CLC对冻融牛精子体外获能及抗氧化、抗凋亡能力的影响

本研究目的是评价CLC对牛冻融精子获能、抗氧化及抗凋亡能力的影响。试验分对照组和CLC处理组(0.5、1.0、1.5及2.0 mg/mL),检测冻融牛精子体外获能后的酪氨酸磷酸化水平以及冻融牛精子抗氧化基因和细胞凋亡基因的表达。结果:1)在0.5 mg/mL CLC处理组冷冻效果最好,与对照组和1.0 mg/mL CLC处理组相比无显著差异;2)冻融牛精子获能处理后,在1.0 mg/mL CLC处理组精子蛋白酪氨酸磷酸化水平最高,与对照组相比无显著差异;3)在0.5 mg/mL CLC处理组冻融牛精子抗氧化基因CAT、GPX和SOD的表达量与对照组相比显著升高(P<0.05);4)在0.5和1.0 mg/mL CLC处理组凋亡基因Caspase-3、Caspase-8和BAX的表达量与对照组相比显著降低(P<0.05)。结论:添加CLC可以改进冻融牛精子获能和抗氧化、抗凋亡能力。     

甘氨酸对水貂GV期卵母细胞冷冻保存效率的影响

试验旨在探究玻璃化冷冻及培养过程中添加甘氨酸（glycine，Gly）对水貂GV期卵母细胞冷冻解冻后存活率、核发育、线粒体和皮质颗粒分布的影响。试验分为3组：对照组（没有进行冷冻处理）、冷冻组和Gly添加处理组（1 mmol/L Gly）。对玻璃化冷冻解冻后的水貂GV期卵母细胞分别进行平衡恢复3 h和体外成熟培养，采用免疫荧光标记法检测各组GV期卵母细胞线粒体分布的差异及MⅡ期皮质颗粒分布的变化。结果显示，Gly添加处理组卵母细胞在解冻后3 h的存活率与冷冻组相比差异不显著（P>0.05），但显著低于对照组（P<0.05）；Gly添加处理组卵母细胞的减数分裂恢复率显著高于冷冻组（P<0.05），但与对照组相比差异不显著（P>0.05）。免疫荧光结果显示，Gly添加处理组的GV期卵母细胞线粒体正常分布率显著高于冷冻组（P<0.05），但Gly添加处理组和冷冻组的GV期卵母细胞线粒体正常分布率均显著低于对照组（P<0.05）。皮质颗粒分布结果显示，水貂GV期卵母细胞在冷冻后体外成熟培养至MⅡ期时，Gly添加处理组皮质颗粒的正常皮质区分布比例显著高于冷冻组（P<0.05），但Gly添加处理组与冷冻组的正常皮质区分布比例均显著低于对照组（P<0.05）。结果表明，添加Gly可以提高冻融后水貂卵母细胞的减数分裂恢复率，降低冷冻对其线粒体及皮质颗粒的损失。     

甘氨酸对水貂GV期卵母细胞冷冻保存效率的影响

试验旨在探究玻璃化冷冻及培养过程中添加甘氨酸(glycine,Gly)对水貂GV期卵母细胞冷冻解冻后存活率、核发育、线粒体和皮质颗粒分布的影响。试验分为3组:对照组(没有进行冷冻处理)、冷冻组和Gly添加处理组(1 mmol/L Gly)。对玻璃化冷冻解冻后的水貂GV期卵母细胞分别进行平衡恢复3 h和体外成熟培养,采用免疫荧光标记法检测各组GV期卵母细胞线粒体分布的差异及MⅡ期皮质颗粒分布的变化。结果显示,Gly添加处理组卵母细胞在解冻后3 h的存活率与冷冻组相比差异不显著(P0.05),但显著低于对照组(P0.05);Gly添加处理组卵母细胞的减数分裂恢复率显著高于冷冻组(P0.05),但与对照组相比差异不显著(P0.05)。免疫荧光结果显示,Gly添加处理组的GV期卵母细胞线粒体正常分布率显著高于冷冻组(P0.05),但Gly添加处理组和冷冻组的GV期卵母细胞线粒体正常分布率均显著低于对照组(P0.05)。皮质颗粒分布结果显示,水貂GV期卵母细胞在冷冻后体外成熟培养至MⅡ期时,Gly添加处理组皮质颗粒的正常皮质区分布比例显著高于冷冻组(P0.05),但Gly添加处理组与冷冻组的正常皮质区分布比例均显著低于对照组(P0.05)。结果表明,添加Gly可以提高冻融后水貂卵母细胞的减数分裂恢复率,降低冷冻对其线粒体及皮质颗粒的损失。     

