A型塞尼卡病毒与O型、A型、亚洲I型口蹄疫病毒多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立鉴别检测A型塞尼卡病毒(SVA)与O型、A型、亚洲I型口蹄疫病毒(FMDV)的方法,针对SVA 3D基因与O型、A型、亚洲I型FMDV VP1基因,分别设计特异性引物和TaqMan探针,经优化反应条件,建立了同时检测SVA与O型、A型、亚洲I型FMDV的TaqMan荧光定量RT-PCR方法.所建立的方法能特异性扩...     

O型、A型及Asia-1型口蹄疫病毒多重RT-PCR检测方法的建立

根据口蹄疫病毒VP1基因序列,利用Primer Premier 5.0软件设计4条特异性引物,通过对退火温度等反应条件进行优化,建立能够同时扩增出O型、A型、Asia-1型口蹄疫病毒的多重RT-PCR检测方法。结果表明,建立的方法最低可以检测出约含1 pg/μL的病毒样品;该方法对猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒等其他相关病毒的检测结果均为阴性,特异性良好。建立的方法能够对口蹄疫O型、A型、Asia-1型病毒准确定型,可广泛用于口蹄疫病毒3个血清型的快速检测和分子流行病学调查。     

O型口蹄疫病毒不同基因型联合RT-PCR检测方法的建立

在比较国内外口蹄疫病毒(FMDV)流行毒株序列的基础上，设计了检测FMDV的PCR引物及O型FMDV不同基因型即中国型(Cathay)与乏亚株(PanAsia)的二联PCR引物。在确定单项RT-PCR反应条件的基础上，建立、优化了二联RT-PCR反应体系和条件，并进行了相关病毒检测试验。结果表明，建立的检测O型FMDV不同基因型中国型与泛亚株的二联RT-PCR，有效、特异且敏感，为FMD的诊断、流行病学调查及疫苗应用奠定了基础。     

口蹄疫病毒(FMDV)多重RT-PCR检测方法的建立

在大量比较国内外口蹄疫病毒（FMDV）流行毒株序列的基础上自行设计了检测FMDV通用型引物及FMDV AsiaⅠ型、O型口蹄疫病毒不同基因型即：中国型（Cathay）与泛亚株（PanAsia）的多重PCR引物。本试验确定了单项RT-PCR反应条件范围,在此基础上建立、优化了多重RT-PCR反应体系和反应条件,并进行了相关病毒检测试验。结果表明,本试验建立了有效、特异、敏感的检测FMDV AsiaⅠ型及O型FMDV不同基因型中国型与泛亚株的多重RT-PCR检测方法,为口蹄疫的诊断防制、流行病学调查及疫苗的使用奠定了基础。     

基于TaqMan探针的A型塞尼卡病毒荧光定量RT-PCR方法的建立及应用

为建立一种快速、特异、灵敏的A型塞尼卡病毒(SVA)检测方法,通过比对我国不同地区SVA流行毒株的VP1基因序列,在其保守区域设计了1组引物和探针,通过条件优化,建立了基于TaqMan探针的荧光定量RT-PCR检测方法。用该方法检测口蹄疫病毒、猪瘟病毒、日本脑炎病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒等均不发生交叉反应。敏感性分析显示,该方法的最低检出量为278拷贝/μL,比常规RT-PCR的灵敏度高100倍。重复性分析显示,所建立方法的批内变异系数为0.3%～1.0%,批间变异系数为0.8%～2.0%,具有良好的稳定性。进一步对16份疑似SVA感染的临床病料检进行了检测,结果显示8份为SVA核酸阳性。提示建立的检测方法可以用于临床SVA感染的鉴别诊断,为我国SVA的诊断和控制提供了良好的技术支撑。     

