HDAC1和HDAC2对小鼠卵母细胞组蛋白去乙酰化的作用

旨在探索组蛋白去乙酰化酶1 (histone deacetylase 1,HDAC1)和组蛋白去乙酰化酶2 (histone deacetylase 2,HDAC2)在卵母细胞减数分裂期组蛋白去乙酰化过程中的作用。首先利用免疫荧光技术,检测HDAC1与HDAC2在体细胞及卵母细胞不同时期的表达分布,然后分别利用抑制剂抑制HDAC1和HDAC2的活性,观察其对卵母细胞组蛋白去乙酰化的作用。结果:HDAC1与HDAC2分布在间期的体细胞和卵母细胞的细胞核中,但分裂期细胞中只有卵母细胞染色体上存在HDAC1的表达,抑制酶活性后该HDAC1的表达也消失;在小鼠卵母细胞第一次减数分裂双线期(germinal vesicle stage,GV期)卵母细胞体外成熟液中添加TSA (trichostatin A,HDACs广谱抑制剂)、Pyroxamide (HDAC1特异性抑制剂)、Santacruzamate A (HDAC2特异性抑制剂),发现Pyroxamide和Santacruzamate A均能显著抑制卵母细胞减数分裂过程中组蛋白乙酰化修饰的去除,但未能达到广谱抑制剂的抑制效果。研究表明,小鼠卵母细胞在减数分裂组蛋白去乙酰化过程中,HDAC1和HDAC2均具有组蛋白去乙酰化的作用,且与HDAC2相比,HDAC1发挥着主要的去乙酰化作用,这为组蛋白去乙酰化作用机理提供理论参考。     

Sirt2在哺乳动物卵母细胞成熟过程的调节作用与机制研究

卵母细胞体外成熟是实施哺乳动物胚胎生物技术的基础,其成熟质量对体外受精及体细胞核移植效率至关重要,但目前卵母细胞体外成熟效率远低于体内成熟。Sirt2是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖的组蛋白去乙酰化酶,可通过催化不同底物去乙酰化,参与调控微管动力学、染色体排列、氧化应激及能量代谢等多种生理过程。近年来,关于Sirt2调节哺乳动物卵母细胞发育能力的相关研究受到越来越多的关注。本文主要综述了Sirt2的生物学特性和在哺乳动物卵母细胞成熟过程中的作用与调节机制,旨在为提高哺乳动物卵母细胞质量及胚胎发育提供参考。     

老化卵母细胞组蛋白翻译后修饰改变研究进展

哺乳动物的繁殖能力通常会随着年龄的增长而下降，同时伴随着卵母细胞质量变差。表观遗传变化是哺乳动物老化的标志，由于年龄增长或者排卵后未及时受精均会产生老化的卵母细胞，而组蛋白修饰改变是卵母细胞老化的重要原因。在老化卵母细胞内组蛋白乙酰化、甲基化的改变会影响卵母细胞成熟及后续胚胎发育，使其在体细胞核移植时表现为发育不佳。在实际生产中，年龄较大的动物易产生老化卵母细胞，使其繁殖能力降低，导致畜禽饲养经济效益下降。为了提高老龄动物繁殖能力，增加畜牧养殖场经济效益，笔者主要从组蛋白乙酰化、甲基化方面阐述老化卵母细胞中组蛋白修饰的改变，旨在为更好地探究卵母细胞老化机制提供参考。     

基因组表观重编程对体细胞核移植成功率的影响

基因组表观重编程缺陷是影响体细胞核移植效率的主要因素,本文讨论了表观重编程的两大主要机制——DNA甲基化及组蛋白修饰及其对体细胞核移植重构胚胎发育的影响,并综述了几种促进核重编程的方法。     

