缺氧条件下巨噬细胞移动抑制因子对肉鸡心肌脂肪酸代谢的影响

旨在探讨缺氧条件下巨噬细胞移动抑制因子(MIF)对肉鸡心肌脂肪酸代谢的影响。取9~12日龄鸡胚,采用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶联合消化法分离培养心肌细胞,镜下观察细胞形态及活力,并对其进行免疫细胞化学鉴定。以低氧诱导因子1α(HIF-1α)为缺氧指标,化学缺氧模拟剂氯化钴(CoCl_2)处理鸡胚心肌细胞,构建细胞缺氧模型。为了确认MIF与磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)的关系,在缺氧模型上用MIF抑制剂(ISO-1)阻断MIF,观测p-AMPK是否随MIF阻断而变化。利用Western bolt检测脂肪酸代谢关键酶脂肪酸转运酶(FAT/CD36)、磷酸化乙酰辅酶A羧化酶(p-ACC)及肉毒碱棕榈酰转移酶(CPT-1A)是否在缺氧状态下发生变化。结果:经差速培养的鸡心肌细胞纯度达90%以上;镜下观察,细胞呈梭形和不规则形,并可自发节律性搏动,频率80~130次·min~(-1)。Western bolt检测显示,经600μmol·L~(-1) CoCl_2处理心肌细胞24h,HIF-1α表达较正常对照组极显著升高(P0.01);100μmol·L~(-1) ISO-1阻断MIF后,MIF及p-AMPK表达量均明显降低(P0.01)。与正常组相比,缺氧组心肌MIF、p-AMPK、FAT/CD_(36)、p-ACC和CPT-1A表达均极显著升高(P0.01);ISO阻断组心肌各目的蛋白质的表达较缺氧组均极显著下降(P0.01)。缺氧条件下,心肌自分泌MIF增多,通过激活AMPK促进脂肪酸相继进入细胞质和线粒体,加强氧化供能,为缺氧提供代偿性保护。     

维生素C对肉鸡缺氧肺动脉平滑肌细胞缺氧诱导因子-1α转录水平的影响

旨在体外培养肉鸡肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)的基础上利用氯化钴(CoCl2)建立细胞缺氧模型,探讨维生素C(VC)对缺氧肉鸡PASMCs中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)及其下游靶基因血管内皮生长因子(VEGF)及血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)mRNA转录的影响。选用21d健康AA肉公鸡,分离、培养并鉴定PASMCs,利用CoCl2建立细胞缺氧模型,再用7个浓度的VC(0、50、100、200、500、1 000和1 500μmol·L-1),5个培养时间(6、12、24、48和72h)处理,试验共设35个处理,每个处理6个重复。结果表明,利用组织块法可成功培养出肉鸡PASMCs;与对照组相比,不同浓度CoCl2均可使细胞缺氧基因(HIF-1α、VEGF、VEGFR2)转录量显著增加(P0.05),促进细胞增殖,250μmol·L-1 CoCl2处理48h可成功建立肉鸡PASMCs缺氧模型;500或1 000μmol·L-1VC处理48或72h可显著降低缺氧PASMCs中HIF-1α、VEGFR2mRNA的转录(P0.05),而1 500μmol·L-1VC则显著增加缺氧PASMCs中HIF-1α、VEGF、VEGFR2mRNA的转录(P0.05)。结果提示,缺氧会导致肉鸡肺动脉平滑肌细胞缺氧基因表达量与细胞增殖增加,而VC能降低细胞对缺氧信号的敏感性,使缺氧基因的相对表达量降低。     

