单核细胞增生李斯特菌重组酶聚合酶恒温扩增快速检测方法的建立

为建立基于重组酶聚合酶等温扩增(RPA)技术的单核细胞增生李斯特菌快速检测方法,本研究针对单增李斯特菌的基因组序列设计特异性引物,通过对反应体系的优化确定最佳反应温度为42℃和最佳反应时间为15 min。特异性试验结果显示:本研究建立的RPA方法与伊氏李斯特菌、无害李斯特菌、斯氏李斯特菌、格氏李斯特菌、肠致病性大肠埃希菌O157、沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌均无交叉反应;敏感性试验结果显示:该方法对单增李斯特菌基因组DNA和菌液的最低检出限分别为3×10~2拷贝/μL和10~3cfu/mL。利用本研究建立的RPA快速检测方法分别对50份人工污染的牛奶、牛肉和鱼肉样品进行检测,并与荧光定量PCR检测结果进行对比,结果一致。本研究建立的单增李斯特菌RPA检测方法具有反应快速、灵敏度高、特异性强、操作简便的特点,适用于基层实验室和现场快速检测。     

羊源多杀性巴氏杆菌重组酶聚合酶扩增诊断方法的建立

为建立适用于羊源多杀性巴氏杆菌的重组酶聚合酶扩增（RPA）诊断方法,本研究依据前期测序鉴定的羊源多杀性巴氏杆菌KMT1基因序列构建pET-28a （＋）-KMT1质粒标准品。设计基于RPA技术的特异性引物及RPA荧光探针,建立实时荧光RPA方法的最适反应体系。采用10倍梯度连续稀释的质粒标准品检测该RPA方法的敏感性并绘制相关性曲线;以10种不同菌株的基因组DNA为模板验证方法的特异性;用感染多杀性巴氏杆菌的山羊及小鼠组织样品对方法的可靠性进行验证。结果显示,本试验建立的实时荧光RPA方法最适反应温度为39 ℃,最佳引物为KMT1-Fe1,灵敏度达100拷贝/μL,检测下限为10拷贝/μL。与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副伤寒沙门氏菌、副溶血弧菌、绿脓杆菌、产酸克雷伯菌、布鲁氏菌S2株和鲍曼不动杆菌均无交叉反应。对13个组织样本进行检测,阳性率为76.9%,与实时荧光定量PCR检测结果的符合率达92.3%。综上所述,本研究建立的羊源多杀性巴氏杆菌实时荧光RPA方法具有特异性强、灵敏度高、可靠、快速便捷等特点,适用于多杀性巴氏杆菌的临床分子诊断。     

牛乳房炎金黄色葡萄球菌LAMP检测方法的建立及初步应用

为建立灵敏、快速、可视化的牛乳房炎金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)环介导等温扩增技术(LAMP),根据GenBank公布的金黄色葡萄球菌nuc基因核苷酸序列为靶序列,设计并合成一组特异性LAMP引物,分别优化反应条件和反应体系,进行特异性和灵敏度试验,并用优化后的方法对临床分离的金黄色葡萄球菌样品进行检测。结果表明,建立的方法可以在64℃反应60 min,得到清晰的梯状条带;反应产物经10×SYBR GreenⅠ染色后,肉眼直接观察或是紫外线照射之后均可判定结果;敏感性试验表明,与常规PCR相比,该方法检测到的金黄色葡萄球菌最低浓度为1×10~1 CFU/mL,灵敏度提高了100倍;该方法特异性良好,与大肠埃希菌、沙门菌、伪结核棒状杆菌均无交叉反应;31份临床分离的金黄色葡萄球菌样本检测的结果表明,该方法与传统的PCR检测结果一致。建立的LAMP检测方法特异性、灵敏度良好,可用于临床牛乳房炎金黄色葡萄球菌感染的检测。     

