Bacillus paralicheniformis左聚糖蔗糖酶基因克隆表达及酶学性质研究

[目的]从耐热菌株中克隆表达左聚糖蔗糖酶基因,以获得热稳定性较好、底物耐受性高的重组酶,为左聚糖蔗糖酶催化机理及生产应用研究提供技术基础.[方法]从市售菌肥中筛选耐热菌株并克隆其左聚糖蔗糖酶基因,以pSE380为载体构建重组质粒并转化至大肠杆菌诱导表达,随后通过镍亲和层析获得电泳纯的重组左聚糖蔗糖酶并研究其酶学性质.[结果]分离到耐热菌株LN-05,经16S rDNA序列分析鉴定为Bacillus paralicheniformis.克隆表达的B.paralicheniformis左聚糖蔗糖酶与已公布地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)RN-01的左聚糖蔗糖酶存在19个氨基酸残基差异.重组酶催化水解反应最适pH为6.0,最适温度为45℃,于40和45℃保温3 h后残余酶活力分别为89%和78%.Mn2+、Ag3+和Cr2+对重组左聚糖蔗糖酶的水解活力有明显抑制作用,Co2+和Al3+对水解活力具有一定促进效果;Ba2+、Mg2+和Mn2+对聚合活力有明显抑制作用,Ag3+、Cu2+和K+对聚合活力具有促进作用.EDTA对重组酶水解活力和聚合活力均具有抑制作用.在最适条件下,重组左聚糖蔗糖酶的最大反应速率(Vmax)=74μmol/(min·mg),米氏常数(Km)为7.57 mmol/L.催化聚合反应的最适温度随着底物蔗糖浓度而变化,当蔗糖浓度为50%时,最适温度为40℃;最适聚合反应pH为5.0;当酶浓度为0.9 U/mL,在最适条件下反应24 h,左聚糖产糖量达183.00±1.73 g/L,蔗糖转化率为(36.76±1.84)%.[结论]B.paralicheniformis左聚糖蔗糖酶的热稳定性较好,左聚糖产量高,具有转化蔗糖生产高附加值左聚糖的应用潜力.     

嗜热木聚糖酶酶学性质研究

[目的]研究嗜热木聚糖酶的酶学性质.[方法]考察了基因工程菌Rosetta(DE3)/pET28a-xynB64所产嗜热木聚糖酶反应的最适温度、最适pH,嗜热木聚糖酶的热稳定性、pH稳定性,以及不同金属离子对酶活力的影响.[结果]嗜热木聚糖酶的最适反应温度为110℃左右,最适pH为6.6,具有较广的pH稳定范围和非常好的热稳定性,高浓度的Mn2+、Mg2+、Ca2+对该酶有激活作用,Cu2+、Zn2+以及低浓度的Mn2+对该酶有抑制作用.[结论]研究可为嗜热木聚糖酶的广泛应用提供参考依据.     

普鲁兰酶的反向合成特性

对普鲁兰酶催化反向合成反应的底物特异性进行了研究.研究结果表明,麦芽糖是普鲁兰酶催化反向合成反应的最小底物.以麦芽糖为底物分子,研究了普鲁兰酶的反向合成特性,结果表明,普鲁兰酶催化反向合成反应的最适pH值为4.5,反向合成活性在pH值4.0 ～6.0范围内稳定;普鲁兰酶催化反向合成反应的最适温度为65℃,反向合成活性在60～ 70℃范围内较高;Na+、K+、Li+和Co2+对普鲁兰酶反向合成活力的影响不大,Hg2+、Sn2+、Cu2+、Ag+和pb2+对普鲁兰酶反向活力有较强的抑制作用,Ca2+、Mn2+对反向活力有较为明显的激活作用,Ca2+可以提高热稳定性.     

水生栖热菌FL-03海藻糖合酶的分离纯化及特性研究

将从水生栖热菌FL-03中获得的海藻糖合酶粗酶液经硫酸铵分级沉淀、DEAE Sepharose CL-6B离子交换层析S、ephacryl S-200HR凝胶过滤层析后,纯化68.48倍,产率为18.4%。研究表明:该酶分子量约为101 kD,最适反应温度为60℃,最适pH为7.0,在40~80℃、pH 6.0~9.0范围内具有较高的反应活性和稳定性。Fe3 对该酶具有一定的激活作用,Cu2 、Tris、Zn2 对该酶具有较强的抑制作用。该酶具有高度的底物特异性,只能专一地将麦芽糖转化为海藻糖。在40℃4、8 h条件下,麦芽糖转化为海藻糖的转化率最大可达到79%。     

