玻璃化冷冻对小鼠GV期卵母细胞发育能力的影响

试验首次采用OPS法玻璃化冷冻小鼠GV期卵母细胞(不带卵丘细胞,下同),同时尝试用EDFS30对小鼠卵巢进行细管法玻璃化冷冻,以研究GV期卵母细胞冷冻后的发育潜力。首先,利用MEM培养和MEM-腔前卵泡培养新鲜GV期卵母细胞,并把较好的培养方式用于冷冻后培养试验。2种培养方式培养24h后新鲜GV期卵母细胞成熟率无显著性差异;OPS法冷冻的GV期卵母细胞解冻后成熟率及体外受精后卵裂率与对照组差异不显著(P>0.05)。细管法冷冻卵巢组织的GV期卵母细胞成熟率极显著低于对照组(P<0.01),其受精后未获得受精卵。结果表明:OPS法可有效地冷冻保存小鼠GV期卵母细胞,而细管法冷冻小鼠卵巢对GV期卵母细胞损伤较大。     

哺乳动物卵母细胞玻璃化冷冻保存的研究进展

综述了近年来关于哺乳动物卵母细胞玻璃化冷冻保存的研究进展,并对这项技术的发展前景进行展望。重点讨论了影响哺乳动物卵母细胞玻璃化冷冻保存的几种因素,包括冷冻保护剂的种类和浓度、冷冻方法和卵母细胞所处的发育阶段等,以及冷冻过程中细胞膜、微丝、微管、皮质颗粒、纺锤体和线粒体等出现的损伤。目前,玻璃化冷冻法存在的最主要问题是冷冻过程中造成超微结构不可逆转的损伤影响胚胎发育,亟待解决。     

哺乳动物卵母细胞玻璃化冷冻保存的研究进展

综述了近年来关于哺乳动物卵母细胞玻璃化冷冻保存的研究进展,并对这项技术的发展前景进行展望.重点讨论了影响哺乳动物卵母细胞玻璃化冷冻保存的几种因素,包括冷冻保护剂的种类和浓度、冷冻方法和卵母细胞所处的发育阶段等,以及冷冻过程中细胞膜、微丝、微管、皮质颗粒、纺锤体和线粒体等出现的损伤.目前,玻璃化冷冻法存在的最主要问题是冷冻过程中造成超微结构不可逆转的损伤影响胚胎发育,亟待解决.     

小鼠卵母细胞冷冻技术研究

采用PBS作为冷冻基础液,分别用甘油和二甲基亚砜(DMSO)作为冷冻保护液,在程序化冷冻保存和玻璃化冷冻保存条件下,研究小鼠生发泡期(GV期)卵母细胞的抗冻能力。结果表明,2种冷冻方法对小鼠GV期卵母细胞解冻后形态正常率和存活率无显著影响(P>0.05)。冷冻保护剂种类对小鼠GV期卵母细胞解冻后形态正常率无显著影响(P>0.05);但对存活率有显著影响,玻璃化冷冻采用二甲基亚砜作为冷冻保护液效果极显著优于甘油(P<0.01)。以冷冻效果较好的二甲基亚砜作为冷冻保护液,采用玻璃化冷冻不同发育阶段(GV期和MⅡ期)的小鼠卵母细胞,解冻后形态正常率无显著差异(P>0.05),但存活率GV期要显著优于MⅡ期卵母细胞(P<0.05)。     

发育阶段对牛卵泡卵母细胞冷冻效果的影响

研究了用3种不同方法（A法：程序冷冻法：B法：超快速冷冻法；C法：玻璃化冷冻法）冷冻保存的牛GV期和IVM卵母细胞的发育潜力，结果表明，无论采取哪种方法。GV期卵母细胞的发育潜力均显著低于IVM卵母细胞。三种冷冻方法中，以玻璃化冷冻为最佳。     