基于nuc基因的环介导等温核酸扩增可视化技术检测食源性金黄色葡萄球菌

金黄色葡萄球菌食物中毒主要是由食用被金黄色葡萄球菌及其所产生的肠毒素污染的奶、肉、蛋、糕点、剩饭等蛋白或淀粉含量丰富的食品引起,快速精准的金黄色葡萄球菌检测技术对于保障人们的健康和食品安全具有重要意义。本研究以nuc基因作为检测靶基因,建立了一种检测金黄色葡萄球菌的环介导等温核酸扩增(LAMP)技术。该方法检测金黄色葡萄球菌基因组DNA样品为阳性,而对单细胞增生李斯特菌、鼠伤寒沙门菌、肠出血性大肠杆菌、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森菌和产气荚膜梭菌等食源性致病菌和猪链球菌、胸膜肺炎放线杆菌和多杀性巴氏杆菌等猪源细菌基因组DNA检测结果均为阴性,表明建立的LAMP方法具有较好的特异性。灵敏度的检测结果表明,LAMP的检测限可达5.6×10¹ CFU/mL,而常规PCR的检测限为5.6×10⁵ CFU/mL,即LAMP的检测灵敏度比常规PCR高出10 000倍。临床样品的检测结果表明,50份猪肉样品中有4份检出金黄色葡萄球菌。本研究为食源性金黄色葡萄球菌提供了一种快速、可视化、特异性好、灵敏度高、成本低的LAMP检测方法。     

猪源肺炎克雷伯菌荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为了实现猪源肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,Kp)的快速检测,根据GenBank公布的猪源Kp Khe基因保守序列,设计引物和探针,建立了一种Kp荧光定量PCR快速检测方法,并对该方法的灵敏性、特异性及重复性进行评价。结果显示:该方法灵敏度高,最低检测限为10 copies/μL;特异性强,与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、猪2型链球菌、副猪嗜血杆菌、猪坏死杆菌、猪细胞内劳森菌和猪丹毒杆菌等病原均无交叉反应;重复性好,批内及批间变异系数均小于2%。采用本方法检测140份临床送检样品,本方法的阳性检出率高于细菌分离鉴定方法。以上结果表明,本方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可为猪源肺炎克雷伯菌病的诊断及防治提供更好的技术支持。     

兔源强毒力金黄色葡萄球菌荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立一种快速、特异性强且敏感性高的兔源强毒力金黄色葡萄球菌检测方法,本试验根据金黄色葡萄球菌pvl基因的保守序列设计了特异性的引物和探针,通过反应条件的优化,建立了检测兔源强毒力金黄色葡萄球菌的荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法耗时短,仅需约50 min就能完成检测,较已报道的双重PCR方法和环介导等温扩增方法均省时;该方法特异性强,对兔源低毒力金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌、肺炎克雷伯菌、魏氏梭菌、大肠杆菌和阴性对照(灭菌ddH₂O)均无交叉反应;该方法敏感性高,最低检测限为10拷贝/μL,分别是已报道的双重PCR方法和环介导等温扩增方法的1 000倍和10倍。此外,该方法重复性好,批内和批间重复性试验的变异系数均小于2%。应用该方法检测126份已知结果的临床样品,检测结果与已知结果、已报道的双重PCR方法和环介导等温扩增方法的检测结果完全一致。该方法的建立不仅丰富了兔源强毒力金黄色葡萄球菌的检测方法,也为该菌的快速检测提供了更有力的技术支持。     

志贺氏菌属环介导恒温扩增快速检测方法的建立及初步应用

为建立快速检测志贺氏菌属的方法,本研究针对其ipaH基因,建立了志贺氏菌属环介导恒温护增(LAMP)快速检测方法。利用该方法对50株细菌进行检测,结果显示7株志贺氏菌均为阳性,其它菌均为阴性,表明该方法具有高度特异性。灵敏度试验显示,对志贺氏菌纯培养菌的检测灵敏度为28cfu/mL,对污染食品中志贺氏菌的检测灵敏度为35cfu/mL。利用该方法对195份涉及肉类、奶类、豆制品及人工污染样品进行检测,共检出29份阳性样品,与细菌分离鉴定检测结果一致。该LAMP方法操作简便、特异性强、灵敏度高且成本低廉,具有良好的应用前景。     

