基于转录组测序的紫薇SSR特征分析

以紫薇叶片为材料,通过Illumina Hiseq X Ten测序平台进行高通量测序,利用MISA软件分析转录组的SSR相关信息。结果表明：测序共获得31 461条Unigene序列,总长度34 408 463 bp,其中有5 617条Unigene序列含有SSR位点,共发现SSR位点6 761个,出现频率为21.49%,平均分布距离为5.09 kb;主要的优势重复类型为二核苷酸重复和三核苷酸重复,分别占总SSR的44.95%和36.41%;AG/CT和A/T为SSR优势重复基元,出现频率分别为40.23%(2 720个)和16.57%(1120个)。分析表明,紫薇转录组中SSR类型丰富、位点出现频率高、多态性潜力高,在紫薇种质遗传多样性研究、品种鉴定、杂种鉴定等方面具有应用价值。     

基于转录组测序的黄麻SSR分子标记开发与初步验证

为开发黄麻SSR引物,为黄麻分子标记辅助育种等研究提供有利工具,在黄麻转录组测序的基础上,采用MicroSAtellite(MISA)软件进行SSRs搜索,并对部分SSR引物的多态性进行验证,结果表明:1)在1kb以上的13 718条unigene中,共检测到8 571个SSR位点,占评估序列数目的62.47%,平均每3.47kb有1个SSR;2)所开发的SSR标记中,单核苷酸重复序列最多,占42.15%,二核苷酸和三核苷酸序列也较丰富,分别占14.80%和16.74%;3)利用Primer3.0软件设计了与木质素合成酶基因及MYB转录因子相关的880对引物,随机选取29对引物,以8份不同类型黄麻种质进行多态性验证,获得8对具有稳定多态性的引物,多态性引物比率为27.58%。结果表明,基于黄麻转录组序列的SSR标记开发是可行的,开发的SSR标记可为黄麻属遗传多样性分析、遗传图谱构建及功能基因的挖掘等研究提供有利工具。     

基于棉花转录组测序的SSR分子标记的开发

通过对棉花转录组进行测序获得的57 695条Unigenes,利用MISA软件进行搜索,得出简单重复序列(simple sequence repeat,简称SSR)的分布情况,共挖掘检索得到1 886个SSR位点,SSR的出现频率为3.27%。所有SSR位点分布于1 759条Unigenes上,发生频率为3.05%,平均每20.8 kb会出现1个SSR位点。有117条Unigenes含有1个以上SSR位点,含有复合型SSR的Unigenes数目为56条,其中三核苷酸基元类型分布最多,SSR数量为1 582个,占挖掘出总SSR数量的83.88%,而单、二、四、五、六核苷酸重复类型所占的比例较小。最后通过Primer 3程序进行SSR引物设计,得到部分引物序列,可用于棉花遗传多样性分析、分子标记辅助育种以及种质资源的保存等。     

马氏珠母贝(Pinctada fucata)血细胞全长转录组测序与分析

[目的]开发马氏珠母贝(Pinctada fucata)基因组资源,挖掘功能基因。[方法]以马氏珠母贝血细胞为试材,利用单分子实时技术(single-molecule real time, SMRT)进行全长转录组测序,并对所获得unigenes进行功能注释和基因结构分析。[结果]共获得277 064条全长非嵌合序列和82 381个基因。经过比对nr、SwissProt、KEGG和KOG数据库进行注释和功能分类后,共得到59 621个注释基因。同时,在8 493条基因中共发现11 219个SSR位点,其中以二核苷酸重复基元类型最高(50.9%)。生物信息学分析鉴定得到20 013个lncRNA、2 004个转录因子、10 522个可变剪切分析位点。[结论]使用SMRT技术能够深入挖掘马氏珠母贝全长转录组数据,为进一步探讨马氏珠母贝功能基因的挖掘、免疫响应及遗传机制的研究提供可靠的基因组资源。     