缺氧与肉鸡肺动脉平滑肌细胞c-fos和 c-myc基因表达的关系

利用细胞培养、原位杂交、免疫组化、图像分析等技术研究缺氧与肉鸡肺动脉平滑肌细胞癌基因c-fos和c-myc表达的关系,进一步阐明缺氧与以肺动脉增殖重塑为特征的肉鸡腹水综合征的关系。结果显示,缺氧显著引起肺动脉平滑肌细胞内癌基因c-fos和c-mycmRNA的表达(c-fosmRNA:常氧组为144.6±20.2,缺氧组为198.1±32.8,P<0.01;c-mycmRNA:常氧组为125.4±18.8,缺氧组为167.1±22.4,P<0.01)。缺氧显著引起肺动脉平滑肌细胞内癌基因c-fos和c-myc蛋白的表达(c-fos蛋白:常氧组为150.9±33.2,缺氧组为225.9±37.0,P<0.01;c-myc蛋白:常氧组为162.1±28.5,缺氧组为228.8±33.4,P<0.01)。结果表明缺氧能够明显诱发肉鸡肺动脉平滑肌细胞内癌基因c-fos、c-myc的转录和表达,是启动肺动脉平滑肌细胞增殖的重要原因。本研究阐明缺氧是以肺动脉重塑为特征的肉鸡腹水综合征的主要诱因。     

维拉帕米对肉鸡肺动脉高压发生过程中肺动脉平滑肌细胞c-Fos表达的影响

研究低温诱发肉鸡肺动脉高压过程中肺动脉平滑肌细胞c-Fos的表达情况,及钙拮抗剂维拉帕米对c-Fos表达和肺动脉压的影响,从而探讨肉鸡肺动脉高压的发生机制。180只AA肉鸡14日龄随机分为对照组、低温处理组和维拉帕米组,14~49日龄,每组每周随机取6只测定肺动脉压,取肺组织固定做石蜡组织切片进行c-Fos免疫组织化学染色分析。结果显示,低温处理1周后肉鸡肺动脉压明显升高(P0.05),20~50μm肺动脉平滑肌细胞c-Fos表达在处理后1周开始明显升高,50~100μm肺动脉c-Fos表达在处理后2周开始明显升高(P0.05),而维拉帕米组肉鸡肺动脉压和c-Fos的表达在相应的时间内较低温组明显降低(P0.05)。结果表明肺动脉平滑肌细胞c-Fos在低温诱发的肉鸡肺动脉压升高的过程中表达增强,阻断钙通道可抑制肉鸡肺动脉平滑肌细胞c-Fos的过高表达和肺动脉压升高。     

维生素C调控肉鸡缺氧肺动脉血管平滑肌细胞缺氧诱导因子-1α mRNA转录的分子机制

作者旨在通过脯氨酸羟化酶抑制剂(DMOG)和过氧化氢(H_2O_2)刺激肉鸡缺氧肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)探讨维生素C(VC)对其氧化还原状态与缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)及其受体2(VEGFR2/Flk-1)mRNA转录调控的分子机制。在前期PASMCs培养和缺氧模型的基础上设计3个小试验,VC和H_2O_2、VC和DMOG、VC和H_2O_2+DMOG,每个试验5个处理,每个处理6个重复。结果表明:与常氧和缺氧空白组相比,试验1,VC显著增加SOD/MDA的比值(P0.05),显著下调HIF-1α/VEGF/VEGFR2mRNA的转录水平(P0.05),H_2O_2显著上调缺氧肉鸡PASMCs HIF-1αmRNA转录(P0.05);试验2,DMOG显著上调SOD/MDA的比值(P0.05),显著下调HIF-1α和VEGFR2mRNA转录(P0.05),但显著上调VEGF mRNA的转录(P0.05),VC+DMOG显著上调HIF-1α/VEGF/VEGFR2 mRNA转录(P0.05);试验3,VC+H_2O_2+DMOG三者同时添加极显著增加HIF-1α/VEGF/VEGFR2 mRNA转录(P0.01)。以上结果提示,VC能提升细胞外基质的抗氧化水平,其对缺氧基因表达的调控与细胞内脯氨酸羟化酶活性和氧化还原状态相关。     