Scriptaid对猪移植体细胞核在胚胎外发育的影响

组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases,HDACs)是调控基因的关键蛋白酶,乙酰化是一种可逆的蛋白共价修饰。组蛋白去乙酰化酶可以改变特定基因的转录和表达水平,诱导细胞的分化和凋亡。为了检测一种低毒新型的组蛋白去乙酰化酶抑制剂Scriptaid对克隆猪胚胎发育的影响,进行了不同浓度和不同时间的处理,并在体外检测了胚胎分裂率和囊胚发育能力。研究以对照试验作为基础,以凌源禾丰种猪场长白猪胎儿成纤维作为供体细胞,然后通过体细胞核移植(SCNT)技术获得体外发育胚胎。将重构胚胎以不同浓度(0、200、500、700、900 nmol/L)Scriptaid处理后,并进行不同时间(0、15、36、72 h)的培养,然后通过观察不同处理浓度和处理时间下胚胎在2细胞阶段分裂率和囊胚发育率。再通过Real-time PCR检测2细胞阶段未处理组与Scriptaid处理组的Oct4、Sox2两个因子的相对表达变化。通过统计学分析发现,与未处理组相比,500 nmol/L Scriptaid处理15 h囊胚发育率显著增加(P0.05),但2细胞阶段分裂率基本不变,而未处理组克隆胚胎在囊胚期Oct4基因表达的倍数明显低于经过Scriptaid处理的克隆胚胎在囊胚期的表达倍数(P0.05),这说明经过500 nmol/L Scriptaid处理后,克隆胚胎的Oct4表达量明显提高。未经过处理的克隆胚胎在囊胚期Sox2基因的表达倍数和经过Scriptaid处理的克隆胚胎在囊胚期Sox2基因的表达倍数有差异但是差异不明显,这说明经过500 nmol/L Scriptaid处理之后,基因Sox2表达虽然有提高,但总体来说和未处理的胚胎相比差异不大(P0.05)。     

组蛋白去乙酰化酶在宿主-微生物调控中的作用

组蛋白去乙酰化酶(HDAC)通过在肠上皮细胞的表达,共生代谢产物的调节及在肠道微环境间复杂的相互作用有序介导着哺乳动物宿主细胞和肠道菌群间的动态调控,具有维持肠上皮细胞稳态和肠道屏障的功能,研究对组蛋白去乙酰化酶的具体作用方式展开综述。     

TSA处理供体细胞对组蛋白乙酰化和核重编程效果的影响

克隆胚胎基因组的不完全重编程是克隆动物成功率低的主要原因.试验中以第5代牛胎儿成纤维细胞作为供体核,以牛卵母细胞作为受体胞质进行体细胞核移植,用75 nmol·L-1曲古抑菌素A(Trichostatin A,TSA)分别处理供体细胞6、12和24 h,通过核移植检测克隆胚胎发育率,并应用激光共聚焦显微镜技术和流式细胞术检测处理细胞和克隆囊胚组蛋白H3K18乙酰化水平和细胞周期.结果显示:随着TSA处理时间的延长,供体细胞组蛋白H3K18乙酰化水平不断提高;以75 nmot·L-1TSA处理供体细胞12 h的克隆胚的囊胚发育率显著高于未处理组(23.5%vs 15.7 %,P<0.05);供体细胞经TSA处理的克隆囊胚组蛋白H3K18乙酰化水平与未处理组相比差异不显著(P>0.5);处理组和对照组细胞G0/G1期和S期比例间存在显著差异(P<0.05).结论:TSA对核供体细胞的处理存在时间效应,75 nmol·L-1TSA处理12 h的牛胎儿成纤维细胞更易被卵母细胞重编程,显著提高了克隆胚的体外发育能力,初步证实TSA是通过提高供体细胞组蛋白乙酰化水平来促进供体细胞重编程的.     

表观遗传修饰影响哺乳动物体细胞核移植效率的研究进展

表观遗传修饰是一种不依赖于DNA序列变化的可逆、可遗传修饰，在哺乳动物胚胎发育的整个阶段均可发生，是影响哺乳动物体细胞核移植效率的主要因素之一。其中，DNA甲基化、组蛋白的动态修饰、X染色体失活、端粒与端粒酶活性变化作为常见的表观遗传修饰类型，任一修饰形式的异常都会影响基因的表达，引发体细胞重编程错误导致核移植效率降低。近年来，随着体细胞核移植技术研究的不断深入，表观遗传修饰影响体细胞核移植效率的关键作用机制日益明确。本文通过综述不同类型的表观遗传修饰影响哺乳动物体细胞核移植效率的研究进展，以期在表观遗传修饰层面为提高哺乳动物体细胞核移植效率提供新思路。     

Oxamflatin处理对水牛-猪异种体细胞核移植胚胎早期发育的影响

为了探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂(Oxamflatin)处理对水牛-猪异种体细胞核移植(i SCNT)胚胎早期发育的影响,分别观察了培养在不同浓度Oxamflatin(0.00μM,0.05μM,0.50μM,5.00μM)和不同处理时间(0h,12h,18h,24h)对水牛-猪i SCNT胚胎早期发育的影响。结果显示,在PZM-3中添加不同浓度的Oxamflatin处理12h后,i SCNT胚胎分裂率在各个处理组和对照组之间差异不显著(p0.05),囊胚率在各个处理组和对照组之间也无显著差异(p0.05);随后用Oxamflatin处理不同时间后,i SCNT胚胎分裂率和囊胚率分别在各个处理组和对照组之间差异不显著(p0.05)。结果表明,在本试验条件下Oxamflatin不能显著提高水牛-猪i SCNT胚胎发育的潜能。     

