传染性法氏囊病病毒分子生物学研究进展

传染性法氏囊病毒是鸡的一种重要的病原。文章概述了在传染性法氏囊病毒基因组结构和功能、分子生物学诊断方法和病毒变异的分子基础等方面的研究进展     

传染性囊病病毒结构蛋白VP2的融合表达

将IBDV超强毒株HK46的结构蛋白vp2基因的cDNA片段插入表达质粒psoc的EcoRI位点,获得重组质粒pSOC-VP2．用pSOC-VP2转化E．coli BL21(DE3),获得表达VP2蛋白的工程菌BL-SOC-VP2．在1μG/mL IFIG诱导之下,BL-SOC-VP2表达了融合蛋白SOC-VP2,其相对分子质量为49000．SDS-PAGE检测表明,融合蛋白SOC-VP2的最大表达量为细菌总量的14．35％．ELISA分析表明,大肠杆菌表达的SOC-VP2能与IBDV阳性血清发生特异性反应．     

传染性法氏囊病病毒变异株二价弱毒疫苗的研究

选用传染性法氏囊病病毒变异株JD1、NB、HZ1弱毒株配制成JN（JD1+NB毒株组成）和JH（JD1+HZ1毒株组成）两种二价弱毒疫苗。分别在14日龄首免和28日龄二免SPF鸡,并于一免后14 d、21 d,二免后12 d分别用强毒株传染性法氏囊病病毒（IBDV）BC6/85株攻击;同时观察疫苗的安全性。结果表明JN和JH疫苗均能诱导SPF免疫鸡产生优良的免疫应答反应,并能使免疫鸡对IBDV-BC6/85株的攻击产生100%的保护。JN和JH疫苗的最佳免疫剂量分别为6 000 TCID₅₀和10 000 TCID₅₀。     

浙江地区传染性法氏囊病毒野毒株鉴定及理化特性

将浙江省六个地市的７株鸡传染性法氏囊病的法氏囊组织处理后,直接在鸡胚上接种于成纤维细胞盲传２～１５代,均能不同程度产生特征性细胞病变效应（ＣＰＥ）,并通过病毒血清中和试验、动物回归试验、电镜观察、琼脂免疫扩散试验、理化特性测定等证实所分离的７株病原为传染性法氏囊病病毒。     

鸡传染性法氏囊病的对流免疫电泳诊断技术

本试验建立了诊断鸡传染性法氏囊病的对流免疫电泳（CIE）技术。试验结果表明，该法的敏感性较琼脂凝胶沉淀试验至少高4倍，并具有快速、敏感、特异等特点。鸡传染性法氏囊病（IBD）是一种由传染性法氏囊病毒引起的急性高度传染性疾病。肉鸡感染后死亡率很高，通常死亡率约为10%-90%，如并发其他疾病，则死亡率更高。早期快速准确的诊断是防治本病的基础。     

鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因植物表达载体的构建

以含鸡传染性法氏囊病病毒(杭州分离株,HZ96)VP2基因的质粒 PBS为模板,根据其序列设计引物进行PCR扩增,得到1.5 kb左右长的VP2基因产物;用KpnⅠ和 SalⅠ酶切纯化的PCR产物;将纯化的酶切产物在 T4 DNA连接酶的作用下定向克隆到植物表达载体Cambia1301 水稻胚乳特异性启动子GT1下游, 并经PCR、酶切和测序鉴定.植物重组表达载体经三亲交配已导入根癌农杆菌中.     

Analysis of the function of D279N mutation of VP2 of infectious bursal disease virus

Infectious bursal disease virus(IBDV)is responsible for the highly contagious infectious bursal disease of chickens.Further understanding the gene-function is necessary to design the tailored vaccine.The amino acid residue 279,located on strand P_F of VP2,is one of the three residues that have been reported to be involved in cell-tropism but with some inconsistency.In this study,to further clarify the amino acids involved in the cell tropism of IBDV,a series of mutations about residue 279were introduced into the VP2 of vv IBDV Gx strain.With the reverse genetic system,we found single mutation of D279N,double mutations of D279N/A284T or Q253H/D279N were not enough to adapt IBDV to chicken embryo fibroblast(CEF)cell.To evaluate whether residue 279 could influence the replication and virulence of IBDV,the virus r Gx HT-279 with three mutations(Q253H/D279N/A284T)was rescued and evaluated.Results showed that the mutation of residue 279 in VP2had no efficient effects on both the replication efficiency in vitro and the virulence to SPF chickens of IBDV.In summary,the results demonstrated that residue 279 of VP2 did not contribute efficiently to cell tropism,replication efficiency,and virulence of IBDV at least in some strains.These findings provided further information for understanding the gene function of IBDV.     

