坏死梭杆菌研究进展

坏死梭杆菌(Fusobacterium necrophorum,Fn)是一种严格厌氧的革兰阴性多形态杆菌,其致病因子包括内毒素、白细胞毒素、血小板凝集因子、血凝素和溶血素等,其中主要的致病因子是白细胞毒素。由坏死梭杆菌引起的疾病在不同国家和地区均有发生,鹿、羊等反刍动物感染坏死梭杆菌时表现为跛行,关节肿大,肝脓肿和腐蹄病,猪、马等动物感染坏死梭杆菌时主要表现为跛行,严重时继发其他细菌感染,对养殖业造成巨大损失;人类感染该细菌时表现为急性咽炎综合征(Lemierres syndrome)。论文通过对国内外坏死梭杆菌及其疫苗研究和新型佐剂的开发进行综述,以期为该细菌疫苗的研制提供参考。     

坏死梭杆菌检测方法研究进展

坏死梭杆菌是一种严格厌氧的革兰阴性(G-)杆菌,可以依据坏死梭杆菌的菌体形态、菌落特征、生化试验、耐药性试验、酶特性试验等进行检测。根据坏死梭杆菌的16 S rRNA基因序列、16 S～23 SrRNA基因间序列以及rpoB基因序列,可以对其进行菌种水平上的鉴定;根据坏死梭杆菌的gyrB基因序列和白细胞毒素操纵子启动子区序列,可以对坏死梭杆菌进行亚种水平的鉴别。环介导的等温扩增(LAMP)技术的发展也为坏死杆菌病的快速诊断提供了检测方法。     

坏死梭杆菌病免疫学研究进展

长期以来,国内外研究人员一直致力于坏死梭杆菌的免疫性及免疫作用研究,但进展缓慢,主要原因是坏死梭杆菌免疫作用弱,无法产生保护性免疫。直到20世纪80年代末,对坏死梭杆菌免疫研究才有了新的突破,初步研制出坏死梭杆菌疫苗,并经小群动物试验获得成功。文章就坏死梭杆菌免疫性及免疫作用的初始研究、坏死梭杆菌免疫原筛选研究、抗原间的相互作用、疫苗研究进展进行了综述,并展望了坏死梭杆菌疫苗研究的发展趋势。     

致病性鹿源坏死梭杆菌分离鉴定

应用厌氧培养技术,从患坏死杆菌病鹿的病变坏死组织和脓汁中仞出一种主要的病原菌,通过细菌形态学、染色反应、培养特性、生化试验、血清学反应等鉴定方法,确定该病原分离株为严格厌氧性坏死棱杆菌,分型鉴定为Ａ、ＡＢ和Ｂ型;实验动物感染证明Ａ和ＡＢ型坏死梭杆菌为致病性菌株。     

坏死梭杆菌白细胞毒素研究进展

坏死梭杆菌是动物和人的各种坏死化脓感染的条件性致病菌.坏死梭杆菌的白细胞毒素是一种高度不稳定性分泌蛋白,被认为是主要的毒力因子.坏死梭杆菌白细胞毒素基因的开放阅读框(lktAORF)包括9 726 bp,编码3 241个氨基酸,总分子质量为336 ku的蛋白,且与其他细菌的细胞毒素没有任何相似的序列.覆盖在整个坏死梭杆菌lktA ORF上的5个短的重叠的多肽分别是BSBSE,SX,GAS,SH和FINAL,将它们在大肠埃希菌中表达,所有的多肽都有免疫原性,但GAS引起最小的抗体反应,BSBSE和SH对坏死梭杆菌攻击诱导产生了很强的保护力,比坏死梭杆菌的培养上清内全长活性lkt或无活性上清的保护性要好得多.     

犬化学性趾(指)炎的治疗

犬趾(指)接触到有刺激性或腐蚀性的酸、碱或其他化学物,引起趾(指)红肿、发热、疼痛,进而有炎性渗出液,严重时感染造成溃疡,影响犬的正常行走功能.现举2例如下.     