基于转录组测序的棘胸蛙SSR和SNP分子标记开发

【目的】基于转录组开发SSR和SNP分子标记用于评价棘胸蛙（Quasipaa spinosa）遗传多样性,为其种质资源的创新利用提供理论支撑。【方法】采用TRIzol试剂盒提取棘胸蛙肝脏、肌肉和肾脏组织总RNA,构建cDNA文库后利用Illumina HiSeq 2500测序平台进行高通量测序,通过MISA对棘胸蛙转录组测序数据进行SSR检索,并以SAMtools和VarScan v.2.2.7进行SNP查找。【结果】棘胸蛙转录组测序共获得93887条非冗余基因（Unigenes）,序列总长度达91352712 bp,且所有转录组Q30均超过95.00%。在93887条Unigenes中发现33019个SSRs,其中21966条Unigenes含有SSR,6688条Unigenes含有超过1个SSR;以单核苷酸重复型SSR数最多,达25788个,且出现频率最高（27.47%）。SSR的平均长度以四核苷酸重复型最长,达35.47 bp;棘胸蛙SSR以（A/T）n为绝对优势重复基元,占总SSR的65.51%,然后依次为（C/G）_n、（AT/AT）_n、（AC/GT）n、（AG/CT）_n、（AAT/ATT）_n、（AGG/CCT）_n,分别占总SSR的12.59%、5.66%、5.55%、3.31%、1.55%和1.30%。在33019个SSRs中,核苷酸重复次数主要集中在5~25次,占总SSR的99.91%,且大部分SSR位于非编码区,仅有1633个SSRs位于编码区;长度≥12 bp的SSR共计17244个,占总SSR的58.53%。挑选120对SSR引物进行引物有效性验证,发现有57对引物扩增出单一条带,且条带大小与预期结果一致。对棘胸蛙转录组序列进行SNP检索,共发现87634个SNPs,其中,56300个SNPs属于转换位点、31334个SNPs属于颠换位点,转化/颠换比达1.80,碱基的转换频率明显高于颠换频率。【结论】利用高通量转录组测序开发棘胸蛙SSR和SNP分子标记是一种切实可行的方法,能开发出通用性较高、数量较多、覆盖性较广的分子标记。棘胸蛙具有中度偏高的遗传多样性,可作为种质材料进一步开发利用。     

苦茶全长转录组测序及基因结构分析

为进一步探究苦茶特异性状形成的遗传基础,基于PacBio对苦茶进行Iso-Seq,最终得到Polished consensus序列132 334个,其中有26 184个为已知基因的新转录本,7 115个为新基因,同时鉴定得到21 106个SSR位点;基因结构分析结果中,4 892个基因发生了可变剪切事件,其中内含子滞留...     

基于山茶转录组的SSR标记开发及亲缘关系分析

【目的】开发基于山茶转录组的EST-SSR分子标记,并应用该标记进行山茶种质的亲缘关系分析。【方法】本研究以山茶叶片转录组测序所获得的50 518条Unigenes为背景数据,利用MISA软件搜索SSR标记,设计并筛选SSR多态性引物,对8份山茶种质进行了UPGMA聚类。【结果】共检索到13 197个SSR位点,SSR的发生频率和分布频率分别为19.52%、26.12%,平均分布距离为4.33 kb;在6种SSR重复类型中,以单、二、三核苷酸这3种重复类型为主,分别占48.420%、34.917%和15.473%;出现频率高的基序类型为A/T、AG/CT和AT/TA,占总SSR位点的79.61%;三核苷酸中以AAG/CTT、ACC/GGT、AAT/ATT类型居多;在设计出的10 974对引物中,随机选用其中90对引物进行多态筛选,73对引物扩增产物与预期大小一致,有效扩增率为81.11%,29对引物存在扩增多态性,占39.73%。扩增得到72个等位基因,有效等位基因数平均达到3.264;观察杂合度和期望杂合度的平均值分别为0.208和0.638,引物多态信息含量平均为0.496;8份山茶种质在相似系数为0.58时,可以分为4类:山茶原种为Ⅰ类,‘黑蛋石’、‘红叶黑魔法’和‘黑骑士’为Ⅱ类,‘黑魔法’和‘金华美女’分别为Ⅲ类和Ⅳ类。【结论】山茶转录组测序的Unigenes信息可作为SSR标记开发的有效来源,为山茶的遗传多样性研究、亲缘关系鉴定以及分子标记辅助育种等奠定了一定的理论基础。      