鸡白细胞介素2口服免疫佐剂增强传染性法氏囊病病毒DNA疫苗免疫效果的研究

将含萧山鸡白细胞介素2基因的真核表达质粒pCI-IL-2的减毒鼠伤寒沙门氏茵ZJ111(ZJ111/pCI-IL-2)口服接种小鼠和雏鸡,并与传染性法氏囊病病毒(IBDV)DNA疫苗联合免疫雏鸡观察其免疫效力.结果表明:利用减毒沙门氏菌作为栽体的鸡白细胞介素2口服免疫增强剂具有相对的安全性,重组ZJ111/pCI-IL-2茵能明显增强IBDV DNA疫苗对强毒株攻击保护率;增强IBDV DNA疫苗诱导的抗体的效价(P＜0.05);增强IBDV DNA疫苗所诱导的T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖反应(P＜0.05),上述结果初步表明以减毒沙门氏菌为载体的白细胞介素2免疫增强剂具有良好的安全性和免疫增强作用,为研制低成本、实用化的禽类口服免疫增强剂奠定了基础.     

鸡IL-18对IBDV多聚蛋白DNA疫苗的免疫增强作用研究

    为进一步评价鸡IL-18的免疫增强作用,用鸡白细胞介素18(IL-18)的真核表达质粒(pCI-IL-18)与传染性法氏囊病病毒(IBDV)多聚蛋白DNA疫苗分别免疫SPF鸡,14日龄时首免,2周后二免,二免后5周用IBDV标准强毒株BC6/85攻击.研究发现,鸡IL-18能显著促进T、B淋巴细胞的增殖反应,增强IBDV多聚蛋白DNA疫苗诱导的中和抗体水平及其对强毒攻击的保护力.结果提示,鸡IL-18(200 μg)对IBDV多聚蛋白DNA疫苗具有显著的免疫增强作用(P＜0.05).     

Oral administration of Allium sativum extract protects against infectious bursal disease in chickens

Garlic (Allium sativum, Liliaceae) has been safely used for more than 5000 years, and research on garlic extract is rapidly increasing because of its multiple biological functions. The in vivo effects of oral administration of garlic mixture (GM, water-soluble extract) on infectious bursal disease virus (IBDV)-infected specific pathogen free male white leghorn chicken were examined through histopathological, immunohistochemical, and Western blot analyses, and enzyme-linked immunosorbent assay. The results confirmed the protective effects of oral administration of 5 mg·kg⁻¹ BW GM (Group GM1) on bursal lesions after IBDV infection. In particular, protein expression of IBDV in the bursa decreased in Group GM1, indicating that GM administration decreased IBDV replication in the bursa. Furthermore, immunoglobulin M- and A-bearing B lymphocytes significantly increased 7 days post infection in bursae in Group GM1 (P<0.01), suggesting that the oral administration of 5 mg·kg⁻¹ GM offers moderate protection against B cell destruction after IBDV infection. During infection, the concentration of bursal interferon gamma (IFN-g) increased and peaked in Group GM1 earlier than in Group T (IBDV-exposed), demonstrating that GM administration prompted the production of IFN-g to protect against IBDV infection.     

家蚕生物反应器表达传染性法氏囊病病毒多聚蛋白的免疫原性研究

将传染性法氏囊病病毒(IBDV)浙江分离株JD1的多聚蛋白(VP2/4/3)基因克隆到家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中,重组载体与杆状病毒Bm-BacPAK6的线性化基因组DNA共转染家蚕细胞后,将获得的重组病毒BacPAK-A感染家蚕5龄起幼虫进行虫体内表达.用感染后第5日的蚕血淋巴作抗原制备油佐剂苗免疫14日龄非免疫鸡,安全性试验表明,接种1倍和5倍免疫剂量的试验鸡在临床反应和剖检中均无异常变化;在免疫-攻毒试验中设杆状病毒表达的IBDV VP2蛋白和正常蚕血淋巴免疫对照组,并于28日龄加强免疫,25 d后用IBDV强毒BC6/85攻击.通过临床保护率、病理保护率及血清学试验表明,基于多聚蛋白制备的疫苗更成功地诱导了体液免疫应答,比VP2蛋白对IBDV强毒的攻击具有更高的保护力,更适于作为IBD基因工程亚单位疫苗的抗原成分.     

抗鸡法氏囊和新城疫高免血浆的研制及疗效观察

利用欲淘汰的蛋鸡制备抗鸡传染性法氏囊病和鸡新城疫病的高免血浆,对该病的治疗具有疗效确切,作用迅速,无副作用等优点,为治疗法氏囊病和新城疫病开辟了新途径.     

中药"囊复康"对鸡IBD病理组织学影响的研究

将80只24日龄公雏随机分成A、B、C、D四组，观察各组鸡的临床症状，肌肉、肝、脾、肾及法氏囊特征病理变化。结果发现：攻毒后除A组轻微外，各组均出现腿肌条状或点状出血，肝、脾、肾及法氏囊肿大，但经治疗144h后剖解，A、B、C组肉眼病变消失，D组仍有病变且法氏囊萎缩。光镜观察，A、B、C组鸡的法氏囊病理组织学变化均明显好于D组，说明中药“囊复康”防治鸡IBD效果良好。     