EMA-PCR检测金黄色葡萄球菌活菌的方法

根据金黄色葡萄球菌(SA)耐热核酸酶编码基因(nuc基因)设计特异性引物,对试验菌株进行PCR检测,结果显示,金黄色葡萄球菌扩增出大小为480 bp的特异性条带,而其他对照菌株未扩增出条带.由于传统PCR技术无法区分样品中的死细菌与活细菌,从而使检测结果往往出现很高的假阳性.本试验利用EMA能穿过死细菌的细胞膜并在光激活的作用下能与基因组DNA共价结合,从而能抑制死菌DNA进行PCR扩增的特性,建立了一种快速、有效的检测金黄色葡萄球菌活菌的EMA-PCR方法,较传统PCR大大提高了检测的准确性和可靠性,该方法检测灵敏度可达15 CFU/mL.     

一种金黄色葡萄球菌核酸检测方法的建立

通过对金黄色葡萄球菌的fem A基因设计两对特异性引物,运用环介导等温扩增技术(LAMP)扩增基因的特定区域,探索出一种金黄色葡萄球菌的快速检测方法。结果表明,该方法对金黄色葡萄球菌菌液检测的最低检出浓度为10~2～10~3CFU/Ml;使用不同浓度的金黄色葡萄球菌处理样品,不同样品LAMP方法检测结果与国标方法一致,两者符合率为100%。该方法中金黄色葡萄球菌的fem A基因特异性引物及建立的LAMP方法能有效检测食品中的金黄色葡萄球菌,操作简单、检测速度快、灵敏度高、特异性强,适用于不同层级的实验室及基层单位使用。     

基于重组酶聚合酶扩增技术的犬细小病毒快速检测方法的建立

为建立一种快速、简便检测犬细小病毒(CPV)的方法,本研究基于CPV VP2基因的保守序列,设计合成引物,通过对反应条件的优化,建立了CPV的重组酶聚合酶(RPA)检测方法。该方法在38℃恒温反应15 min即可快速、特异性的检测出CPV。特异性试验结果显示,除CPV (BJ-2b株、BJ-2c株)外,犬瘟热病毒、犬冠状病毒、犬腺病毒、犬副流感病毒等检测均为阴性;敏感性试验结果显示,以重组质粒pEASY-CPV-VP2为模板,RPA的检测下限为1×10~1拷贝/μL,其敏感度比普通PCR方法高10倍。利用建立的RPA方法对疑似CPV感染的临床样品的阳性检出率为88%,高于普通PCR的检出率(82%)和胶体金的检出率(76%)。本研究建立的CPV RPA检测方法操作简单,反应灵敏,结果确实可靠,适用于CPV的快速检测。     

柑橘黄龙病菌的重组酶聚合酶扩增(RPA)检测

【目的】本研究旨在建立黄龙病菌的重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)快速检测体系,丰富柑橘黄龙病的高效简便检测方法。【方法】以黄龙病菌株psy62的保守基因序列设计并筛选特异性引物,经灵敏度比较和检测特异性验证,建立该病的RPA检测体系。经PCR、RPA和实时荧光PCR对87份柑橘样品的黄龙病菌检测,验证RPA检测体系的适用性。【结果】建立了黄龙病菌的RPA检测方法。(1)特异性：能特异性检测柑橘黄龙病。(2)灵敏度：RPA是PCR的100倍,与实时荧光PCR相当。(3)检测体系：只需20min,大幅提高检测效率。(4)适用性：RPA与实时荧光PCR检出率均为35.63%,比PCR的31.03%略高。【结论】建立了黄龙病菌的RPA检测方法,具有特异性强、灵敏度高、检测快速、无需特殊仪器设备和操作简便等特点,为柑橘黄龙病提供了高效简便的快速检测手段。     

兔源肺炎克雷伯氏菌重组酶聚合酶扩增检测方法的建立

为建立一种检测兔源肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)重组酶聚合酶扩增方法(recombinase polymerase amplification,RPA),根据肺炎克雷伯氏菌的phoE基因保守序列设计引物,扩增片段大小为277 bp,并对反应条件进一步优化,最终建立了适宜于快速准确检测兔源肺炎克雷伯氏菌的重组酶聚合酶等温扩增方法。该方法可特异性检测出兔源肺炎克雷伯氏菌,最低检出细菌量为8.3×10~1 CFU/mL,灵敏度比传统PCR高100倍。本研究建立的肺炎克雷伯氏菌RPA检测方法特异性强、操作简单,从而为生产中的兔源肺炎克雷伯氏菌现场快速检测提供了一种新方法。     

