链,杂交瘤细胞培养上清和诱导的小鼠腹水抗体效价分别为1:3000和1:2×105.Western blot试验表明该MAb能够识别重组及天然的PEDV M蛋白.间接免疫荧光试验表明该MAb能够与PEDV感染的Vero E6细胞产生特异性免疫荧光.     

尼帕病毒和亨得拉病毒核蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

尼帕病毒（Nipahvirus，NiV）和亨得拉病毒（Hendravirus，HeV）是近年来出现的2种新的高致病性副粘病毒，在我国尚未发现。为防范2种病毒在我国的出现，本研究开展了前瞻性工作，成功研制了针对2种病毒核蛋白（N）的单克隆抗体，可用于病毒监测与诊断。首先利用大肠杆菌表达的2种病毒N蛋白免疫BALB／c小鼠，细胞融合后应用间接免疫荧光的方法对杂交瘤细胞克隆进行筛选，获得了5株N蛋白特异单抗。单抗腹水的抗体效价均超过2×10^5，培养上清抗体效价1：64～1：256。Western—blot和间接免疫荧光试验证明，5株单抗均特异针对N蛋白，其中1株（H4D11）只与HeVN蛋白反应，而不与NiVN蛋白反应，表明它具有鉴别2种病毒的能力。所研制的单抗对建立2种病毒的检测技术，用于动物监测，以防范2种新发传染病在我国流行具有重要意义。