细胞松弛素B对绵羊GV期卵母细胞玻璃化冷冻效果的影响

本试验通过玻璃化冷冻前细胞松弛素B(CB)预处理来分析CB对绵羊GV期卵母细胞玻璃化冷冻/解冻后发育潜力的影响。分别从细胞毒性检测、冷冻检测和CB不同浓度（6.0、7.5和9.0 μg/ml）处理3个方面进行试验。试验结果表明毒性检验中CB处理组和未处理组卵母细胞的成熟率都显著低于对照组(P<0.05)，但相互之间差异不显著；玻璃化冷冻后，卵母细胞成熟率显著低于未冷冻组(P<0.05)，玻璃化冷冻CB处理组和未处理组卵母细胞体外成熟培养后成熟率之间差异不显著(P>0.05)；不同CB浓度处理后9.0 μg/ml组卵母细胞的成熟率显著高于对照组（P<0.05）。     

冷冻保护剂和细胞松弛素B对猪MⅡ期卵母细胞冷冻效率的影响

为了评价冷冻保护剂和离心处理对猪MⅡ期卵母细胞冷冻效率的影响,本试验研究了2种不同冷冻保护剂(乙二醇、二甲基亚砜和蔗糖混合物,EDS;乙二醇、丙二醇和蔗糖混合物,EPS)对猪MⅡ期卵母细胞冷冻效率的影响,以及细胞松弛素B和离心极化处理对猪MⅡ期卵母细胞冷冻效率的影响。结果表明:用EPS和EDS作为猪MⅡ期卵母细胞冷冻保护剂,冻融后其成活率差异并不显著。用不同浓度CB处理猪MⅡ期卵母细胞,7.5μg/mL的处理组冻融后成活率显著高于对照组(P<0.05)。猪MⅡ期卵母细胞经7.5μg/mL CB和离心极化双重处理,冻融后成活率显著高于CB单处理组和对照组,且3组间差异显著(P<0.05)。表明CB和离心极化处理都能改善MⅡ期猪卵母细胞冷冻效率,但它们作用机制还有待于进一步研究。     

小檗碱和川芎嗪对猪卵母细胞体外成熟中一氧化氮生成量的影响

试验以mTCM-199添加抗生素为对照组,以分别添加0.1μg/mL小檗碱(berberine,BR)和0.5μg/mL川芎嗪(ligustrazine,Lig)为试验组,比较各组卵母细胞体外成熟中一氧化氮(NO)生成量和卵母细胞的成熟效果,从而探讨中药单体成分对猪卵母细胞体外成熟过程中NO生成量的影响。结果表明:体外成熟前22 hNO生成量,对照组与Lig组差异极显著(P<0.01)、与BR组差异显著(P<0.05),Lig组与BR组差异显著(P<0.05);体外成熟后22 h NO生成量,对照、Lig及BR三组间均无显著差异(P>0.05),但Lig组的NO生成量少于BR组和对照组;体外成熟培养0～44 h不同组别NO生成量整体呈下降趋势,Lig组与BR组卵母细胞成熟率显著高于对照组(P<0.05)。结果表明卵母细胞体外成熟培养过程中,NO生成量随体外培养时间增加呈递减趋势,中药单体成分BR和Lig对卵母细胞成熟均起到一定的促进作用。低浓度NO代谢量可能对卵母细胞成熟有一定促进作用。     