3种鼠源致病菌多重PCR检测方法的建立

本研究以沙门菌组氨酸转运操纵子hut基因、肺炎克雷伯菌外膜蛋白Pho E基因以及金黄色葡萄球菌耐热核酸酶nuc基因作为靶基因,建立了同时检测这3种致病菌的多重PCR方法,并对混有3种致病菌的盲肠内容物分别采用传统细菌分离培养法和PCR方法进行检测,同时对混有3种致病菌的粪便样品进行PCR检测。该方法能扩增出目的片段分别为495 bp、333 bp、279 bp。在优化条件下,多重PCR同时检测沙门菌、肺炎克雷伯菌及金黄色葡萄球菌的敏感度分别为1.23 pg、1.9 pg、1.185 ng DNA。分离培养法对沙门菌、肺炎克雷伯菌及金黄色葡萄球菌的最低检出限分别为1×10~2CFU、1×10~0CFU和1×10~2CFU。混合有3种致病菌的盲肠内容物和粪便,经增菌培养后,PCR法的最低检出量均为1×10~0CFU。本研究建立的多重PCR检测方法具有特异性及灵敏度高、操作简单、周期短的优点,适用于实验小鼠多种致病菌的快速检测和监控。     

梅迪-维斯纳病毒实时荧光RPA检测方法的建立

为实现对梅迪-维斯纳病毒(MVV)的快速检测，根据MVV gag基因保守序列设计特异性引物和探针，通过优化反应条件和反应体系，建立了MVV的实时荧光RPA检测方法，并通过灵敏度、特异性、重复性试验及样品复核检测进行评价。结果显示：该方法最佳反应温度为39℃，用时短，20 min即可完成检测；灵敏度高，检测下限可达10^-1 pg/μL，比常规PCR检测结果灵敏约10⁴倍；特异性强，与小反刍兽疫病毒、羊败血性链球菌、牛肠道病毒、传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型、肺炎支原体等继发呼吸系统症状病原无交叉反应；重复性好，对于相同质量浓度的模板DNA检测变异系数均小于10%；可有效检测出MVV，与PCR结果一致。综上所述，本研究建立的MVV荧光RPA检测方法适用于MVV的临床快速检测，可为该病的诊断及防控提供依据。     

非洲猪瘟病毒实时荧光RPA快速检测方法的建立

非洲猪瘟是一种跨境动物疫病,对世界养猪业危害严重。目前,该病的流行范围越来越广。为防止该病传入我国,当前急需建立快速、简便、可靠的检测方法。本研究通过分析非洲猪瘟病毒B646L基因保守区域,设计并合成了特异性引物和exo探针,建立了检测非洲猪瘟病毒的实时荧光RPA方法。利用该方法可在20 min内完成检测过程,最低可检测到16拷贝/反应;与猪的其他常见病原核酸无交叉反应;与荧光PCR方法具有相似的灵敏度和特异性;利用该方法对100份国内临床样品进行检测,结果均为阴性。本研究所建立的非洲猪瘟病毒实时荧光RPA检测方法具有简单、快速、敏感性高、特异性强的优点,在临床鉴别诊断、检验检疫和病原监测等方面具有广泛的应用价值。     

生鲜乳中金黄色葡萄球菌LAMP检测方法的建立

针对金黄色葡萄球菌的TRAP基因设计LAMP引物,建立了金黄色葡萄球菌环介导等温扩增(LAMP)方法,进行了特异性和灵敏性试验,并对临床乳样进行初步检测。结果显示,建立的LAMP检测方法特异性良好,与生鲜乳中常见的大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、无乳链球菌、粪肠球菌无交叉反应,灵敏度为10CFU/mL。分别用传统分离鉴定法与LAMP法对50个乳腺炎乳样进行检测,传统方法分离得到S.aureus 14株,LAMP法检测得到S.aureus 14株,符合率100%,阳性检出率均为28%。结果表明,成功建立了生鲜乳中金黄色葡萄球菌的快速检测方法,该方法无需特殊的仪器,有利于在临床和基层进行推广。     