低温诱发肉鸡腹水综合征过程中肺动脉平滑肌细胞增殖的变化

本试验旨在研究低温诱发肉鸡腹水综合征(AS)过程中平滑肌细胞增殖在肺血管重塑过程中的动态变化,初步探讨肺血管重塑的机制。160只15日龄雄性AA商品代肉鸡随机分为对照组(22℃±1.5℃)和低温组(11℃±2℃)。试验持续至50日龄,期间每周每组随机取6只,取肺组织做石蜡切片,Weigert-间苯二酚复红染色,观察并测定血管重塑情况;采用免疫组织化学方法检测肺动脉增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白表达,并对其半定量化,分析平滑肌细胞增殖情况。50日龄时统计整个饲养过程中AS发生率。结果显示:(1)低温组肉鸡AS发生率(18.75%)极显著高于对照组(1.25%)(P<0.01);(2)低温组肉鸡直径20-50μm和50-150μm肺动脉结构从36日龄开始较对照组发生了明显的重塑(P<0.01或P<0.05);(3)低温组肉鸡直径20-50μm和50-150μm的肺动脉平滑肌细胞增殖指数分别从22日龄和36日龄开始极显著高于对照组(P<0.01)。结果表明:低温诱发肉鸡AS过程中肺动脉结构发生了明显的重塑,肺动脉平滑肌细胞发生了明显的增殖,并且平滑肌细胞增殖促进了肺血管重塑,在肉鸡AS发生发展过程中起着重要的作用。     

红景天苷对低氧条件下培养的鸡胚肺微血管内皮细胞HIF-1α表达水平的影响

为观察不同浓度的红景天苷对低氧培养的鸡胚肺微血管内皮细胞(PMVECs)缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达水平的影响,将原代培养的PMVECs分为5组:对照组、低氧组、低氧处理+40mg/L红景天苷(SDS)组,低氧处理+80mg/L SDS组,低氧处理+120mg/L SDS组,通过比色法检测培养细胞上清液中丙二醛(MDA)含量,应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测HIF-1α的表达水平。结果显示,与对照组相比,低氧组PMVECs上清液中MDA的含量明显上升(P0.05),PMVECs HIF-1α的表达水平显著上调(P0.05);与低氧组相比,PMVECs经不同浓度SDS处理后上清液中MDA的合成量显著下降(P0.05),PMVECs HIF-1α的表达水平明显下调(P0.05)。结果表明,SDS能有效抑制低氧处理的鸡胚PMVECs HIF-1αmRNA的表达水平,并对MDA的合成有调节作用。     

肉鸡和藏鸡肺动脉平滑肌中CaSR的表达

肉鸡肺动脉高压是以肺动脉压血管重构为特征的一种疾病,众多研究揭示肺血管重构是其中心环节之一。细胞内钙离子([Ca2+])浓度的升高是诱发并导致血管重构的重要机制,钙敏感受体(CaSR)在肺动脉平滑肌细胞内钙离子稳态失调及低氧性肺血管收缩和肺血管重构中起着重要的作用。应用免疫组化和Western blot方法研究了缺氧条件下CaSR在AA肉鸡和藏鸡肺动脉平滑肌组织中的表达情况,为肉鸡腹水综合征(PAH)的肺动脉重构提供新的证据。结果表明,肉鸡组有肺水肿发生,藏鸡组无肺水肿发生,缺氧条件下饲养的肉鸡肺动脉平滑肌CaSR表达明显高于藏鸡组(P0.05)。通过探讨CaSR在AA肉鸡和藏鸡肺动脉平滑肌组织中的表达情况,从新的角度阐明了肉鸡腹水综合征发生的分子机制。     

缺氧诱导因子-1α与肉鸡腹水综合征

缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)是机体缺氧信号传导途径中一个关键的转录因子-缺氧诱导因子-1(HIF-1)的一个活性亚基,对人类和哺乳动物肺动脉高压的形成具有极其重要的病理生理作用。文章综述了HIF-1α与哺乳动物肺动脉高压发生发展的关系及其可能的作用机理与途径,对剖析HIF-1α在肉鸡腹水综合征发生发展中的作用机理具有一定的意义。     

