中国水稻白叶枯病菌小种C8菌株无毒基因的分离及功能鉴别

 白叶枯病菌与水稻间的互作符合基因对基因模式,不同小种中存在特异的avrBs3/pthA家族基因。对中国水稻白叶枯病菌小种C8菌株基因组DNA进行BamHⅠ酶切和Southern杂交,发现了其特有的约6.0 kb大小、含avrBs3/pthA家族基因的信号条带。经文库筛选、Southern杂交和限制性酶切分析,获得了C8小种avr/pthC8a基因。将该基因导入菲律宾小种6 的代表菌株PXO99A中,发现avr/pthC8a可使PXO99A丧失对水稻品种Asominori（携有成株期抗性基因Xa17）的毒性,暗示avr/pthC8a可能是与Xa17相应的无毒基因。序列分析发现,avr/pthC8a基因大小为3816 bp,编码1272个氨基酸,由102 bp编码的34个氨基酸重复单元在基因内的重复数为20.5个,其3′端的BamHⅠ酶切位点由GGATCC突变为AGATCC,其他特征均与avrBs3/pthA家族的成员相似,即C端存在1个亮氨酸拉链、3个核定位信号和1个酸性转录激活域。avr/pthC8a基因3′端的BamHⅠ酶切位点发生突变在avrBs3/pthA家族基因中鲜有报道。中国C8小种avr/pthC8a基因的发掘,为进一步了解水稻黄单胞菌毒性变异以及avrBs3/pthA家族基因的进化提供了理论依据。     

利用分子标记技术聚合2个白叶枯病基因改良华占的白叶枯病抗性

以镇084和IRBB5为白叶枯病抗性基因的供体亲本,华占为受体亲本,通过杂交、二次回交,再进行一次复交,在分离世代利用分子标记辅助选择技术、白叶枯病菌接种鉴定和农艺性状筛选等措施,育成携带xa5、Xa7和xa5+Xa7基因的改良株系各1个,并对改良株系进行了抗白叶枯病鉴定。结果表明,分别携带xa5、Xa7基因的改良株系B1和B2对菌株PXO99均表现为高感,对其他4个菌株都表现为高抗或抗;携带xa5+Xa7基因的株系B3对PXO99表现为中感,对其他4个菌株都表现为高抗,抗性水平明显好于仅携带单基因的B1和B2。     

利用功能标记鉴定普通野生稻中的白叶枯病抗性基因

 以9个菲律宾白叶枯病菌小种对供试的9份普通野生稻（Oryza rufipogon Griff.）及1份高感白叶枯病材料IR24进行抗性鉴定,发现IR24对所有的菌株都表现为高感, 6份野生稻材料对9个菌株表现全抗,占参试野生稻总数的67%。取自广西玉林的1份材料只感PXO280(P8),海南万宁的1份材料感PXO71(P4),广州高州的1份材料对PXO79、PXO99和PXO339感病,而这几份材料对其余菌株都表现为抗病,说明每份材料至少含有1个抗性基因。利用已克隆的白叶枯病抗性基因xa5、xa13、Xa21和Xa27的功能标记检测,结果表明9份供试普通野生稻中都不含抗性基因xa5、Xa21;5份为显性Xa13纯合体,4份为隐性抗病xa13杂合体;5份为抗病显性Xa27纯合体,3份为隐性xa27纯合体,1份材料中xa27和Xa27都不存在。     

疣粒野生稻抗白叶枯病新基因的初步鉴定

以10个菲律宾白叶枯病菌小种和1个中国白叶枯病菌小种为供试菌系,以高感白叶枯病水稻品种IR24及携有不同抗白叶枯病基因的近等基因系IRBB1等16个材料作为参照,对粳稻品种8411/疣粒野生稻体细胞杂交获得的两个抗白叶枯病新种质SH5和SH76进行了白叶枯病抗谱鉴定。结果表明SH5和SH76在苗期的抗谱较广,并且与已知抗病基因的抗谱不同,但与IRBB5(xa5)和IRBB7(Xa7)相似。分别用xa5和Xa7的分子标记2F_1R和M5进行检测,确定SH5和SH76中不含有xa5和Xa7基因。初步推测SH5、SH76可能含有一个新的抗病基因或者一个连锁的基因簇群。     