利用转录组测序开发甘蔗SNP分子标记

【目的】利用转录组测序开发甘蔗SNP分子标记,为甘蔗建立一种高效和低成本的分子标记开发方法。【方法】以40个甘蔗栽培品种为试验材料,使用高通量测序平台获得其转录组数据,经质控后将其匹配到参考基因组,然后使用GATK软件检测和过滤SNP分子标记,并使用snpEff对SNP进行注释及统计分析。利用这些SNP分子标记进行系统发生分析、主成分分析和群体结构分析。最后,开发KASP标记并随机验证其有效性。【结果】转录组数据经质控后平均每个样本获得6.5 Gb的序列。通过变异分析和多重过滤筛选后,共获得220397个注释到染色体上的双等位基因SNP位点,平均密度为3 SNP/kb。SNP类型及分布特征分析结果表明,编码区错义突变与沉默突变的比值（N/S）为1.05,转换类型和颠换类型的比值（Ts/Tv）为1.89,杂合SNP占38.66%～49.91%,位于转录本的SNP比例为44.74%。系统发生分析、主成分分析和群体结构分析结果均表明,甘蔗栽培品种遗传来源较为单一,但群体分化较大。开发了11176个KASP分子标记,并随机合成25组KASP引物进行多态性验证,共有23组（92%）引物能检测到扩...     

油棕转录组SSR 标记开发研究

从NCBI网站下载4072 条油棕EST,结合文献报道的油棕果肉转录组序列信息,通过聚类拼接和处理,得到全长为32637.947 kb的无冗余序列20054条。在这些序列中共检索出4 538 个SSR袁检出率为22.6%遥其中以单核苷酸重复基序为主导类型袁出现频率为51.2%,二核苷酸、三核苷酸重复基序的出现频率分别为20.4%和17.9%。随机挑选了400对SSR引物进行PCR 多态性检测,获得29对PCR多态性引物,并随机选取11引物进行验证,在4种不同来源的油棕样本中表现出多态性。     

基于转录组测序技术的黄唇鱼SSR分子标记筛选

[目的]筛选出可用于黄唇鱼(Bahaba flavolabiata)遗传资源评价及亲缘鉴定的SSR分子标记,为开展其保护遗传学研究打下基础.[方法]利用Illumina HiSeq 4000测序平台对野生黄唇鱼样本进行转录组测序,采用TGICL对转录组数据进行聚类去冗余以获得Unigene,并通过生物信息学方法进行功能注释分类、代谢通路和SSR特征分析等.[结果]黄唇鱼混合组织的转录组测序共获得13.43 Gb数据,经组装并去冗余后获得65047条Unigenes.采用BLAST对组装获得的Unigenes进行七大功能数据库(NR、NT、GO、COG、KEGG、Swissprot和Interpro)注释,结果共有55583条Unigenes被注释(占85.45%).通过MISA对黄唇鱼的Unigene进行SSR搜索,共检测到29797个SSR位点分布于19664条Unigenes中.SSR位点分布类型及其特征分析结果显示,最主要的重复类型为二核苷酸重复基元(11855个,占39.79%),其次是单核苷酸重复基元(9695个,占32.54%)和三核苷酸重复基元(6663个,22.36%),而四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复基元的数量相对较少.二核苷酸重复基元类型中重复最多的基序是AC/GT(8355条),在三核苷酸重复基元类型中重复最多的基序是AGG/CCT(1866条).从随机选取的186对SSR引物中,最终筛选出47对扩增稳定性好且具有多态性的SSR引物,以二核苷酸和四核苷酸重复基元的扩增结果居多.[结论]通过转录组测序能有效筛选出具有多样性的黄唇鱼SSR分子标记,可为黄唇鱼的遗传多样性分析、亲缘鉴定和遗传图谱构建等后续研究提供基础资料.     