放线菌酮对绵羊体外成熟卵母细胞同期化及发育的影响

实验筛选了绵羊卵母细胞同期化培养的放线菌酮(CHX)浓度,研究了CHX处理后减数分裂进程的改变和CHX处理时间对减数分裂恢复能力的影响,并比较了体外成熟不同阶段CHX处理对后期发育的影响。结果表明:20μg/mLCHX处理24h后处于GV期的卵母细胞比率与对照组差异不显著(P0.05),但显著高于5、10μg/mL组(P0.05);CHX处理24h再正常培养16、20h的成熟率显著高于正常培养12h组(P0.05),但与对照组差异不显著(P0.05);卵母细胞经CHX处理8、16、24h后再正常培养20h,其中8h和16h组卵的成熟率显著(P0.05)低于对照组和24h组;体外成熟不同阶段用CHX处理后体外受精的卵裂率、囊胚率也显著低于对照组(P0.01)。因此20μg/mLCHX可较大程度地抑制卵母细胞减数分裂,CHX处理后卵母细胞减数分裂进程将加快,但影响其后期发育。     

抑制泛素结合酶改变猪卵母细胞透明带泛素化状态及精-卵结合能力

本研究旨在探究猪卵母细胞体外成熟过程中添加泛素结合酶(E2)抑制剂对卵母细胞透明带蛋白泛素化水平及精-卵结合能力的影响。试验分为6组:对照组、DMSO组、5、10、15和20μmol·L^-1 NSC697923处理组。采用Western blot方法分析体外成熟培养液中添加不同浓度泛素结合酶抑制剂NSC697923对猪卵母细胞透明带泛素化水平表达的影响。通过Hoechst染色检测不同组别的精卵结合能力。结果表明:1)猪卵母细胞体外成熟培养液中,添加10、15和20μmol·L^-1 NSC697923显著降低卵母细胞成熟率(P<0.05),透明带硬化时间(P<0.05)以及精卵结合率(P<0.05)。2)对照组和各处理组的透明带蛋白在61、81、106 ku处发生不同程度的泛素化标记,而添加15和20μmol·L^-1 NSC697923显著地降低透明带蛋白泛素化水平(P<0.05)。综上表明,猪卵母细胞体外成熟过程中泛素结合酶(E2)改变成熟卵母细胞透明带泛素化水平以及精卵结合能力。     

甘草酸单铵盐对猪卵母细胞体外成熟及胚胎发育能力的影响

将收集的猪COCs置于添加不同浓度(0.0,0.3,0.6,1.2μmol/L)甘草酸单铵盐(monoammonium glycyrrhizinate, MAG)的卵母细胞体外成熟培养液中培养46 h,统计成熟率，通过免疫荧光染色检测成熟卵母细胞ROS表达水平；对成熟卵母细胞体外受精，于胚胎培养液内体外培养48,120 h,分别统计体外受精胚胎卵裂率、囊胚率，并用Hochest荧光染色检测囊胚总细胞数；结合成熟率及IVF胚胎发育囊胚率选定最佳添加浓度，在体外成熟培养液中添加最适浓度MAG,以0μmol/L MAG为对照组，体外培养46 h后，利用免疫荧光染色检测猪成熟卵母细胞的线粒体膜电位水平和细胞凋亡水平。结果显示，与对照组相比，不同浓度MAG处理组猪卵母细胞体外成熟率均有所提高，但差异均不显著(P>0.05);不同浓度MAG添加均可降低猪卵母细胞ROS水平，与对照组相比，0.3,0.6μmol/L组差异显著(P<0.05),1.2μmol/L组差异极显著(P<0.01)。0.3μmol/L添加组显著提高了猪体外受精囊胚率(P<0.05),但不同MAG添加组对...     