腹水综合征肉鸡肝组织缺氧诱导因子1α(HIF-1α)和结缔组织生长因子(CTGF)的变化及复方中药对其的影响

为探讨缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)及结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)在腹水综合征(ascites syndrome,AS)肉鸡肝组织的表达和复方中药对其的影响,将309羽7日龄罗斯肉鸡随机分为5组,空白组(常规饲养),模型组(9～11℃,饲料添加3%猪油和4%鱼粉,饮水添加0.12%NaCl),复方中药组(高、中、低剂量组)在模型组基础上分别给予2.0,1.0,0.5 g·(kg·d)~(-1)的复方中药。Masson染色观察35日龄肝脏病理变化及胶原纤维含量变化,荧光定量PCR和ELISA检测15,25,35,45日龄肉鸡肝组织HIF-1α、CTGF基因和蛋白表达水平。结果表明:与空白组相比,模型组肉鸡腹水心脏指数显著增加(P0.01),肝组织HIF-1α和CTGF基因及蛋白质表达水平显著增加(P0.01或P0.05);与模型组相比,各剂量复方中药组均可改善上述指标(P0.01或P0.05)。这表明AS肉鸡肝组织HIF-1α、CTGF参与肝组织纤维化病理过程,促进AS病理发生发展;复方中药能下调AS肉鸡肝组织HIF-1α、CTGF表达,有效防治AS。     

氯化钴通过诱发DNA氧化损伤抑制猪卵泡颗粒细胞增殖的研究

旨在探究氯化钴（CoCl₂）诱导的DNA氧化损伤对猪卵泡颗粒细胞增殖的影响。本研究选取猪卵泡颗粒细胞作为试验材料，使用化学性低氧模型诱导剂CoCl₂处理猪卵泡颗粒细胞建立缺氧模型。前期研究已确定CoCl₂最适处理浓度，用200 μmol·L^-1 CoCl₂处理猪卵泡颗粒细胞12 h，将培养出的传代细胞分成4组处理，分别为：对照组、CoCl₂诱导缺氧处理组、GSH处理组、GSH+CoCl₂联合处理组。对照组为完全培养基培养12 h，CoCl₂诱导缺氧处理组给予终浓度200 μmol·L^-1 CoCl₂的培养基培养12 h，单独GSH处理组加入浓度为2 mmol·L^-1的GSH处理12 h，GSH+CoCl₂联合处理组加入200 μmol·L^-1 CoCl₂和2 mmol·L^-1的GSH联合处理细胞后培养12 h。12 h后检测各组细胞增殖活性、ROS水平、γH2AX蛋白活性水平和Oxo-8-G水平。采用CCK-8法检测其增殖活性；采用双氯荧光素（2’，7’-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA）检测ROS水平；Western blot检测γH2AX蛋白活性水平，采用FITC荧光小鼠单克隆抗体检测Oxo-8-G水平。为了进一步明确CoCl₂诱导的颗粒细胞增殖阻滞与DNA氧化损伤的关系，本试验在CoCl₂处理的基础上添加抗氧化物GSH处理12 h后检测细胞增殖、ROS水平、DNA氧化损伤等相关指标。与对照组相比，200 μmol·L^-1 CoCl₂处理猪卵泡颗粒细胞后，细胞增殖活力极显著降低（P<0.000 1），缺氧组ROS水平极显著升高（P<0.000 1），γH2AX蛋白表达极显著升高（P<0.000 1），Oxo-8-G水平极显著升高（P<0.000 1）。与缺氧组相比，在CoCl₂处理基础上添加GSH后，ROS、Oxo-8-G、γH2AX水平极显著降低（P<0.000 1），并伴随细胞增殖活性的显著恢复（P<0.000 1）。CoCl₂可抑制猪卵泡颗粒细胞增殖活性，机制与诱导DNA氧化应激损伤有关。     

维拉帕米对环境低温诱发肉鸡肺动脉平滑肌细胞增殖的作用

环境低温诱发肉鸡腹水综合征(AS)发生过程中,肺血管发生明显重塑,并以肺动脉中膜增厚为主要特征。血管平滑肌细胞的数量将影响血管中膜的厚度[1]。故推测认为肉鸡肺动脉平滑肌细胞增殖在肺血管重塑过程中起着重要作用。研究认为细胞内的Ca2 是重要的细胞内第二信使,在细胞增殖过程中起着重要的作用。维拉帕米作为一种钙通道阻滞剂,可抑制Ca2 内流,使细胞内Ca2 水平降低,对肉鸡AS的发生有明显的预防作用[2]。但有关维拉帕米对环境低温诱发肉鸡AS过程中肺动脉血管平滑肌细胞增殖的作用,未见报道。增殖细胞核抗原(proliferating cell nucle…     