风信子DFR基因全长cDNA的克隆及序列分析

以蓝色风信子完全露出蓝色的花蕾为材料,利用RT-PCR和RACE技术，获得风信子DFR基因的全长cDNA。该cDNA全长1252 bp ,开放阅读框为1098 bp ,编码366个氨基酸。 Blast搜索结果显示,风信子DFR基因核苷酸序列与其它植物已报道的DFR基因具有66 %～77 % 的相似性,氨基酸序列有62 %～73 %的相似性。聚类分析表明, 最先与风信子聚类合并的是鸢尾，其次与其它单子叶植物聚类，最后与双子叶植物聚类。     

转录组测序筛选牛卵泡发育相关基因及其表达差异分析

【目的】通过不同生理状态牛卵泡高通量测序筛选与卵泡发育相关的基因。【方法】母牛同期发情后,B超声波连续监测并适时采集第一卵泡波出现偏差前的最大卵泡(the largest follicle at predeviation,PDF1)和第二大卵泡(the second largest follicle at predeviation,PDF2),构建RNA文库后Illumina平台测序,经数据库比对,设定参数筛选高表达基因、差异表达基因并进行GO分析,Genecards基因功能查询进一步筛选与卵泡发育直接相关的调控基因,q RT-PCR对筛选的基因进行表达量验证分析。【结果】两个转录本中共获得263个差异表达基因;GO功能聚类分析共分为三大类90组:其中生物学过程占64.4%,细胞组分占17.8%,分子功能占17.8%;获得一些重要的功能富集通路,如调控信号转导和细胞因子应答的生物途径;基因表达量分析筛选出10个高表达的上调和下调基因,获得参与雌激素合成和胎儿性别发育的CYP17A1、参与类固醇激素合成的LOC785462、细胞发育过程中调节细胞凋亡的DACH1以及调节ERK和MEK1/2信号通路的MAP3K3。Genecards功能查询共获得6个基因与卵泡发育关系较为密切,其中上调基因分别为PRSS35,PTGRF,ARID4B,GPR116;下调基因为APOA1和CPXM1;q RT-PCR结果显示,PRSS35和ARID4B在DF中的表达量显著高于SF(P0.05),CPXM1在SF中的表达量极显著高于DF(P0.01),PTGRF,GPR116和APOA1在DF和SF中的表达量不存在显著差异(P0.05),但其表达变化趋势与高通量测序结果相一致。【结论】转录组测序结果真实可靠,PRSS35和ARID4B在卵泡发育过程中发挥正调控作用,CPXM1在卵泡发育过程中发挥负调控作用,获得的牛卵泡发育相关基因和重要调节途径,对后期深入探讨卵泡发育调控机理的研究具有重要意义。     

微卫星标记在水稻遗传育种中的应用

微卫星标记或称简单序列重复，它是由1—6个核苷酸为重复单位组成的串联重复序列，相同座位上的重复序列由于重复次数的不同而造成序列长度的多态性。综述了微卫星标记的类型、特点及其在遗传图谱构建、品种鉴定、种质资源保存和利用、遗传多样性分析、分子标记辅助选择和杂种优势利用等方面的应用。     

尾叶紫薇与紫薇F_1代群体主要表型性状与SSR标记的连锁分析

以母本尾叶紫薇与父本紫薇‘香雪云’及杂交F1代192株为试材,对株高、地径、叶长、叶宽及叶面积5个性状在群体中的遗传变异进行了统计和分析。结果表明:150对SSR引物筛选出F1群体亲本有多态性的引物对50个; 5个表型性状在群体中呈连续分布,与其正态分布曲线拟合较好,并且彼此之间具有相关性。采用单因素方差分析法进行SSR分子标记和性状的连锁分析得到:SSR3-153、SSR40-131、SSR40-137与紫薇的叶宽显著性相关,贡献率分别为25.5%、12.1%、11.6%;SSR34-158、SSR34-161与紫薇的叶长显著性相关,贡献率分别为7.8%、9.1%;SSR10-172与紫薇的株高和地径显著性相关,贡献率分别为15.7%、10.3%。      