小鼠卵母细胞和胚胎不同冷冻方法的比较研究

探讨程序化冷冻与玻璃化冷冻对小鼠GV期卵母细胞及二细胞期胚胎的复苏率及其发育潜能的影响。通过小鼠的卵母细胞与早期胚胎的不同冷冻方法的比较,为后续阿旺绵羊的胚胎冷冻保存提供参考。采用程序化冷冻与玻璃化冷冻技术,分别冷冻小鼠GV期卵母细胞及二细胞期胚胎,复苏后培养,比较不同冷冻处理后的复苏率、成熟率与囊胚率。小鼠GV期卵母细胞程序化冷冻复苏率(48.00%±5.29%)显著低于玻璃化冷冻复苏率(65.00%±5.00%),有统计学差异(P=0.0147<0.05);而程序化冷冻后复苏卵母细胞的发育成熟率略高于玻璃化冷冻组,但无统计学意义。小鼠二细胞期胚胎程序化冷冻组复苏率(76.00%±2.00%)显著高于玻璃化冷冻组复苏率(70.00%±2.00%),有统计学差异(P=0.0213<0.05);冷冻后复苏胚胎发育的囊胚率程序化冷冻略低于玻璃化冷冻及对照组,但无统计学意义。     

猪卵母细胞OPS玻璃化冷冻保存的研究

为了研究猪卵母细胞的开放性拉长脉管(OPS)玻璃化冷冻保存,试验采用不同的冷冻保护剂对比生发泡期(GV期)(体外成熟12 h)和成熟期(MⅡ期)(体外成熟48 h)猪卵母细胞的冷冻保存效果。结果表明:GV期猪卵母细胞的冷冻保存效果要优于MⅡ期和未经体外培养的猪卵母细胞;不同的冷冻保护剂相比,5%PVP+梯度乙二醇的冷冻保存效果最好。     

牛GV期卵母细胞冷冻保存后发育潜力的研究

二甲基亚砜(DMSO)、丙二醇(PROH)、乙二醇(EG)和甘油(GL)4种冷冻保护剂程序化冷冻牛GV期卵母细胞的结果表明,EG和PROH的保护效果比GL和DMSO好。4种不同冷冻方法冷冻保存牛GV期卵母细胞,比较解冻后卵母细胞的体外成熟率、受精后卵裂率。结果表明,在程序化冷冻法与细管玻璃化法(Straw)之间的差异不显著(P>0.05),在开放式拉管法(OPS)与毛细玻管法(GMP)之间的差异不显著(P>0.05);但OPS和GMP与程序化冷冻法和Straw之间的差异极显著(P<0.01)。玻璃化冷冻效果优于程序化冷冻。说明GMP和OPS玻璃化冷冻优于Straw玻璃化冷冻。说明可以采用GMP方法冷冻保存牛GV期卵母细胞。     

卵母细胞玻璃化冷冻保存的研究进展

随着许多哺乳动物卵母细胞冷冻的成功,哺乳动物卵母细胞玻璃化冷冻保存技术取得了不断发展。作者列举比较了开口式拉长细管法、电镜铜网法、固体表面法和尼龙环法等多种卵母细胞的玻璃化冷冻保存方法,并对影响卵母细胞玻璃化冷冻保存的细胞骨架等因素进行了阐述。讨论后提出自己的建议。     

猪卵母细胞玻璃化冷冻保存的研究进展

卵母细胞冷冻保存对于畜牧业生产和人类辅助生殖具有重要意义。随着玻璃化冷冻技术日趋成熟，其现已广泛应用于牛、羊等大家畜的卵母细胞冷冻保存。然而，猪卵母细胞的冷冻保存至今仍处于试验研究阶段，由于猪卵母细胞脂质含量高，对低温敏感，在玻璃化冷冻保存过程中极易受到冷冻保护剂毒性以及渗透胁迫、氧化应激等损伤，造成细胞骨架以及亚细胞器受损，最终导致细胞发育能力降低甚至死亡。近年来，人们在提高猪卵母细胞冷冻保存效率的研究中取得了突破性进展。本文简要介绍了卵母细胞冷冻保存的常见方法及作用机理，总结了猪卵母细胞在玻璃化冷冻过程中造成的细胞损伤类型及影响，概述了人们针对不同类型的冷冻损伤提出的解决方法和取得的成就，并对其应用前景进行展望，为今后提高猪卵母细胞的玻璃化冷冻效率提供新思路。     