犬急性坏死杆菌病的诊断

1999年11月13日,我院收治一发病急、趾部发炎并坏死、急性败血死亡病例,后经我院剖检、镜检、培养、鉴定,确诊为犬急性坏死杆菌病,现报告于后,供同行探讨。1　发病情况及症状　重庆市近郊沙坪坝区居民张××,家养狼犬11月龄,已注射犬五联疫苗(吉林军马研究所研制的犬瘟热、狂犬病、细小病毒病、传染性肝炎、副流感五联疫苗)。在有效期内,于1999年11月11日发现吃食减少,两后肢不能站立,能自己拖动,清水冲洗后,各有1～2个血泡,外涂四环素软膏,于11月13日下午,血泡破溃,流出多量污血,恶臭,两后肢已不能自行拖动,抬来我院诊治。临床检查:体温39.…     

PCR法诊断奶牛腐蹄病坏死梭杆菌的研究与应用

试验根据坏死梭杆菌白细胞毒素基因序列的特异性,设计1对引物FLP并建立了PCR检测方法.试验结果表明,引物FLP具有相对较高的特异性和敏感性,其敏感性达到了48.5pg.对现地采集奶牛蹄部病料进行PCR检测,发现引物FLP具有很好的特异性,能够准确诊断出坏死梭杆菌的存在.     

山羊坏死杆菌病的诊治

坏死杆菌病是由坏死梭杆菌引起的可侵害家畜、家禽和野生动物的一种传染病,多为慢性经过、常呈散发或地方流行.在山羊,坏死杆菌病临床上表现有腐蹄病、坏死性皮炎、坏死性肝炎、坏死性口炎(白喉)、坏死性乳房炎等多种病型.笔者在临床上见到的山羊坏死杆菌病主要以坏死性口炎为特征,现报道如下.     

牛源坏死梭杆菌43K外膜蛋白的黏附特性研究

旨在明确牛源坏死梭杆菌43K OMP的黏附特性。将43K OMP基因克隆连接至pET-32a载体,转化入大肠杆菌BL21 DE3中,通过IPTG诱导进行原核表达,应用黏附试验、天然蛋白竞争试验、抗体抑制试验和蛋白酶水解试验,明确牛源坏死梭杆菌43K OMP的黏附性,同时将纯化的重组蛋白和提取的天然43K OMP与牛子宫内膜细胞和牛乳腺上皮细胞共孵育,观察43K OMP对细胞的黏附作用。结果显示：43K OMP基因克隆到pET-32a载体中,随后在大肠杆菌BL21 DE3以包涵体形式成功表达;携带重组质粒(H2019)的大肠杆菌经IPTG诱导后,与空载体对照相比,与宿主细胞的结合显著增强(P<0.05);天然43K OMP与细胞共孵育后,黏附细胞的细菌数量显著降低(P<0.05);H2019与43K OMP多抗或单抗预孵育后,显著降低黏附宿主细胞的细菌数量(P<0.05);经不同浓度蛋白酶K处理H2019后,黏附细胞的细菌数量显著降低(P<0.05),且与蛋白酶K浓度呈现剂量依赖关系。同时,43K OMP天然蛋白和重组蛋白能黏附于牛子宫内膜细胞和乳腺上皮细胞表面。...     

犬急性坏死杆菌病的诊断

犬坏死杆菌病 ,在兽医临床是以足趾和皮肤炎症、坏死为特征的传染病。牛羊常见 ,极少发生于犬。2 0 0 1年 ,收治了6例发病急、趾部发炎、坏死、急性败血死亡病犬。经解剖、镜检、培养、鉴定 ,确诊为犬急性坏死杆菌病 ,现报告于下 ,供同行探讨。1　发病情况居民李某 ,家栓养 11月龄狼犬 ,无创伤史 ,已注射犬五联茵 (吉林军马研究所制的犬瘟热、狂犬病、细小病毒病、传染性肝炎、副流感五联疫苗 )在有效期内 ,发现减食 ,不能站立 ,能自行拖动 ,经清水冲洗 ,见两后肢有 2个血泡 ,外涂四环素软膏。血泡破溃 ,流出多量污血 ,恶臭 ,两后肢已不能自…     