uPA对体外成熟牛卵母细胞生发泡破裂的影响

为了探明尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)对体外成熟牛卵母细胞核成熟的可能作用,试验根据uPA及其特异性抑制剂(amiloride)的有效浓度分成4组,即对照组、uPA(0.5 ng/mL)组、amiloride(1μg/mL)组及联合添加(uPA+amiloride)组,然后采用地衣红染色方法分别研究体外成熟培养6 h与12 h后uPA对牛卵母细胞生发泡破裂(GVBD)的影响,采用ELISA方法研究体外成熟培养6 h后uPA对牛卵丘-卵母细胞复合体(COCs)中cAMP水平变化的可能调节作用。结果表明:减数分裂不同时期(GV期、GVBD期及MⅠ~MⅡ期)卵母细胞染色质(体)形态呈现不同特征。卵母细胞在体外成熟培养6 h后各组细胞均处于GV~GVBD期,其中uPA组GVBD期卵母细胞率(12.72%)显著低于对照组(24.83%)与联合添加组(30.42%,P0.05);体外成熟培养12 h后,uPA组GVBD期卵母细胞率(54.81%)显著高于对照组(37.49%)与联合添加组(25.64%,P0.05),uPA组MⅠ~MⅡ期卵母细胞率(44.85%)显著低于对照组(62.51%)与联合添加组(74.36%,P0.05);体外成熟培养6 h后,uPA组cAMP水平显著高于对照组与联合添加组(P0.05)。说明uPA通过上调cAMP水平阻滞牛卵母细胞的减数分裂进程。     

兔卵母细胞体外成熟培养影响因素的研究

试验旨在探讨卵丘细胞包裹层数、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)和谷胱甘肽(glutathione,GSH)对兔卵母细胞体外成熟培养的影响。分别采用切割法和针刺挤压法取母兔卵巢表面的卵丘卵母细胞复合体(cumulus oocyte complexes,COCS),将获取的COCS在基础培养液中添加不同浓度表皮生长因子(0ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL)及不同浓度的谷胱甘肽(0μmol/mL、0.5μmol/mL、1.0μmol/mL、1.5μmol/mL、2.0μmol/mL)进行体外成熟培养并观察第一极体排出率。结果表明:①手术刀切割法和针刺挤压法平均回收卵母细胞率分别为(22.83、39.29)枚,针刺挤压法显著高于手术刀切割法(P<0.05)。②3层以上卵丘细胞包裹的卵母细胞体外成熟率为81.27%,显著高于1~3层卵丘细胞包裹的体外成熟率63.75%和裸卵细胞体外成熟率23.45%(P<0.05)。③添加20ng/mL的EGF对兔卵母细胞体外成熟培养后成熟率为82.14%,效果最好,且显著高于对照组10ng/mL和30ng/mL EGF组(P<0.05)。④添加不同浓度的谷胱甘肽可以促进和提高兔卵母细胞体外成熟率,其中添加1.0μmol/mL的谷胱甘肽时,卵母细胞成熟率为71.44%,与添加1.5μmol/mL组的相比差异不显著(P>0.05),但显著高于其他组(P<0.05)。结论为添加20ng/mL的EGF和1.0μmol/mL谷胱甘肽,对用针刺挤压法获得3层以上卵丘细胞包裹的兔卵母细胞体外培养效果最佳。     

生长激素和胰岛素对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚卵裂的影响

本研究探讨了生长激素(STH)和胰岛素对猪卵母细胞体外成熟及孤雌激活后卵裂的影响。结果表明:在mNCSU-23液中,添加0.15μg/mLSTH组的成熟率(73.83%)和卵裂率(64.76%)显著高于对照组和添加0.01、0.05、0.1、0.2μg/mLSTH组(P<0.05);添加5μg/mL和8μg/mL胰岛素组的成熟率(66.25%、60.64%)显著高于添加0、0.5、2μg/mL及10μg/mL组(P<0.05);添加5μg/mL胰岛素组的卵裂率(61.63%)显著高于添加0、0.5、2、8、10μg/mL组(P<0.05);最佳的联合添加组为0.15μg/mLSTH+2μg/mL胰岛素,其体外成熟率为79.37%、卵裂率为72.31%。     