一步法RT-PCR快速检测口蹄疫O型病毒

目前检测口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)常用技术主要有动物接种、病毒分离和血清学试验等[1,2],但这些方法存在费时、敏感性低等缺点。近年来,随着分子生物学的发展和PCR技术的建立,许多学者又将PCR技术应用于FMDV的检测[3~8],该方法克服了目前常规方法的某些缺点,具有良     

口蹄疫病毒RT-PCR快速检测方法的建立

目的:建立了一种RT-PCR的方法,用于检测O、A和亚洲I型口蹄疫病原。方法:设计合成一套引物,通过反应条件的优化,建立RT-PCR的方法,以扩增口蹄疫病毒的基因,并用该法检测患病猪的颌下淋巴结和扁桃体,牛、羊的食道-咽分泌物(O-P液)等样品。结果:该方法可快速灵敏检测出猪的颌下淋巴结和扁桃体,牛、羊的食道-咽分泌物(O-P液)中的FMDV,并具有较好的特异性和重复性。结论:建立了一种RT-PCR检测O、A和亚洲I型口蹄疫病原的方法。     

口蹄疫病毒O型、亚洲I型二价灭活疫苗的研究

对O型口蹄疫病毒OHM/02株和亚洲I型口蹄疫病毒Asia I-KZ/03株进行了部分生物学特性分析,结果表明它们对牛的毒力较强,传代后毒力稳定,OHM/02株半数感染量(ID50)在107.5～108.25/0.2mL,Asia I-KZ/03株半数感染量(ID50)在106.75～107.5/0.2mL之间,适合做检验用毒;同时该2株毒易感染乳鼠,适应BHK21细胞,对乳鼠毒的半数致死量(LD50)OHM/02株毒在107.0～109.0/0.2mL,Asia I-KZ/03株毒在107.0～108.5/0.2mL;通过攻毒保护试验证实,病毒的免疫原性良好,制备的细胞毒灭活疫苗均达到3个以上的PD50.通过病毒大规模生产工艺的探索(转瓶培养和悬浮培养)、疫苗佐剂的研究、免疫持续期的监测和安全性等试验,成功研制了口蹄疫病毒O型、亚洲I型二价灭活疫苗,获农业部新兽药注册证书.     

O型、A型及Asia1型3个型口蹄疫病毒通用套式RT-PCR检测方法的建立

为了建立针对流行于我国及周边国家主要口蹄疫病毒(FMDV)血清型的检测方法,本实验设计2对特异性引物,通过对反应条件的优化,建立了能够同时扩增O型、A型及Asia1型FMDV VP1全基因的套式RT-PCR (RT-nPCR)方法.该方法能特异性检测O型、A型和Asia1型FMDV,对其它相关动物病毒的检测结果均为阴性;比FMDV多重RT-PCR商品试剂盒敏感约1 000倍.利用该方法对10份FMDV样品进行扩增检测,结合扩增产物的克隆测序技术,对所检样品进行了准确定型.实验结果表明,该方法通用型强,可用于3个血清型FMDV的检测和分子流行病学调查.     

口蹄疫O型病毒二温式RT-PCR检测方法的建立及初步应用

试验通过对口蹄疫病毒核苷酸序列的比对分析,在O型口蹄疫病毒的P1基因保守区,设计1对特异性引物,应用均匀设计法优化反应参数,建立口蹄疫O型病毒二温式RT-PCR检测方法。对该法进行特异性试验、敏感性试验检测。结果表明,该二温式RT-PCR方法只对口蹄疫O型病毒敏感,对其他血清型的口蹄疫病毒及常见的猪病病毒均不敏感;扩增条带与预期目的片段大小相符,扩增片段经克隆、测序发现与引物所在基因序列的同源性为100%;检测病毒RNA的敏感性为1.665 pg/μL,其敏感性与三步法PCR敏感性检测结果没有差异。运用该法对54头攻毒试验的动物进行检测,阳性鉴定结果与三步法PCR鉴定结果一致,与三步法PCR相比该法节省了20 min,表明所建立的口蹄疫O型病毒二温式RT-PCR方法是一种准确、快速、特异、敏感的检测方法。     