多基因聚合育成优质高产杂交稻新组合中优161

通过文献检索和基因标记检测,判定水稻品种特青和抗白叶枯病基因聚合品系IRBB51所携带的有利基因,其中特青携带抗稻瘟病基因Pib和Pita、抗白叶枯病基因Xa4,IRBB51携带抗稻瘟病基因Pib、抗白叶枯病基因Xa4和xa13、优质基因wx。建立了特青/IRBB51重组自交系群体,育成在5个目标基因座位上均携带有利等位基因的恢复系中恢161,与不育系中9A配组育成优质、高产的杂交稻新组合中优161,于2009年通过国家农作物品种审定。研究表明,综合利用不同水稻材料携带的共有有利基因和互补有利基因,可快速有效地实现多性状有利基因的聚合。     

云南高海拔粳稻区白叶枯病菌致病力差异分析

云南高海拔粳稻区白叶枯病危害日益严重,为了探明该区域白叶枯病菌致病力差异,对白叶枯病进行有效防控。利用15个水稻白叶枯病菌鉴别品种,对采集自海拔1800 m以上稻区11个水稻品种上的32份菌株进行致病力研究。结果发现,致病力最强的菌株是楚雄州的CX28-3和CX30-1,致病率为73.33%;最弱的是大理州剑川县的JC12-2,致病率为0。在高海拔粳稻区,菌株的致病力分化与采集地的海拔高度无关,却与地理距离、采集品种的推广面积有关;而菌株的致病型频率与其采集地的海拔、经纬度、采集品种的推广面积的相关性均不显著。鉴别品种毫糯扬(含新基因)、IRBB14(Xa14)、IRBB4(Xa4)和Tetep(Xa2,Xa16)对所有参试菌株表现为高抗或抗。因此,这些品种内所含的抗性基因值得在云南高原粳稻育种和生产中应用,特别是云南地方稻种毫糯扬,更应加强其新抗病基因的定位和克隆,以为品种选育提供新的抗原。     

不同遗传背景籼稻白叶枯病抗性基因Xa21、Xa23品系的抗性评价

以含有水稻白叶枯病抗性基因Xa21和Xa23的材料为供体,以课题组选育不含Xa21或Xa23基因的材料为受体,通过杂交、复交等方法,并采用分子标记辅助选择（molecular marker-assisted selection,MAS）世代选择,将含有Xa21和Xa23基因的材料、含与不含Xa21或Xa23基因的姊妹系接种7种广泛使用的白叶枯病菌种生理小种,分析了这些材料白叶枯病的抗性。研究表明含有抗性基因Xa21的水稻材料抗性累计（HR、R、MR）所占比例依次为菌株HNA1-4、PXO86（84.62%）>YN24（82.14%）>GD1358（73.08）>PXO99（67.86%）>GDA2（63.33%）>FuJ（6.67%）,表明含Xa21基因材料对菌株FuJ所诱发的白叶枯病基本无抗病能力,但对于其他菌株,仍有36.67%~15.38%的材料易感病;含Xa23基因的材料在所有诱发菌株中抗性累计（HR、R、MR）均在76%以上,仍有23.02%~15.52%的材料对7种诱发菌株没有抗性。通过对菌斑长度变异系数大小的分析,表明含有Xa21或Xa23基因的材料对不同菌株抗病能力或对同一菌株的抗病能力不同材料有较大的变化。通过对诱发白叶枯病菌株间菌斑长度的相关性分析,表明含有Xa21的材料菌株GDA2或HNA1-4与对应的其他6菌株之间达到了显著或极显著正相关,含有Xa23基因的材料菌株YN24、GD1358、PXO86与对应的其他6种菌株间呈极显著正相关,含此2类基因材料抗性鉴定选取对应菌系可以提高选育效率。通过对姊妹系的分析表明,Xa21或Xa23基因的白叶枯病抗性与选育材料的背景有关。相关性分析表明,Xa21基因的材料抗性与亲本材料呈极显著正相关（R=0.5725^**）,Xa23基因材料抗性与亲本材料呈显著正相关（R=0.2212^*）。     