不同冷冻方法对GV期绵羊卵母细胞发育效果的影响

卵母细胞冷冻保存具有广泛而潜在的应用价值。文章主要分析了不同冷冻方法对绵羊GV期卵母细胞发育效果的影响。GV期卵母细胞程序化冷冻解冻后形态正常率（54.8%）和体外培养成熟率（14.7%）均显著或极显著低于细管玻璃化冷冻（71.8%,29.5%;P〈0.05）和OPS玻璃化冷冻（78.3%,P〈0.01;35.4%,P〈0.05）;3种不同方法冷冻GV期卵母细胞成熟率与对照组相比均差异极显著（P〈0.01）。     

云岭山羊卵母细胞玻璃化冷冻的研究

试验以屠宰场云岭黑山羊卵巢卵母细胞为材料,研究其玻璃化冷冻的效果。试验中选用20% EG+20% DMSO为冷冻液、冷冻环为载体,以20 s、40 s玻璃化时间冷冻GV和MⅡ期的卵母细胞。结果表明,GV期卵母细胞的形态正常率、成熟率和卵裂率都很低,且解冻成熟培养后冷冻组的成熟率和卵裂率极显著低于对照组(P<0.01)。而MⅡ期卵母细胞冷冻效果较好,毒性试验组和冷冻组形态正常率分别为91.1%和83.3%,明显高于GV期;孤雌激活后毒性组卵裂率与对照组无显著性差异(P>0.05),冷冻组的卵裂率显著低于对照组(P<0.05)。用20 s、40 s玻璃化时间冷冻的卵母细胞解冻后GV和MⅡ期各组均无显著差异。根据试验结果得出在冷冻保存中最好冷冻MⅡ期的卵母细胞,以便提高后期的卵裂率和囊胚率;卵母细胞玻璃化时间在40 s内均不影响卵母细胞的活力和发育潜力。     

羊卵母细胞冷冻保存研究进展

哺乳动物卵母细胞冷冻保存不仅对于濒危物种的保存具有重要意义,而且可以对胚胎生物技术的发展、生物资源保护与利用以及人类辅助受精技术的研究等具有重要意义,同时为基础研究提供大量可利用的材料.卵母细胞玻璃化冷冻保存的应用前景非常广阔,利用卵母细胞玻璃化冷冻保存技术建立"卵子库"不仅可以解决目前卵母细胞来源短缺的问题,还可以使其它生物技术如体外受精、克隆和转基因动物生产不受时间和空间的限制,并且代替家畜的活体保种和濒危动物遗传种质资源保存.在人类医学上,卵母细胞的冷冻保存将会为那些由于病理或其他原因而造成不孕的病人提供一个挽救生育的机会.     

去脂对猪卵母细胞和胚胎玻璃化冷冻的影响

卵母细胞和胚胎冷冻保存技术在动物种质资源保存、濒危动物保护等方面具有独特的作用。本文综述了猪卵母细胞和胚胎的玻璃化冷冻及去脂技术,以期为后续研究提供参考,提高冷冻成功率。     