传染性法氏囊病病毒超强毒地方株HN01的分离鉴定及分子系统进化分析

用分离的疑为鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)超强毒(vvIBDV)地方分离株HN01,经处理后接种SPF鸡,36h后接种鸡开始发病,发病率为100%,死亡率为70%以上。剖检可见与野外病例相同的病理变化,如肌肉、腺胃、心脏出血,法氏囊水肿且多呈"紫葡萄"样外观。经血清学试验、毒力试验、鸡胚接种试验、分子生物学和电镜形态学观察均证明该分离物为超强毒株,从而证明河南省鸡群中存在不同于IBDV一般强毒株、经典株和变异株的超强毒株。通过对IBDV不同毒株VP2基因高变区氨基酸序列的聚类分析发现,HN01与华南超强毒株G9201、欧洲超强毒株UK661关系最接近,而与HK46,OKYM,D6948,UPM92-04和KS等毒株关系依次渐远。     

鸡传染性法氏囊病病毒BJ-10株VP2基因的克隆及原核表达

【目的】克隆鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)BJ-10株VP2基因,构建其原核表达载体,并在大肠埃希菌中进行高效表达。【方法】根据IBDVVP2基因序列设计1对特异性引物,应用RT-PCR技术克隆IBDV BJ-10株VP2基因;将目的基因插入pMD18-T连接载体,筛选出阳性重组质粒;将该质粒克隆至原核表达载体pET-32α中,转化入JM109,经IPTG诱导表达,对产物进行SDS-PAGE电泳分析,确定IPTG的最佳诱导表达时间和浓度。【结果】克隆到了全长1 356bp的IBDV BJ-10株VP2基因;PCR、酶切鉴定分析表明,成功构建了重组质粒pET-32α-VP2;SDS-PAGE电泳分析表明,在宿主菌JM109中成功表达了约为60ku的VP2蛋白;IPTG诱导表达时间以4.5h为宜,诱导最佳浓度为0.8mmol/L。【结论】成功克隆了IBDV BJ-10株VP2基因,并在大肠埃希菌中表达了VP2蛋白。     

中成药法囊净防治鸡传染性法氏囊病的研究

利用中草药材,经粉碎加工制成“法囊净”散剂、丸剂或片剂.经过近1年的药物筛选和试验,又经过半年的实验室验证,证实中成药法囊净对鸡传染性法氏囊病的防治具有特效.对不同症状、不同年龄、不同品种的患病鸡只治愈率平均为99.63%,对健康鸡群的保护率达100%.对冶疗和用药前后各种生理指标的测定数据经过生物学统计比较(t测验)差异均不显著,证明该药配方无毒副作用.     

IBDV超强毒HZ株VP2基因的克隆和真核表达质粒的构建

利用反转录 -聚合酶链反应 (RT- PCR) ,扩增克隆传染性法氏囊病病毒超强毒 (vv IBDV) HZ株 VP2基因 ,并对 VP2基因进行全序列测定、序列分析和聚类分析 ,同时将VP2基因与真核表达载体 pc DNA3相连接。结果克隆到 VP2基因全序列长 1 356bp,分析表明 HZ株与欧洲超强毒株 UK661高度相似 ,同时将 VP2基因正向插入 pc DNA3的 CMV启动子下游 ,得到了 VP2基因的真核表达质粒。为 IBDV分子流行病学和基因工程疫苗的研究奠定了物质基础     

鸡新城疫病毒强毒株的分离与鉴定

从河北、天津、北京等省市发病鸡群中分离到8株有血凝性的分离物,其血凝作用可被新城疫阳性血清所抑制,而不能被AIV(H9亚型)、EDS76阳性血清所抑制,表明8株分离物均为新城疫病毒。利用鸡胚终点稀释法对这8株NDV进行了克隆。对8株NDV的毒力指数(MDT、ICPI、IVPI)测定结果显示:MDT在42 9～49 5h之间,ICPI在1 95～2 00之间,IVPI在2 68～2 89之间。表明8株NDV均为新城疫病毒强毒株,其毒力与标准强毒株F48E8相近。各分离毒株经2%磷钨酸负染后,电镜下观察,可见丝状、圆形或不规则形态的病毒粒子,表面有纤突样结构。各毒株的大小不尽相同,粒子直径或长轴在100～500nm之间。     

抗传染性法氏囊病病毒单克隆抗体特性的研究

试验采用琼脂免疫双扩散 ,酶联免疫吸附试验 ( EL ISA) ,病毒中和试验和 Western-blotting试验对 13株单克隆抗体 ( Monoclonal Antibody,Mc Ab)的特性进行了研究。试验结果表明 ,其中 9株 Mc Abs为 Ig G类 ,4株为 Ig M类 ;这些 Mc Abs仅与抗传染性法氏囊病病毒( Infectious Bursal Disease Virus,IBDV)发生特异结合 ,而与新城疫病毒 ( Newcastle DiseaseVirus,NDV)、传染性支气管炎病毒 ( Infectious Bronchitis Virus,IBV)和马立克氏病病毒 ( Marek'sDisease Virus,MDV)均不发生交叉反应 ,有 5株 Mc Abs具有中和 IBDV的活性 ,这 5株有中和活性的 Mc Abs识别的抗原位点在 IBDV的 VP2 上