杧果炭疽病菌漆酶基因Cglac3序列特征及其在两个侵染相关基因突变体中的表达分析

本研究运用同源克隆技术克隆了杧果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）的Cglac3漆酶基因,并采用实时荧光定量PCR分析了该基因在侵染过程、漆酶基因LAC1突变体、外切葡聚糖酶基因CgCBH1突变体中的差异表达情况。结果表明,杧果炭疽病菌漆酶Cglac3基因大小为1842 bp,含3个内含子,大小分别为56、51、58 bp。Cglac3开放读码框编码558个氨基酸,蛋白分子量为61.38 kDa,等电点（PI）为4.50。与未侵染对照0 h的表达量相比,Cglac3在6 h孢子萌发形成附着胞时表达量迅速升高,在12 h侵入寄主后达到最高,之后在菌丝扩展、叶片显症过程中出现波动,但均远高于0 h的表达量,显示Cglac3在侵染的不同阶段均发挥着重要的作用,可能是胶孢炭疽菌的重要致病因子之一。与野生型相比,Cglac3表达量在杧果炭疽病菌漆酶基因LAC1敲除突变体中下降了74%,在外切葡聚糖酶基因CgCBH1敲除突变体中下降了56%;在CgCBH1缺失敲除突变体中,LAC1的表达下降了68%,与Cglac3的表现趋势一致,说明Cglac3的表达受LAC1调控,外切葡聚糖酶基因CgCBH1也会影响Cglac3和LAC1的表达。     

水稻抗白叶枯病基因Xa3/Xa26家族成员的表达模式分析

 水稻抗白叶枯病基因Xa3/Xa26是一个多基因家族的成员。为了检测该基因家族中是否可能存在其他抗病基因和这些成员可能发挥功能的部位,系统研究了Xa3/Xa26基因家族成员的表达模式。将籼稻品种明恢63、特青、93 11和粳稻品种日本晴中Xa3/Xa26基因家族的13个成员（MRKa、Xa3/Xa26、MRKc、TRKa、TRKb、TRKc、9RKa、9RKb、9RKe、NRKa2、NRKe、NRKf1和NRKf3）的启动子与编码绿色荧光蛋白（GFP）的报告基因进行融合表达,通过农杆菌介导的遗传转化方法将不同启动子调控的报告基因分别导入水稻。通过检测GFP表达,分析这些家族成员的组织特异性表达模式,发现Xa3/Xa26基因家族成员的表达模式基本一致,主要集中在水稻各组织的维管束细胞及其周围细胞中。Xa3/Xa26基因家族的表达模式与抗维管束病原菌（如白叶枯病菌）基因的功能非常吻合。这种表达模式为寄主进化过程中,从该家族不断产生新的抗病基因提供了重要信息。     

香蕉枯萎病菌4号生理小种smy1基因的功能分析

Smy1是一种参与调控真菌生长的驱动蛋白。本研究克隆了香蕉枯萎病菌4号生理小种（Foc 4）驱动蛋白基因smy1,并采用同源重组技术获得smy1敲除的野生型Foc 4的smy1敲除突变体。通过测定突变体菌丝形态、生长速度、产生孢子量、对香蕉苗的致病力及对氰烯菌酯的敏感性,用于研究smy1在香蕉枯萎病菌的生长发育及对氰烯菌酯抗药性中的作用。结果表明,与野生型Foc 4相比,smy1敲除突变体生长缓慢、菌丝畸形、产孢量增加,对巴西蕉苗的致病力减弱,但对氰烯菌酯的抗性水平变化不大。由此推断smy1基因可能在Foc 4的生长发育、产孢以及致病力等方面具有重要作用。     