玻璃化冷冻对哺乳动物MⅡ期卵母细胞表观遗传学的影响

玻璃化冷冻作为一种操作简单、成功率高的细胞保存方式具有诸多优点，广泛应用于农业、医学、生物等领域。但相较于新鲜卵母细胞，玻璃化冷冻后的卵母细胞仍存在许多问题，如玻璃化冷冻后的卵母细胞妊娠率和产活仔率低于新鲜的卵母细胞、基因表达异常等。表观遗传学是研究基因在核苷酸序列不发生改变的情况下基因表达的可遗传变化的一门学科。表观遗传修饰在不改变DNA序列的情况下使基因和环境之间产生相互作用。在体外胚胎生产过程中，外界环境因素会对表观遗传修饰造成影响。作者从表观遗传学方面综述了玻璃化冷冻对哺乳动物MⅡ期卵母细胞DNA和全基因组甲基化、组蛋白甲基化和乙酰化、磷酸化及泛素化、基因印迹、microRNA的影响，以及玻璃化冷冻MⅡ卵母细胞后表观遗传修饰的改变对转录过程中基因的表达影响，为揭示并调控玻璃化冷冻卵母细胞后表观遗传修饰事件、进一步提高玻璃化冷冻后卵母细胞的质量提供参考。     

玻璃化冻存对驴卵母细胞超微结构的影响

试验旨在探究玻璃化冷冻对驴卵母细胞发育的影响,寻求驴卵母细胞冷冻的最佳条件。通过对不同发育时期的驴卵母细胞进行玻璃化冷冻,冷冻复苏后分别进行成熟培养和孤雌激活,并对GV期未冷冻组(对照组)、GV期冷冻组、IVM-MⅡ冷冻组卵母细胞微丝和线粒体超微结构进行免疫荧光标记,统计冷冻复苏后卵母细胞形态正常率、成熟率、孤雌激活卵裂率、超微结构正常率。结果表明,GV期冷冻组卵母细胞的形态正常率与GV期未冷冻组(对照组)间无显著差异(P0.05),成熟率和卵裂率均显著低于对照组(P0.05);IVM-MⅡ冷冻组的卵裂率显著低于对照组(P0.05),且卵裂后细胞发育受到阻滞。冷冻组微丝在皮质区分布明显减少的卵母细胞数目增多,冷冻组卵母细胞的线粒体数量明显低于对照组,由此可以说明冷冻对卵母细胞超微结构有损伤,从而导致复苏后成熟率下降,影响卵母细胞的受精和体外发育,且GV期冷冻组较IVM-MⅡ冷冻组在微丝与线粒体结构上有较小损伤,发育状态较好。     

猪卵母细胞在GV期与MⅡ期的冷冻保存效果比较研究

为比较猪卵母细胞在GV期与MⅡ期的冷冻保存效果,试验在这两个成熟阶段对其进行玻璃化冷冻,GV期卵母细胞解冻后培养至成熟,MⅡ期卵母细胞解冻后恢复2 h,然后采用免疫荧光标记、Western blotting和链霉蛋白酶溶解方法分别检测它们的皮质颗粒分布、CD9蛋白表达水平和透明带消化时间上的差异。结果表明,GV期卵母细胞在解冻后2 h的存活率显著低于MⅡ期卵母细胞（P<0.05）,但极体排出率与对照卵母细胞无明显差异（P>0.05）;在冷冻MⅡ期卵母细胞中,皮质颗粒的皮质区分布比例和CD9的蛋白表达水平显著下降（P<0.05）,但冷冻GV期卵母细胞经体外成熟后则无明显变化（P>0.05）;冷冻GV期与MⅡ期卵母细胞均不会影响透明带的消化时间（P>0.05）。由此可见,猪卵母细胞在GV期的冷冻存活率虽然较MⅡ期低,但其体外成熟后极体排出率、皮质颗粒分布和CD9蛋白表达水平均未受到冷冻的影响。     