饲粮添加Vc对腹水肉鸡缺氧诱导因子-1α基因表达及机体氧化与抗氧化能力的影响

通过饲粮添加1.5mg/kg三碘甲状原氨酸(3,3′,5-triiodothyronine,T3)诱导肉鸡产生腹水综合征(AS),研究了饲粮中添加不同剂量的VC对肉鸡机体氧化与抗氧化能力、肺脏缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因表达及AS发病率的影响。结果表明:饲粮中添加不同剂量的VC可不同程度降低肉鸡心脏指数和AS发病率,1000mg/kgVC可显著降低肉鸡心脏指数(P<0.05);饲粮VC可增加AS肉鸡肝脏和血液的总抗氧化能力,降低MDA的含量,饲粮添加100、1000和10000mg/kgVC可显著降低AS肉鸡肝脏和血液MDA的浓度(P<0.05),添加100、500和10000mg/kgVC可显著提高血液T-AOC活性(P<0.05);VC可以显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)降低AS肉鸡肺脏HIF-1αmRNA和蛋白质表达水平,在1000mg/kg时,HIF-1α蛋白的表达量达到极显著性差异(P<0.01);从血液生化指标来看,VC可降低AS肉鸡血液中乳酸的水平和乳酸脱氢酶(LDH)的活力,在500、1000mg/kg时达到显著性差异(P<0.05)。以上结果表明饲粮中添加1000mg/kgVC对肉鸡AS有较好的防治效果。     

钙信号转导与缺氧诱发肉鸡肺动脉平滑肌细胞癌基因c-fos、c-myc表达的关系

利用细胞免疫组化、原位杂交技术研究钙信号与缺氧诱发肺动脉平滑肌细胞(PASMC)癌基因c-fos、c-myc表达的关系。结果显示,钙通道拮抗剂verapamil(V)、nifedipine(N)、Cyclosporin A(C)显著抑制缺氧引起的c-fos和c-mycmRNA的表达(其中c-fosmRNA:缺氧组198.1±32.8,缺氧 V组161.6±24.1,缺氧 N组173.7±35.8,缺氧 C组159.0±32.8,P<0.01;c-mycmRNA:缺氧组187.1±22.4,缺氧 V组150.5±22.6,缺氧 N组155.1±25.4,缺氧 C组148.9±29.7,P<0.01)。同时显著抑制缺氧引起的c-fos和c-myc蛋白的表达(其中c-fos蛋白:缺氧组225.9±37.0,缺氧 V组162.3±33.6,缺氧 N组157.4±28.9,缺氧 C组151.6±37.3,P<0.01;c-myc蛋白:缺氧组228.8±33.4,缺氧 V组170.2±26.7,缺氧 N组170.7±28.5,缺氧 C组179.1±29.2,P<0.01)。verapamil和nifedipine能够显著抑制缺氧引起的癌基因表达,表明钙信号转导参与了缺氧引起PASMC癌基因的表达过程。Cyclosporin A可显著抑制缺氧引起的癌基因的转录表达,表明钙信号转导系统中的Ca2 /CaM-CaN转导通路在PASMC增殖过程中具有重要作用。PASMC增殖是肉鸡腹水综合征的主要特征,钙信号转导激活引起PASMC增殖的c-fos和c-myc的转录表达,表明钙信号转导可能与肉鸡腹水综合征的发生发展密切相关。     