猪塞尼卡病毒TaqMan探针荧光RT-PCR方法的建立和应用

塞尼卡病毒(Senecavirus A,SVA)为小核糖RNA病毒科塞尼卡病毒属的单股正链RNA病毒,可引起猪的水泡样病变、跛行和新生仔猪突然死亡等,我国已经有多个省市检测到了本病毒。为建立一种快速高效、适应范围广的SVA检测方法,本研究以分离到的1株SVA流行病毒株GXT91作为参考毒株,设计合成了TaqMan探针和1对引物建立了SVA的荧光RT-PCR方法,并分别进行该方法的敏感性、特异性和重复性试验。结果显示:该方法的敏感性达到了17.4个分子拷贝/μL,与口蹄疫病毒、猪瘟病毒等病原无交叉反应,表明它具有较高的特异性,组间和组内重复性试验的变异系数均小于2%,表明其重复性较好。进一步运用该方法对48份临床样本进行检测,从中发现了12份阳性样品。这表明本研究建立的荧光RT-PCR是一种良好的诊断SVA的方法,可用于待测样本中SVA的诊断和流行病学调查监测等。     

奶牛O型、亚洲I型、A型口蹄疫免疫抗体变化规律观察

本试验对犊牛母源抗体及不同阶段奶牛口蹄疫免疫抗体效价变化规律进行了观察研究,为口蹄疫免疫程序的制定提供试验依据。根据观察结果,建议免疫程序如下:90日龄进行首次免疫,首免后一个月进行二免,以后每4个月加强免疫一次。     

塞尼卡病毒与口蹄疫病毒双重RT-PCR鉴别检测方法的建立

2014~2015年,美国、巴西等国爆发了一种症状类似于口蹄疫的水泡性疾病,病原被确定为塞尼卡病毒A(Senecavirus A,SVA)。为了鉴别和诊断塞尼卡病毒A和口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV),本研究针对塞尼卡病毒的VP1基因和口蹄疫的5’UTR基因,合成特异性引物,优化了反应体系和扩增条件,建立了一种可同时检测塞尼卡病毒A和口蹄疫病毒的双重RT-PCR方法。特异性和敏感性试验结果表明,建立的双重RT-PCR检测方法特异性好,敏感性强,对塞尼卡病毒A和口蹄疫病毒最低检出量分别为104 copies/μL、103 copies/μL。本研究建立的方法对临床快速鉴别塞尼卡病毒A和口蹄疫病毒感染具有重要意义。     

口蹄疫病毒通用型和A型二重实时荧光RT-PCR检测方法的建立

为建立一种快速、敏感、特异的口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)分型鉴别诊断实时荧光RT-PCR(Fluorescence quantitative,FQ-PCR)检测方法,根据O、A、AsiaⅠ三种血清型FMDV保守基因序列,设计能够检测到FMDV的特异性通用检测引物和A型检测引物,以及不同荧光素标记的MGB探针。通过对PCR反应体系和反应条件的优化筛选,建立了FMDV通用型和A型二重实时荧光RT-PCR检测方法,并对该方法进行了特异性、敏感性、重复性试验;利用所建立的方法,对123份疑似FMDV感染的临床样品进行了检测。结果显示,建立的FMDV通用型、A型二重实时荧光RT-PCR检测方法在10~1～10~7拷贝/μL模板范围内有很好的线性关系;对pGEM-T/FMDV-T和pGEM-T/FMDV-A重组质粒出现阳性扩增信号,但对正常细胞培养物对照和其他7种病原对照未扩增出特异性曲线;自123份疑似FMDV感染样品中,检出10份FMDV-T阳性,6份FMDV-T/FMDV-A双阳性并且与基因测序结果一致。结果表明,本研究建立的FMDV通用型、A型二重实时荧光RT-PCR检测方法重复性好、敏感性高、特异性强,最低检测模板浓度为10拷贝/μL,可用于FMDV的快速分型检测,为FMDV的早期检测及临床诊断提供了新方法。     