免疫层析法快速检测金黄色葡萄球菌的研究

为建立一种快速检测金黄色葡萄球菌的新方法,本研究采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金,用胶体金标记鼠抗金黄色葡萄球菌凝集因子A(C1fA)重组蛋白特异性抗体,从抗金黄色葡萄球茵IgG包被于硝酸纤维素膜,制成免疫层析快速检测试纸条.该方法可以在10min内完成对含金黄色葡萄球菌奶样的检测;敏感度为1×104 cfu/mL以上,与PCR方法进行对比检测,相差一个数量级;与大肠杆菌、链球菌、李氏杆菌、巴氏杆茵及蜡样芽孢杆菌均无交叉;稳定性和重复性较好.该试纸条检测金黄色葡萄球菌临床样品表明其具有特异性好,灵敏度较高的特点.     

炭疽杆菌RPA等温检测方法的建立和应用

为建立一种简单、快速的炭疽杆菌(Bacillus anthracis)分子检测方法,本研究基于炭疽杆菌BA5345基因保守序列,设计合成1对重组酶聚合酶扩增(RPA)引物,通过对反应时间的优化,建立39℃恒温水浴锅检测炭疽杆菌的RPA方法。结果显示,所建立的RPA方法在39℃水浴锅中恒温反应30 min,能够特异性的检测炭疽杆菌;以重组质粒pUC57-BA5345作为模板,RPA方法对其检测下限为102拷贝/μL,与荧光定量PCR检测试剂盒检测下限一致,比常规PCR方法敏感性高100倍;RPA方法对污染皮毛临床样品的阳性检出率为65.71%,略低于荧光定量PCR试剂盒的检出率(71.43%),明显高于常规PCR的检出率(42.86%)。本研究建立的RPA方法操作简单、反应快速,结果确实可靠,适用于炭疽杆菌的快速检测。     

河北省奶牛乳房炎主要致病菌多重PCR检测方法的建立

为同时检测奶牛源金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和绿脓杆菌,本试验根据GenBank中3种病原菌的nuc、ef-tu和eta基因保守序列分别合成了3对特异性引物,通过对反应条件、反应体系优化,建立了多重PCR检测方法。特异性试验结果表明,该方法与大肠杆菌、克雷伯杆菌、表皮葡萄球菌、巴氏杆菌无交叉反应,敏感性试验结果表明,多重PCR检测方法对金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和绿脓杆菌的检出限为10~(-3) mg/L。应用该方法对150份临床样品进行检测,结果金黄色葡萄球菌与无乳链球菌混合感染检出率为28.7%(43/150),金黄色葡萄球菌与绿脓杆菌混合感染检出率为14%(21/150),无乳链球菌与绿脓杆菌混合感染检出率为11.3%(17/150),3种菌混合感染检出率为6%(9/150)。应用多重PCR检测结果与分离培养诊断方法结果进行比较,均能检测出样品中的病原菌,2种检测方法的总符合率分别为金黄色葡萄球菌92.6%,无乳链球菌91.3%,绿脓杆菌94.6%。该检测方法对奶牛乳房炎的防控、临床监测及疾病诊治具有重要意义。     

猪德尔塔冠状病毒重组聚合酶扩增检测方法的建立与应用

为了快速检测猪德尔塔冠状病毒(PDCoV),针对PDCoV N基因设计特异的引物,建立了猪德尔塔冠状病毒重组聚合酶扩增(RPA)方法。特异性试验中以PPRSV、PEDV、PKV、TGEV和FMDV为模板时均未产生任何条带,特异性较好。该检测方法的灵敏度为103 copies/μL,敏感性较好。用该方法检测194份仔猪腹泻样品,PDCoV阳性率为14.4%,较常规RT-PCR阳性率为11.9%更高。研究所建立的猪德尔塔冠状病毒RPA检测方法具有反应快速、操作简单、结果可靠、设备要求低等优点,可为基层简易实验室提供一种方便适用的快速检测方法。