柑橘全爪螨微卫星位点鉴定与信息分析

【目的】通过磁珠富集法构建柑橘全爪螨（Panonychus citri）微卫星富集文库,发掘柑橘全爪螨基因组微卫星（gSSR）序列。同时,利用柑橘全爪螨转录组数据库,筛选其功能微卫星（EST-SSR）分子标记,设计柑橘全爪螨微卫星（SSR）引物并验证其适用性。【方法】在提取柑橘全爪螨高质量基因组DNA的基础上,使用链霉亲和素偶联的磁珠与生物素标记的微卫星探针结合,亲和性捕捉由限制性内切酶酶切产生的含SSR的单链基因组DNA目的序列,经PCR扩增为双链后,克隆并构建SSR富集文库,测序筛选SSR序列。另一方面,基于柑橘全爪螨转录组数据,利用msatcommander软件发掘其功能微卫星标记。采用Primer Premier 5软件设计SSR引物,并进行验证。【结果】构建了柑橘全爪螨AC、TC和ATG共3个SSR富集文库,阳性克隆率分别约为30%、28%和25%。对文库的测序结果表明,AC文库的冗余率最高,TC文库次之,而ATG文库未发现相同微卫星位点的克隆。同时,在AC文库中,大部分AC重复类型的SSR为多拷贝微卫星位点,其中有相当一部分SSR的一侧侧翼序列完全相同或高度相似。从3个SSR富集文库中获得了可用于设计引物的gSSR单一序列44条（GenBank登录号为JF776418-JF776461）,共合成了20对SSR引物,其中能够稳定扩增的引物有11对。柑橘全爪螨gSSR中完美型SSR占54.5%,非完美型和复合型SSR分别占27.3%和18.2%。在完美型的gSSR中,两碱基重复SSR的核心重复次数（13-42次）大于三碱基重复SSR（5-9次）。从柑橘全爪螨转录组数据库中共获得8 023个EST-SSR位点,其中2 540个SSR可用于引物设计,共合成了35对引物（GenBank登录号为KT261306-KT261340）,其中能够稳定扩增的引物有8对。柑橘全爪螨EST-SSR的平均分布频率为1/3.55 kb。其中,三碱基为优势核心重复类型,占总数的53.86%;其次为两碱基核心重复类型,占总数的43.36%;而四、五、六碱基重复类型以及复合型的SSR数量均较少,且数量差异不大,共占EST-SSR总数的2.78%。柑橘全爪螨EST-SSR核心重复次数主要集中在5-10次。【结论】采用磁珠富集法,并将酶切、接头连接一步化,可提高个体微小的螨类及微小昆虫SSR的富集效率。柑橘全爪螨gSSR核心重复次数要远多于从转录组数据库获得的EST-SSR。总体而言,gSSR和EST-SSR中的三碱基重复SSR具有更好的优化率。此外,柑橘全爪螨gSSR具有微卫星家族现象。     

红螯螯虾转录组高通量测序及分析

【目的】为发掘和研究红螯螯虾功能基因SSR标记奠定基础。【方法】对红螯螯虾肝脏、精巢以及卵巢转录组测序选用新一代高通量测序技术Illumina Hi Seq 2000,同时借助生物信息学法展开基因表达谱探究及功能基因预测。【结果】肝脏组织获得47 629 414条clean reads,精巢组织获得47 018 968条clean reads,卵巢组织获得53 267 362条clean reads。所有reads组装后获得了67 369个Unigene。通过GO分类,16 989个Unigene被分为3个种类,即生物学过程、细胞组分、分子功能。通过COG分类,4 697个Unigene被分为25个种类。通过KEGG分类,9 842个Unigene分属331个代谢途径。【结论】通过对红螯鳌虾肝脏等3个组织转录组的测序,获得了其相关基因的表达图谱及其功能分类。     