利用CRISPR/Cas9技术创制高效抗除草剂水稻

【目的】培育抗除草剂品种在水稻育种中具有重要意义。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,以黑龙江优质粳稻品种为材料,编辑乙酰乳酸合酶ALS基因,创制具有抗除草剂特性的水稻材料。【方法】利用CRISPR/Cas9技术,以乙酰乳酸合酶ALS为靶基因,构建单碱基突变载体pH-nCas9-PBE-ALS,以松粳22、龙粳46和绥粳18为转化材料,利用农杆菌介导转化获得转基因植株,通过对转基因植株的突变位点进行测序结合除草剂喷施试验,鉴定基因型及表型。【结果】经分子水平检测验证,获得ALS^S627N突变植株10株,ALS^S627N且¹⁸⁸⁴G-A但第628位氨基酸未改变突变植株1株,ALS^S627N/G628E突变植株1株。相较于野生型,以上三类突变植株均具有较强抗除草剂特性。【结论】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得具有抗除草剂特性,能够稳定遗传,不含转基因标记的纯合株系,可为抗除草剂水稻育种提供基础材料。     

持有Pi9基因的水稻单基因系IRBL9-W对稻瘟病菌苗期和成株期抗性差异

[目的]Pi9是一个广谱稻瘟病抗性基因,田间病圃监测发现持有Pi9的水稻单基因系IRBL9-W在苗期高抗稻瘟病,但却感穗瘟.探明水稻单基因系IRBL9-W在苗期抗病而孕穗末期感染穗颈瘟的原因,为Pi9基因在水稻抗病育种中的有效利用提供参考.[方法]利用从IRBL9-W穗颈瘟病斑上分离的8个单孢菌株以及实验室保存的单孢菌...     

水稻直链淀粉合成调控新基因Wx410的功能与效应分析

【目的】挖掘Wx新等位变异,明确Wx410新等位基因对稻米品质性状的影响。【方法】以Wx^lv、Wx^a和Wx^b等位基因为模板,利用PCR进行第10外显子第101位碱基的A-G单点突变,分别构建了不同Wx等位背景下的Wx410定点突变植物表达载体p EGFC-Wx^lv410、p EGFC-Wx^a410和p EGFC-Wx^b410,阳性对照组载体分别为p EGFC-Wx^lv、p EGFC-Wx^a和p EGFC-Wx^b。通过转化糯稻品种苏御糯,分析该位点的变异对稻米品质的遗传效应。【结果】花后7 d和14 d,转基因植株p EGFC-Wx^lv410,p EGFC-Wx^a410及p EGFC-Wx^b410的胚乳Wx基因表达量较各自的阳性对照材料无显著变化,而颗粒结合淀粉合酶活性极显著降低;转基因植株直链淀粉含量较野生型显著降低,而糊化温...     

硫藤黄链霉菌St-79对水稻白叶枯病的防效和促生作用

【目的】水稻白叶枯病是水稻的主要细菌性病害之一,严重影响水稻生产。本研究获得一株有效防治水稻白叶枯病的放线菌菌株,探索其对白叶枯病的防效和促进水稻生长的作用,为生防菌的开发利用提供科学依据。【方法】利用梯度稀释涂布法、共培养法和牛津杯法筛选拮抗水稻白叶枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae,Xoo)的放线菌菌株;通过形态特征、生理生化反应、16Sr DNA序列和系统发育树分析对其进行分类鉴定;利用共培养法分析目标菌株的抗菌谱;通过96孔板微量稀释法、扫描电子显微镜、微生物粘附碳氢化合物法等探究目标菌株的抑菌作用;通过发酵滤液浸种与菌液喷洒土壤的方法探究其对水稻生长的促进作用;利用盆栽试验探索目标菌株发酵滤液对水稻白叶枯病的防治效果。【结果】从不同生境土壤中分离出140株放线菌菌株,最终筛选得到一株对Xoo具有强拮抗活性的放线菌菌株St-79,其发酵滤液抑菌圈直径为64mm,并鉴定其为硫藤黄链霉菌(Streptomycesthioluteus)。菌株St-79对水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzicola)、大豆细菌性斑疹病菌(Xa...     