坏死梭杆菌白细胞毒素研究进展

坏死梭杆菌白细胞毒素(Lkt)是一组对反刍动物白细胞特别是多形性白细胞(PMNs)有特异性毒性作用的细胞外毒素,被认为是坏死梭杆菌感染动物的主要毒力因子。白细胞毒素的物理稳定性较低,高温或极端pH环境中都能使白细胞毒素活性丧失。研究发现,白细胞毒素开放阅读框(ORF)全长9 726bp,由3个基因(lktB、A和C)组成,结构基因是第2个基因(lktA)。白细胞毒素对白细胞的毒性作用有剂量依赖性,并且溶血活性较低,不能在豚鼠猪皮肤上形成皮肤坏死症状。     

坏死梭杆菌白细胞毒素基因的BSBSE片段的原核表达及抗血清制备

本研究以国内分离的牛源坏死梭杆菌F4基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增BSBSE片段,克隆到pMD18-T载体上,鉴定并测序正确后,构建pET32a-BSBSE表达质粒,转化E．coli BL21（DE3）经IPTG诱导、SDS—PAGE检测重组蛋白表达、Western blot检测重组蛋白反应原性。以该重组蛋白免疫兔制备抗血清,经间接ELISA检测抗血清效价。结果表明,PCR扩增得到1100bp的BSBSE片段,以此片段构建了pET32a—BSBSE表达质粒,经诱导后获得了目的蛋白表达,以Western blot检测该重组蛋白证明为本研究的目的蛋白,并且与抗体具有反应原性。以间接ELISA检测该重组蛋白免疫兔制备的抗血清效价达10^5。研究结果将为坏死梭杆菌毒力因子（1kt）的深入研究奠定了物质基础。     

坏死梭杆菌致家兔肝脓肿模型的建立

采用梅花鹿源坏死梭杆菌HNFnf分离株以不同浓度菌量于家兔耳缘静脉注射,尝试建立家兔感染坏死梭杆菌肝脓肿模型。通过观察家兔临床症状、剖检病变和病理组织学观察,建立了坏死梭杆菌分离株家兔感染模型。攻毒家兔7 d内全部死亡,死亡前家兔表现为采食减少、喜卧、后肢无力、消瘦等。尸体进行病理剖检可见明显病理变化,肺脏表面大量出血,且伴有结节样病变;肝脏质地较软,出现均匀的灰黄脓肿;脾脏严重肿大,呈暗紫色;肾脏多处出血斑;严重的肠道胀气,膀胱积尿。病理组织学观察可见肾脏近曲小管与远曲小管之间有少量的粉红色纤维素渗出;肝脏中形成明显的染色深蓝的脓肿结构,其周围有大量细胞核深染的炎性细胞浸润,肝脏肝小叶固有结构消失,肝细胞脂肪变性;肺泡和支气管内有大量红染的纤维素渗出。采取耳缘静脉攻毒方式,该细菌对家兔的最低致死量为1.2×10¹⁴ CFU。     

影响坏死梭杆菌分泌白细胞毒素因素的研究

利用已分离坏死梭杆菌菌株,建立坏死梭杆菌白细胞毒素活性体外检测方法,并评价培养条件对坏死梭杆菌天然白细胞毒素活性的影响。结果表明,预还原、厌氧无菌心脑浸液肉汤培养基(pH7.3左右)、培养时间10h～12h(对数生长期后期),此工艺参数下获取的细菌培养物上清液的白细胞毒性最大。获得的坏死梭杆菌天然白细胞毒素经Western blot证实,能被抗白细胞毒素重组BSBSE蛋白的兔血清识别,表明提取的白细胞毒素具有反应原性。     