青篱柴转录组的高通量测序及分析

青篱柴具有很好的观赏价值和药用价值,但其基因组信息相对缺乏,导致其分子生物学和基因功能的研究受到限制.为了获得和挖掘青篱柴的基因数据和功能,首次利用新一代高通量测序技术平台Illumina HiSeqTM2000对青篱柴转录组进行测序,经de novo组装后共得到66 755条单基因簇(Unigene).进一步利用7大公共数据库进行Blast同源比对,注释了50 339条Unigene.研究发现,558个基因参与了青篱柴次生代谢产物的生物合成,其中在甜菜红碱、芥子油苷、类黄酮、单菌霉素和苯丙素生物合成途径中的Unigene分别有2个、18个、44个、70个和231个,这些基因很可能参与了青篱柴药用活性物质的生物合成.SSR位点搜索发现,在18 972条Unigene中含有22 542个SSR位点.研究结果将为青篱柴功能基因的克隆、基因的表达、分子标记开发和遗传多样性研究奠定基础.同时,转录因子分析结果也为青篱柴的喀斯特环境适应性机制提供了初步线索.     

微卫星标记在水产动物遗传研究方面的应用

微卫星标记具有分布广、多态性高、数量丰富、等位基因检测方便等优点,在亲缘关系分析、种质资源鉴定、物种遗传多样性检测等方面被研究者广泛采用。笔者简要介绍了微卫星标记在水产动物遗传方面的研究进展,以期为水产动物遗传研究提供参考。     

多重PCR法在微卫星标记中的效果观察

通过建立一种同时检测3个位点（MCW0083、MCW0037、LEI0166）的多重PCR方法,在同一样品中同时扩增这3个微卫星位点。混合扩增产物与各位点单引物PCR法扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,用BandScan软件分析各微卫星位点的等位基因大小。多重PCR方法扩增出的DNA片段与单PCR扩增的结果表明,每个个体标记等位基因的片段大小差异不大,初步认为该方法是可行的。     

梅花鹿微卫星标记与行为性状的关联分析

对扬州市动物园和扬州平山堂养殖场梅花鹿遗传变异以及行为性状进行研究,旨在为梅花鹿及其它动物品种分子标记和行为性状研究提供参考.采用筛选的14对微卫星引物,通过计算基因频率、平均杂合度、多态信息量、有效等位基因数目等,评估其遗传变异.根据微卫星位点信息,结合行为数据观察,利用SPSS 11.5分析程序,将位点信息与行为性状进行相关分析.结果表明,动物园梅花鹿群体14对微卫星位点的平均期望杂合度为0.441,观察杂合度为0.354,平均多态信息量为0.332,各位点基因分化系数平均为0.231.平山堂梅花鹿群体平均期望杂合度为0.372,观察杂合度为0.300,平均多态信息量为0.303,各位点基因分化系数平均为0.149.微卫星位点和梅花鹿行为性状的最小二乘分析表明,TGLA53和BM4107位点对修饰行为有显著影响;2AL2位点对观望行为有显著影响;2AL13和Mber14位点对卧息行为有极显著影响;BM6506位点对反刍和其他行为有显著影响;BL42位点对取食和卧息行为有显著影响.不同基因型个体均值的多重比较表明,对于动物园群体,在TGLA53、BM4107、2AL2、2AL13及BM6506位点,不同基因型之间在行为性状上差异显著(P＜0.05).对于平山堂养殖场群体,在TGLA53,CEH-5、2AL10、BM4107、Mb33、Mber710及BM3628位点,各基因型之间在一些行为性状上亦存在显著差异(P＜0.05).微卫星标记是评估梅花鹿遗传多样性较好的方法,微卫星位点和行为性状存在一定的相关性,但有待于进一步分析验证.