LDL对玻璃化冷冻解冻培养MⅡ期猪卵母细胞线粒体膜电位和透明带泛素化水平的影响

本试验旨在探究添加低密度脂蛋白（low density lipoprotein,LDL）对玻璃化冷冻解冻后MⅡ期猪卵母细胞发育率、线粒体膜电位及透明带泛素化水平的影响。采用线粒体膜电位特异性探针JC-1检测各处理组线粒体膜电位,并采用SDS-PAGE及Western blotting方法分析不同处理组MⅡ期猪卵母细胞透明带蛋白泛素化水平。结果显示,玻璃化冷冻法处理中,10 mg/mL LDL处理组MⅡ期卵母细胞正常率和成熟率（71.92%和69.86%）显著高于对照组（58.26%和54.55%）（P<0.05）,最接近未冷冻组。10 mg/mL LDL处理组MⅡ期卵母细胞线粒体膜电位显著高于对照组、1和20 mg/mL LDL组（P<0.05）。免疫印迹结果显示,未冷冻组和LDL处理组MⅡ期卵母细胞ZP1、ZP2及ZP3蛋白分别在61、80、106 ku发生不同程度的泛素化标记;10 mg/mL LDL处理组ZPs（ZP1、ZP2、ZP3）蛋白泛素化水平显著高于1和20 mg/mL LDL组（P<0.05）,但显著低于非冷冻组（P<0.05）。结果表明LDL可改善玻璃化冷冻解冻培养后MⅡ期猪卵母细胞成熟率、线粒体膜电位及透明带泛素化水平。     

α-硫辛酸对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育的影响

为探究α-硫辛酸（ALA）对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育的影响，本实验将不同浓度的ALA(0、10、25、50μmol/L)添加至体外成熟培养液（IVM）和胚胎发育培养基（PZM-3）中培养，体外成熟培养42 h后检测卵母细胞第一极体排出率，统计卵母细胞孤雌激活胚胎48 h和168 h卵裂率和囊胚率，筛选出ALA最佳添加浓度，并通过检测成熟卵母细胞内活性氧（ROS）水平、谷胱甘肽（GSH）含量、体外成熟卵母细胞内的促凋亡基因Bax的mRNA以及抗氧化基因SOD1、CAT的mRNA表达量，分析ALA在卵母细胞成熟中的作用。结果表明：与对照组相比，25μmol/L ALA组提高了猪卵母细胞第一极体排出率（P<0.05），随着ALA浓度增加，卵母细胞的第一极体排出率呈下降趋势，50μmol/L ALA组降低了卵母细胞第一极体排出率（P<0.05）；孤雌胚胎发育能力检测显示，25μmol/L ALA组卵母细胞的卵裂率和囊胚率高于对照组（P<0.05）；与对照组相比，25μmol/L ALA孵育组卵母细胞内ROS水平降低（P<0.05），细胞内GSH含量提高（P<...     

细胞松弛素B对牛GV期卵母细胞玻璃化冷冻效果的影响

本试验通过玻璃化冷冻前不同浓度细胞松弛素B(cytochalasin-B,CB)预处理来分析CB对牛GV期卵母细胞固体表面玻璃化(SSV)冷冻后发育潜力的影响。试验结果表明,玻璃化冷冻后,CB处理组和未处理组之间卵母细胞成熟率差异不显著(P>0.05),但均显著低于体外培养组。说明试验中所用CB浓度 (2.5、7.5、15、20和30 μg/mL)对牛GV期卵母细胞玻璃化冷冻效果的改善作用不明显。     

猪卵母细胞OPS玻璃化冷冻保存的研究

为了研究猪卵母细胞的开放性拉长脉管(OPS)玻璃化冷冻保存,试验采用不同的冷冻保护剂对比生发泡期(GV期)(体外成熟12 h)和成熟期(MⅡ期)(体外成熟48 h)猪卵母细胞的冷冻保存效果。结果表明:GV期猪卵母细胞的冷冻保存效果要优于MⅡ期和未经体外培养的猪卵母细胞;不同的冷冻保护剂相比,5%PVP+梯度乙二醇的冷冻保存效果最好。     