高温海藻糖合酶释放处理条件及其酶学性质的研究

[目的]对从Bacillus sp.SN02004-01菌所产高温海藻糖合酶产酶特性进行研究。[方法]通过试验研究了菌株细胞的破壁处理工艺及所得细胞海藻糖合酶性质。[结果]以2%甲苯＋0.2%EDTA为破壁试剂,菌体浓度0.05g/ml,温度为35℃,150r/min处理3.0h为最佳处理条件;该细胞酶最适反应pH值7.0,最适反应温度为60℃;Cu2＋、Zn2＋对该酶有抑制作用。[结论]在最佳处理条件下获得最高酶活为54.05u/ml,提高了2倍,说明该酶具有很好的生物反应特性。     

白腐真菌产木质素降解酶的条件及酶学性质的研究

本研究以酶活力为评价指标,通过产酶条件的优化,选择出白腐真菌的最适培养条件,并对其部分酶作用特性进行了研究。试验结果表明:白腐真菌产锰过氧化物酶的最适培养条件是:最佳碳源是麸皮,葡萄糖(碳源)对酶活力影响不大;最佳氮源是牛肉膏;最佳培养时间是96 h。该菌产漆酶的最适培养条件是:最佳碳源是麸皮;最佳氮源是牛肉膏;最佳培养时间是96 h。锰过氧化物酶的最适pH范围是4.4～4.8,最适底物浓度是1.2 mmol/L,最适反应温度是35～40℃;漆酶的最适pH为4.8,最适底物浓度是1.2 mmol/L,最适反应温度是40℃。金属离子Cu2+,Co2+对锰过氧化物酶和漆酶有激活作用,Fe2+对两种酶活力有一定的抑制作用,而Ag+则完全抑制漆酶的活性,Mg2+对两种酶活力影响不大。     

理性设计和定点突变对提高海藻糖合酶TreSI热稳定性的影响

[目的]来源于黏细菌Myxococcus sp.V11的海藻糖合酶(trehalose synthase, EC 5.4.99.16)TreSI可通过转糖苷作用将麦芽糖转化成为海藻糖，在酶法生产海藻糖上有很高的应用前景，其热稳定性是制约该酶工业应用的关键。本文旨在通过定点突变对TreSI相关氨基酸残基进行改造，以期获得热稳定性强的突变子，提高其应用潜力。[方法]使用在线预测软件PoPMuSiC-2.1对TreSI每个氨基酸突变后的去折叠自由能变化(ΔΔG)进行初步预测，以SDM(site directed mutator)和mCSM(mutation cutoff scanning matrix)以及两者联合(Duet)进行预测。用重叠延伸PCR法构建11个海藻糖合酶突变体，经大肠杆菌表达和蛋白纯化后，对其酶学特性进行表征。[结果]成功筛选到2个热稳定性提高的突变子。突变子R149L、N193E的比酶活与野生型无显著差异，且最适pH值和最适反应温度也未发生改变；R149L、N193E在50℃处理1 h的残余酶活性为野生型的1.37和2.50倍；在60℃处理1 h的残余酶活性为野生型的2...     

海藻酸钙固定麦芽寡糖基海藻糖合酶的研究

比较麦芽寡糖基海藻糖合酶(MTSase)与其固定化酶的最适反应pH值、pH稳定性、最适反应温度和热稳定性。结果表明,固定化酶的最适反应pH值(5.5)较原酶(6.0)低,最适反应温度(65℃)较原酶(60℃)高,pH稳定性和热稳定性均较原酶高。     

糙皮侧耳P5漆酶酶学性质的初步研究

对糙皮侧耳P5漆酶的酶学性质进行了研究.结果表明,该酶的最适反应温度为63℃,最适反应pH为6.0;该酶的酸碱稳定性和温度稳定性较好,在pH5.0～6.5条件下处理24h可保留97％以上的酶活,4～20℃处理1h酶活保持不变,60℃处理1h可保留80％以上的酶活;金属离子对漆酶酶活有明显的影响,Cu2+、Mn2+、Zn2+对酶的活性有促进作用,Ca2+、Fe2+、Fe3+和Pb2+对酶的活性有抑制作用.该结果可为耐高温漆酶的开发利用提供参考.     

介孔分子筛固定化海藻糖合酶的研究

[目的]对介孔分子筛固定化海藻糖合酶进行研究。[方法]以基因工程菌所产海藻糖合成酶为材料,利用介孔分子筛MCM-41作为载体固定化海藻糖合成酶,并对固定化条件和固定化前后的海藻糖合酶性质进行比较研究。[结果]海藻糖合成酶可通过物理吸附法固定于介孔分子筛MCM-41孔道中,在pH为3,给酶量为62.5 mg/g的条件下,固定12 h时可得到最佳固定化效果;与游离海藻糖合酶相比,固定化后的海藻糖合酶pH稳定性和热稳定性明显改善,并具可重复操作性,有利于酶的使用和储放。[结论]该研究为开发新的固定化海藻糖合成酶提供了理论依据。