O、A、Asia1型口蹄疫病毒胶体金定量检测免疫层析方法的建立

旨在建立口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)抗原血清型的快速分型和定量的检测方法,利用双抗体夹心法,将口蹄疫病毒的兔抗及豚鼠抗体作为标记胶体金与NC膜检测带的原料,分别制备出检测O、A、Asia 1血清型的3种层析试纸卡.通过对标定的抗原标准品146S检测,拟合出定量标准曲线...     

猪腹泻相关病毒多重RT-PCR检测方法的建立

为建立同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PRV)的多重RT-PCR检测方法,本研究根据GenBank中登录的PEDV S基因、TGEV S基因和PRV VP6基因序列设计合成引物,利用这3对引物对同一样品中的PEDV、TGEV、PRV进行多重RT-PCR扩增,结果显示,该方法可以同时扩增PEDV(682 bp)、TGEV(480 bp)和PRV(297 bp)的特异性DNA片段,而对猪瘟病毒和猪伪狂犬病毒的PCR扩增结果均为阴性;敏感性试验结果表明,该多重RT-PCR方法对PEDV、TGEV和PRV的最低检出量分别为3.3×103拷贝/μL、3.2×103拷贝/μL和2.8×103拷贝/μL。利用建立的多重RT-PCR检测方法和单项RT-PCR对20份临床病料进行检测,结果显示,两者的总符合率为100%。结果表明建立的多重RT-PCR检测方法具有特异、快速、准确的特点,可以用于这3种病毒的同时检测和疾病的鉴别诊断。     

口蹄疫病毒链特异性荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为了定量检测口蹄疫病毒(FMDV)的正链和负链RNA,揭示FMDV复制的分子机制,试验采用链特异性荧光定量RT-PCR(ssqRT-PCR)方法提取了FMDV的RNA,在FMDV链特异性反转录引物的5'端引入非病毒基因序列标签进行反转录,再经链特异性ssqRT-PCR扩增进行灵敏性、特异性、重复性检测。结果表明:FMDV基因组正链、负链RNA的链特异性ssqRT-PCR方法构建成功,该方法对FMDV正链和负链RNA检测的灵敏度达到1×101拷贝,具有较好的重复性和特异性。     

多重荧光RT-PCR同时检测口蹄疫O A AsiaⅠ三种血清型

口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是一种动物烈性传染病,被OIE列为A类家畜传染病之首。根据O、AsiaⅠ、A三种血清型FMDV的保守基因序列,设计特异性引物和以不同荧光素标记的TaqMan探针。通过对PCR反应体系和反应条件的优化筛选,建立了检测O、AsiaⅠ、A三种血清型FMDV的多重荧光RT-PCR检测方法。结果表明,该方法有效、特异、敏感,对于口蹄疫病毒的诊断和疫苗的使用具有重要意义。     

禽流感病毒RT-PCR及多重RT-PCR检测技术的建立

研究建立了禽流感病毒（AIV）A型、H5、N1、H9、N2亚型特异性RT-PCR及HS／N1、H9／N2、A／H5／Nl多重RT-PCR检测技术，用于检测或同时检测和鉴别A型及H5N1、H9N2亚型AIV。所建立的RT-PCR和多重RT-PCR从核酸提取、基因扩增到产物分析在3～4h内即可完成，经对36株AIV及相关病毒分离物检测，与病毒分离鉴定的结果完全一致，且与相关病毒或其他亚型无交叉反应。采用多重RT-PCR检测80份棉拭子样品，并与病毒分离鉴定方法比较，二者H5N1、H9N2亚型的鉴定结果完全吻合。结果表明，该方法具有快速、敏感、特异等优点，为临诊样品中AIV型及H5N1、H9N2亚型鉴定和诊断的有效方法。