玻璃化冷冻对哺乳动物卵母细胞Ca~(2+)的影响机制

卵母细胞冷冻保存是胚胎生物技术(如体外受精、胞浆内单精子注射、体细胞克隆)的重要组成部分,对优良种畜和濒危动物种质资源保存,加速家畜品种改良进程都具有重要意义。与常规冷冻法相比,玻璃化冷冻具有操作简单、降温速率快、耗时短、冷冻效率高等优点,被越来越广泛地应用于家畜卵母细胞的冷冻保存。然而,与新鲜卵母细胞相比,玻璃化冷冻卵母细胞的受精率及发育能力仍不理想,这严重影响了玻璃化冷冻卵母细胞的应用潜力。玻璃化冷冻会引起卵母细胞Ca~(2+)浓度升高及钙振荡模式异常,导致其透明带硬化、受精信号紊乱等问题。综合前人研究进展,作者分析了玻璃化冷冻对胞内Ca~(2+)浓度、钙振荡模式的影响和作用机制,并指出胞外Ca~(2+)内流和胞内钙库Ca~(2+)释放是导致冷冻卵母细胞胞内Ca~(2+)浓度升高的主要原因,1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)Ⅰ型受体分布异常和线粒体损伤可能是导致冷冻卵母细胞钙振荡模式异常的重要原因,以期为正向调控冷冻卵母细胞Ca~(2+)浓度及钙振荡模式提供技术参考,从而进一步提高玻璃化冷冻卵母细胞的受精和后续的发育能力。     

玻璃化冷冻对哺乳动物卵母细胞Ca2+的影响机制

卵母细胞冷冻保存是胚胎生物技术(如体外受精、胞浆内单精子注射、体细胞克隆)的重要组成部分,对优良种畜和濒危动物种质资源保存,加速家畜品种改良进程都具有重要意义。与常规冷冻法相比,玻璃化冷冻具有操作简单、降温速率快、耗时短、冷冻效率高等优点,被越来越广泛地应用于家畜卵母细胞的冷冻保存。然而,与新鲜卵母细胞相比,玻璃化冷冻卵母细胞的受精率及发育能力仍不理想,这严重影响了玻璃化冷冻卵母细胞的应用潜力。玻璃化冷冻会引起卵母细胞Ca²⁺浓度升高及钙振荡模式异常,导致其透明带硬化、受精信号紊乱等问题。综合前人研究进展,作者分析了玻璃化冷冻对胞内Ca²⁺浓度、钙振荡模式的影响和作用机制,并指出胞外Ca²⁺内流和胞内钙库Ca²⁺释放是导致冷冻卵母细胞胞内Ca²⁺浓度升高的主要原因,1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)Ⅰ型受体分布异常和线粒体损伤可能是导致冷冻卵母细胞钙振荡模式异常的重要原因,以期为正向调控冷冻卵母细胞Ca²⁺浓度及钙振荡模式提供技术参考,从而进一步提高玻璃化冷冻卵母细胞的受精和后续的发育能力。     

玻璃化冷冻对绵羊卵母细胞中母源基因mRNA表达量的影响

为详细了解玻璃化冷冻对绵羊卵母细胞中母源基因mRNA表达量的影响,分别玻璃化冷冻GV期和IVM 期(18、24 h)绵羊卵母细胞,解冻后进行体外培养.GV期和IVM期卵母细胞经过冷冻-解冻后,卵裂率(10.37％、23.17％、33.07％)均极显著低于对照组(82.96％,P＜0.01),且冷冻-解冻后的GV期卵母细胞卵裂率极显著低于冷冻-解冻后的IVM期卵母细胞(P＜0.01).本试验利用荧光实时定量PCR技术检测4种母源基因:Gdf9(生长分化因子-9)、Zar1(合子阻泄因子)、Mater(胚胎必要的母体抗原)、Dnmt1(DNA甲基化转移酶1)在不同处理后的绵羊卵母细胞中的mRNA含量.结果表明,4个基因的mRNA在GV期的表达量均高于IVM期的卵母细胞(P＜0.01);经玻璃化冷冻处理后,4个基因的mRNA表达量升高,其中GV期含量最高(P＜0.01).结果提示,绵羊GV或IVM期卵母细胞玻璃化冷冻导致母源基因mRNA表达量升高,可能会对胚胎发育产生负面影响.