应用CRISPR/Cas9技术与分子标记辅助选择创制广东丝苗米新种质

【目的】创制优质香型丝苗米水稻新种质，探索水稻育种改良新途径，助力广东丝苗米品牌建设。【方法】以广东省农业主导品种粤农丝苗(YNSM)与优质稻粤王丝苗(YWSM)为材料，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术定点编辑上述品种的香味基因Badh2，创制香稻新品系，随后通过分子标记辅助选择(MAS)技术定向导入GW7/GL7位点，系谱选育优质香型丝苗米水稻新种质。【结果】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功创制两个香稻新品系yn-ko^badh2与yw-ko^badh2，其2-AP含量均极显著提高，达到239.39～440.79μg/kg，而有效穗数、每穗实粒数、糙米外观品质、千粒重与产量等主要农艺性状均未受到显著影响；MAS技术结合系谱选育的方法成功选育两个丰产性好、籽粒长宽比超过4.3的优质香型丝苗米水稻新品系NW^badh2GW7-1与NW^badh2GW7-2，达到广东丝苗米品种关于香味与外观粒型的认定标准。【结论】利用CRISPR/Cas9基因编辑与分子辅助选择技术相结合可精准、高效地创制新的优...     

不同氮肥水平下优质高产软米粳稻的产量与品质差异

【目的】明确优质高产软米粳稻的产量和品质对氮肥的响应特征。【方法】在前期品种筛选的基础上，选择2个优质食味高产型软米品种为研究对象，设置60 kg/hm²(N1)、120 kg/hm²(N2)、180 kg/hm²(N3)、240 kg/hm²(N4)、300 kg/hm²(N5)与360 kg/hm²(N6) 6个氮肥(以纯氮计)水平，对其产量性状和品质指标进行了测定与分析。【结果】依赖于单位面积穗数、每穗粒数和群体颖花量的协同增加，软米产量在N5下最高，但与N4间无显著差异。随施氮量增加，米粒的外观、黏度、平衡度和食味值呈先增后减，而硬度则先减后增，并在N4或N5下出现峰值;出糙率、出精率和整精米率均随施氮量增加而提高，但垩白米率和垩白度呈先降后增，并在N5水平下最低。随施氮量的增加，直链淀粉含量和胶稠度下降，蛋白质含量升高。米粉峰值黏度、热浆黏度、崩解值和最终黏度随施氮量的增加呈先增后减，在N4或N5下最高。【结论】因此，优质食味软米在240 kg/hm²和300 kg/hm²条件下取得产量和品质的协调，240 kg/hm²是品质、产量和效益兼顾的最佳施氮量。     

利用分子标记辅助选择培育优良食味、低谷蛋白香粳稻新品系

【目的】选育低谷蛋白新品种是功能性水稻育种的一个重要方向。为满足肾脏病患者对人体健康和稻米品质的需求,迫切需要在育种中加强对功能性和食味品质的协同改良。【方法】以具有低直链淀粉含量基因Wx^mp和香味基因fgr的优良食味粳稻品种南粳46与含低谷蛋白基因Lgc1的日本粳稻品种LGC-1杂交、回交,利用与目标基因共分离的分子标记进行跟踪检测并结合田间选择,在BC₂F₆获得5个新品系。以亲本南粳46和LGC-1为对照,对新品系的农艺、产量、品质性状进行分析。【结果】与LGC-1相比,新品系的谷蛋白含量和可吸收蛋白含量相当,食味品质得到显著提升,且综合性状优良,表现出较高的产量潜力,适宜在江苏不同稻区进行种植。【结论】分子标记辅助选择作为一种快速、准确、有效的方法,与常规育种技术紧密结合,能够显著提高优质、高产、低谷蛋白水稻品种的选育效率。