TNF-α对牦牛卵母细胞HIF-1α和HSP70的表达及后续胚胎发育能力的影响

旨在研究肿瘤坏死因子(TNF-α)对牦牛卵母细胞体外成熟和对低氧诱导因子1α(HIF-1α)、热休克蛋白70(HSP70)的表达以及后续胚胎发育能力的影响。在牦牛卵母细胞体外成熟培养液中添加不同浓度的TNF-α(最终浓度分别为0、10、25、50 ng·mL^-1),牦牛卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes,COCs)培养成熟后,统计其卵母细胞成熟率及体外受精后早期胚胎的发育率,采用RT-PCR扩增牦牛 HIF-1α、 HSP 70基因,采用实时荧光定量PCR(qRT-RCR)、蛋白免疫印迹法(Western blotting)和免疫荧光染色技术检测HIF-1α、HSP70在基因和蛋白水平的表达情况。结果发现:1)成熟液中加入TNF-α,卵母细胞的成熟率提高,且随着TNF-α浓度的升高,卵母细胞的成熟率、卵裂率和囊胚率逐渐升高,当TNF-α浓度为 25 ng·mL^-1 时,卵母细胞的成熟率和卵裂率达到最高,分别为84.98%和66.85%,而囊胚率也达到了21.48%,均显著高于对照组( P <0.05);2)随着TNF-α浓度的升高, HIF-1α的表达量逐渐降低,对照组 HIF-1α的表达量极显著高于其他组(P <0.01),50 ng·mL^-1 TNF-α组 HIF-1α的表达量极显著低于其他组(P <0.01),HIF-1α在卵丘细胞和卵母细胞上均有表达;3)25 ng·mL^-1 TNF-α组的HSP 70表达量最高,极显著高于其他组(P <0.01),而当TNF-α达到50 ng·mL^-1 时,HSP 70的表达量最低。综上表明,在牦牛卵母细胞体外成熟过程中,TNF-α明显提高了卵母细胞的发育能力,同时还诱导了HSP 70的表达,抑制了HIF-1α的表达,为今后探讨TNF-α、 HIF-1α和HSP70在牦牛生殖过程中发挥的作用以及对胚胎发育的影响提供理论依据。     

熊果酸介导HIF-1α缓解木质化鸡胸肉发生的潜在作用机制研究

木质化鸡胸肉在快大型白羽肉鸡的胸肌组织中病变率高达20%,严重降低消费者的购买欲,也不利于后期加工,造成的经济损失相对较高。缺氧是导致木质化鸡胸肉发生的重要原因,缺氧诱导因子1α(HIF-1α)是机体缺氧状态下调节细胞功能的关键因子,缺氧会造成HIF-1α过表达,导致机体氧化应激、糖代谢紊乱和炎症反应的发生,进而导致快大型白羽肉鸡罹患木质化鸡胸肉。熊果酸具有抗氧化、抗炎和调节糖代谢等功效,并可通过腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)等信号通路调节HIF-1α在机体中的表达。作者综述了缺氧所导致的木质化鸡胸肉的发病机理以及熊果酸调控HIF-1α对氧化应激、糖代谢和炎症反应的影响,进一步分析了熊果酸通过AMPK、PI3K/Akt等信号通路调控HIF-1α缓解木质化鸡胸肉发生的潜在作用机制。     

腹水综合征肉鸡肺脏缺氧诱导因子-1α基因克隆及表达研究

从21日龄患腹水综合征（AS）鸡肺脏中提取RNA,根据健康鸡胚心室肌细胞缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）基因序列（登录号为NM204297）设计引物,采用RT-PCR技术进行cDNA扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离、纯化、回收后与载体pMD18-T连接,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,测序.结果表明,已成功克隆的阳性重组子经测序鉴定其片段大小与预期大小完全一致,为1 576 bp.序列同源性分析比较表明,该cDNA及其推导的氨基酸序列与鸡胚HIF-1α cDNA和氨基酸序列同源性分别为99%和98%.采用RT-PCR技术检测4只21日龄正常肉鸡和4只21日龄AS患鸡肺脏HIF-1α mRNA,结果表明,AS患鸡肺脏HIF-1α mRNA表达丰度极显著高于正常肉鸡（P《0.01）.本试验证明,HIF-1α与肉鸡肺动脉高压导致的腹水综合征相关.     