坏死梭杆菌外膜蛋白提取及免疫原性分析

从坏死梭杆菌(Fusobacterium necrophorum,FN)中提取外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)并分析免疫原性。采用无菌心脑浸液(BHI)肉汤培养基培养坏死梭杆菌,用20mmol/L HEPEs-LiCl缓冲液提取外膜蛋白,经SDS-PAGE、Western blot和接种小鼠病理学检测分析表明,具有唯一条带,分子质量为44.5ku,具有良好的免疫活性并有一定毒性,研究结果为坏死梭杆菌亚单位疫苗研制奠定了基础。     

坏死梭杆菌外膜蛋白基因的克隆与表达

依据GenBank中登录的坏死梭杆菌外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)基因序列,设计1对引物进行PCR扩增OMP片段并克隆至pET-28a中,构建原核表达重组质粒pET-28a-OMP。将pET-28a-OMP转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态中,表达含2个His的重组蛋白。SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,该重组蛋白分子质量为93 ku,为包涵体表达,具有反应原性。本试验结果为坏死梭杆菌OMP免疫机制的研究提供了基础数据。     

坏死梭杆菌FN(A)p2001株小鼠感染模型的建立

将鹿源坏死梭杆菌FN(A)p2001分离株以3×108、3×107、3×106、3×105、3×104、3×103个/只等不同菌量,分别接种于6组小鼠,每组10只,逐日观察小鼠感染情况.结果表明,3×106、3×107、3×108个/只菌量感染组小鼠,在接种后3 d～8 d先后死亡,5 d后死亡小鼠的病理变化明显,并从死亡小鼠内脏及脓汁中均检到长丝状及小杆状等多形态典型的坏死梭杆菌;3×104个/只和3×105个/只菌量感染仅表现体重减轻,3×103个/只菌量感染无明显临床表现.由此表明,坏死梭杆菌FN(A)P2001分离株具有很强的感染毒力;对小鼠的最小致死量为106个/只菌量;腹腔接种是适宜的感染途径.从而建立了坏死梭杆菌分离株小鼠感染模型.     

鹿源坏死梭杆菌毒力菌株FN(AB)94抗原的免疫原性

将坏死梭杆菌分离株 FN(AB) 94厌氧培养后 ,裂解制备抗原 ,在抗原悬液中加入等量福氏完全佐剂 ,配制成乳化抗原 ,以此分别接种 3组 9只家兔 ,并设立对照组。初次免疫后 7d进行第 2次免疫 ,每隔 1周采血 ,检测免疫兔血清中抗体滴度 ,2 8d后免疫兔分别用 2 m L 的 10 8个菌 /m L(2个 ML D)坏死梭杆菌分离株 FN(AB) 94感染 ,3只对照家兔同时感染相同剂量 ;逐日观察攻毒家兔的变化。结果 ,3只对照家兔于感染后的 12～ 2 1d死亡 ;而 9只免疫兔完全能抵抗毒力菌株的感染 ,6个月后仍存活。试验表明 ,坏死梭杆菌分离株 FN(AB) 94裂解抗原加佐剂后 ,具有良好的免疫原性。     

饲喂太乐菌素肉牛坏死梭状杆菌分离菌株药敏试验

来自肉牛肝囊肿的２４株坏死梭状杆菌的抗生素敏感性由微量稀释法最低抑菌浓度（ＭＩＣ）所决定，全部分离菌株均抵抗杆菌肽，庆大霉素，卡那霉素，莫能菌素，新霉素和链霉素，饲喂太乐菌素和未饲喂太乐菌素肉牛的坏死俊杆菌的分离物的平均ＭＩＣ值（μｇ／ｍｌ）分别为：氨苄青霉素（４．２７，４．０８），氯霉素（２１．５８，２０．５２），金霉素（０．８９，０．７０），克林霉素（０．２５，０．０９），红霉素（６．０５，５