玻璃化冻存对驴卵母细胞超微结构的影响

试验旨在探究玻璃化冷冻对驴卵母细胞发育的影响，寻求驴卵母细胞冷冻的最佳条件。通过对不同发育时期的驴卵母细胞进行玻璃化冷冻，冷冻复苏后分别进行成熟培养和孤雌激活，并对GV期未冷冻组（对照组）、GV期冷冻组、IVM-M Ⅱ冷冻组卵母细胞微丝和线粒体超微结构进行免疫荧光标记，统计冷冻复苏后卵母细胞形态正常率、成熟率、孤雌激活卵裂率、超微结构正常率。结果表明，GV期冷冻组卵母细胞的形态正常率与GV期未冷冻组（对照组）间无显著差异（P>0.05），成熟率和卵裂率均显著低于对照组（P<0.05）；IVM-M Ⅱ冷冻组的卵裂率显著低于对照组（P<0.05），且卵裂后细胞发育受到阻滞。冷冻组微丝在皮质区分布明显减少的卵母细胞数目增多，冷冻组卵母细胞的线粒体数量明显低于对照组，由此可以说明冷冻对卵母细胞超微结构有损伤，从而导致复苏后成熟率下降，影响卵母细胞的受精和体外发育，且GV期冷冻组较IVM-M Ⅱ冷冻组在微丝与线粒体结构上有较小损伤，发育状态较好。     

生长激素和胰岛素对猪卵母细胞体外成熟及电激活后卵裂的影响

研究了生长激素(somatotropin,STH)、胰岛素(Insulin)单独或者协同作用对猪卵母细胞成熟及电激活后卵裂的影响。结果表明,STH、Insulin对卵母细胞的成熟和激活后卵裂呈现双重效应。在NCSU-23基础液中添加0.15μg/mLSTH组的成熟率(73.83±1.80%)和卵裂率(64.76±2.54%)显著高于对照组及0.01、0.05、0.1、2.0μg/mLSTH组(P<0.05);添加5μg/mLInsulin的成熟率(65.05±1.34%)和8μg/mLInsulin组的成熟率(60.24±1.34%)显著高于对照组及0.5、2、10μg/mLInsulin组;添加5μg/mLInsulin组的卵裂率(61.33±2.62%)显著高于对照组及0.5、2、8、10μg/mLInsulin组(P<0.05);0.15μg/mLSTH与2μg/mLInsulin联合添加组成熟率和卵裂率最高,达到79.35±2.04%和72.31±1.19%,同其它组相比,差异显著(P<0.05),在本试验中为猪卵母细胞体外成熟的最佳条件。     

几种激素对Beagle犬卵母细胞体外成熟的影响

由于犬独特的生殖生理,其卵母细胞体外成熟率远远低于其它动物。本实验旨在探讨几种激素对犬卵母细胞体外成熟的影响。将采集的犬卵丘-卵母细胞复合体置于添加不同浓度激素成熟培养液中,对照(CK)组不添加激素,A、B、C组分别添加FSH+P4+E2量为:0.5IU/mL+2.5μg/mL+2.5μg/mL、1 IU/mL+5μg/mL+5μg/mL、2 IU/mL+10μg/mL+10μg/mL。通过72 h体外成熟培养后核染色观察成熟率。结果显示,各种组卵母细胞发育至GV、GVBD、MI-MII的比率差异不显著,其中以B组达到MI-MII比率最高(18.63%)。本试验表明,添加此几种浓度激素对犬卵母细胞体成熟培养没有显著促进作用,需继续探讨犬卵母细胞体外成熟培养体系。     

血管内皮生长因子对绵羊卵母细胞体外成熟及体外受精卵卵裂率的影响

试验研究了在绵羊体外成熟和体外受精培养系统中分别添加5ng/mL血管内皮生长因子(VEGF)对绵羊卵母细胞体外成熟和体外受精卵的早期发育的影响。结果表明:①与对照组相比,添加5ng/mLVEGF能够显著(P<0.01)提高绵羊卵母细胞的体外成熟率。②在体外受精液中添加5ng/mLVEGF能够显著(P<0.05)提高成熟卵母细胞的卵裂率。研究表明,VEGF对绵羊卵母细胞的体外成熟和受精具有调节作用。