低氧诱导因子-1α对牦牛肾小管上皮细胞上皮-间质转化的影响

本研究旨在探讨低氧诱导因子-1α(HIF-1α)对牦牛肾小管上皮细胞上皮-间质转化(EMT)的影响。首先对牦牛肾小管上皮细胞进行培养鉴定,并选取第三代细胞对其分别进行药物处理(DMOG组)和不做药物处理(对照组),检测EMT相关基因在mRNA和蛋白水平的表达变化,并观察细胞形态变化。结果表明:使用Ⅰ+Ⅱ型胶原酶可以更好地获得肾小管上皮细胞;免疫荧光结果细胞CK18表达呈阳性,Vimentin和CD31呈阴性表达;qRT-PCR和Western blot结果表明,DMOG组中的HIF-1α,TGF-β1,α-SMA在mRNA和蛋白水平均较对照组有极显著增加(P0.01),而E-cadherin的表达显著降低(P0.05);经药物干预后,细胞形态由铺路石样转变为长梭形,经鉴定长梭形细胞为间质细胞。本研究成功建立了牦牛肾小管上皮细胞的分离培养体系,并发现HIF-1α表达上调可以促进牦牛肾小管上皮细胞上皮-间质转化。     

不同浓度GnIH对鸭颗粒细胞周期和增殖的影响

为了研究不同浓度GnIH对鸭颗粒细胞周期、增殖及相关基因表达的影响。本研究分别用不同浓度GnIH(0、0.1、1、10和100 ng·mL~(-1))处理体外培养的鸭颗粒细胞24 h(n=3),观察细胞的生长状态,通过流式细胞术和EdU方法检测细胞周期和细胞增殖,并用qRT-PCR方法检测增殖相关基因CDK6、CyclinD1、IGF-2、IGFBP-2、p27~(kip1)的表达。结果显示,各浓度GnIH处理组的细胞生长状态良好,形态正常,细胞轮廓清晰,组间死亡细胞数差异不显著(P0.05);在0.1和1 ng·mL~(-1) GnIH处理组,细胞周期阻滞在G2期的比例显著上升(P0.05);随着GnIH处理浓度的增加,EdU阳性细胞数所占的百分比降低;在0.1和1 ng·mL~(-1) GnIH处理组,颗粒细胞中CDK6、CyclinD1、IGF-2、IGFBP-2、p27~(kip1)基因的相对表达量均下降,在10和100 ng·mL~(-1) GnIH处理组中这些基因的相对表达量则有所上升。研究表明,在体外培养的鸭颗粒细胞中,GnIH能使细胞周期阻滞在G2期,并降低EdU阳性细胞所占百分比和下调增殖相关基因的表达水平,从而抑制颗粒细胞增殖来影响动物繁殖性能。     

α-黑素细胞刺激素对泰和乌骨鸡皮肤黑色素细胞增殖及黑色素合成的影响

旨在研究α-黑色素细胞刺激素(α-melanocyte stimulating hormone,α-MSH)对泰和乌骨鸡皮肤黑色素细胞增殖和黑色素生成的影响,初步探讨α-MSH调控泰和乌骨鸡黑色素合成的机制。利用体外培养的乌骨鸡皮肤黑色素细胞,观察不同质量浓度α-MSH(0、2.5、5、10 mg/L)及其拮抗剂([D-Trp7,Ala8,D-Phe10]α-MSH(6-11)-amide,D-AD-MSH)处理后黑色素细胞增殖、黑素皮质素受体1(melanocortin 1receptor,MC1R)基因表达、酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)活性、环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)含量和黑色素含量的变化。结果表明,不同质量浓度的α-MSH对细胞有促增殖的作用,2.5mg/Lα-MSH处理组细胞的增殖率极显著高于不添加α-MSH的对照组(P0.01)。α-MSH剂量依赖性地提高MC1R基因表达。2.5mg/Lα-MSH处理组细胞cAMP的含量显著高于对照组(P0.05),其他处理组之间差异不显著(P0.05)。不同浓度的α-MSH处理均极显著提高细胞TYR活性(P0.01或P0.05)。与对照组相比,2.5mg/Lα-MSH极显著提高皮肤黑色素细胞的黑色素含量(P0.01),5、10.0mg/Lα-MSH具有提高黑色素细胞黑色素含量的趋势(P0.05)。α-MSH拮抗剂D-A-D-MSH预处理乌骨鸡皮肤黑色素细胞显著抑制α-MSH对黑色素细胞MC1R基因表达、cAMP含量、TYR活性和黑色素含量的上调作用(P0.05)。α-MSH能促进泰和乌骨鸡皮肤黑色素细胞增殖,提高MC1R基因表达、cAMP含量以及TYR活性并进而促进黑色素合成。