牛卵母细胞减数分裂期组蛋白H4K12乙酰化的变化

试验以牛卵母细胞作为材料,以曲古抑菌素A作为去乙酰化酶(HDAC)抑制剂。应用激光共聚焦显微镜技术,通过检测卵母细胞组蛋白H4K12乙酰强度,探讨乙酰基转移酶(HAT)和组蛋白去乙酰基酶(HDAC)在减数分裂Ⅰ、Ⅱ期的活性。TSA的处理浓度为80μmol/L。结果显示,组蛋白H4K12乙酰荧光强度在卵母细胞减数分裂期完全消失;在TSA存在下培养成熟的卵母细胞,在减数分裂期检测到强的组蛋白H4K12乙酰化荧光强度;然后卵母细胞移入不含TSA的培养液中,3h后组蛋白H4K12乙酰荧光强度再次完全消失。结论:HAT在减数分裂Ⅰ、Ⅱ期无活性,HDAC在减数分裂Ⅰ、Ⅱ期有活性。     

体细胞核移植的不完全核重编程与克隆动物的发育异常

体细胞核完全的重编程是成功生产克隆动物的先决条件,体细胞核的不完全重编程是克隆动物发育异常的主要原因。本文主要通过对DNA甲基化、组蛋白乙酰化、端粒、X染色体失活和印记基因表达几个方面的论述,来探讨造成克隆动物发育异常的原因。     

细胞松弛素B对猪孤雌囊胚DNA甲基化和组蛋白乙酰化的影响

以猪电激活孤雌胚胎为研究对象,通过添加细胞松弛素B(CB)对胚胎发育过程中DNA甲基化和组蛋白乙酰化的变化进行了研究。利用荧光定量PCR检测了囊胚中DNA甲基转移酶(Dnmt1,Dnmt3a,Dnmt3b)、组蛋白乙酰转移酶(Hat1)、组蛋白去乙酰化酶(Hdac1)以及凋亡相关基因(Bax,Casp3)mRNA水平的表达,并通过免疫荧光染色检测了囊胚中5hmc/5mc,AcH3K9,H3K9me3的表达水平。结果显示:5mg/L CB处理4h能够显著提高猪孤雌囊胚的卵裂率和囊胚率(P0.05),减少囊胚细胞凋亡数量;DNA甲基转移酶(Dnmt1,Dnmt3a,Dnmt3b)、组蛋白乙酰转移酶(Hat1)、组蛋白去乙酰化酶(Hdac1)以及凋亡相关基因(Bax,Casp3)mRNA水平均明显下降;AcH3K9的表达无明显变化;而5hmc/5mc和H3K9me3的表达明显升高。该结果为进一步研究猪胚胎发育过程中的表观遗传变化提供了试验依据。     

体细胞核移植的不完全核重编程与克隆动物的发育导常

体细胞核完全的重编程是成功生产克隆动物的先决条件,体细胞核的不完全重编程是克隆动物发育异常的主要原因.本文主要通过对DNA甲基化、组蛋白乙酰化、端粒、X染色体失活和印记基因表达几个方面的论述,来探讨造成克隆动物发育异常的原因.     

Scriptaid联合5-Aza-CdR对水牛成纤维细胞DNA甲基化和组蛋白乙酰化修饰的影响

旨在探讨Scriptaid和5-Aza-CdR共同处理水牛耳部成纤维细胞(buffalo adult fibroblasts,AFs)对细胞生长特性、DNA甲基化和组蛋白乙酰化的影响,为提高水牛体细胞重编程效率提供一定的理论基础。首先使用不同浓度的Scriptaid(0,0.05,0.10μmol/L)和5-Aza-CdR(0,0.02,0.10μmol/L)分别处理AFs,筛选出最佳处理浓度后联合处理AFs 24h。随后采用免疫荧光染色技术分析联合处理后细胞的DNA甲基化和组蛋白H3K18乙酰化变化情况,并使用实时荧光定量PCR(QPCR)技术对其甲基化和乙酰化相关基因的表达进行检测。结果发现,适宜浓度的Scriptaid(0.05μmol/L)和5-Aza-CdR(0.02μmol/L)对细胞正常的形态、生长无显著影响。与对照组相比,联合处理后AFs中DNA甲基化水平显著降低,而组蛋白H3K18位点的乙酰化水平显著上升(P0.05)。QPCR分析结果显示,联合处理后AFs中的DNA甲基化相关基因Dnmt1、TET1和TET2的表达水平均出现下调,其中Dnmt1的表达水平显著低于对照组(P0.05);组蛋白去乙酰化酶HDAC1和HDAC2的表达水平也出现下调,其中HDAC1下调显著(P0.05);而组蛋白乙酰化转移酶CBP,P300和HAT1的表达水平出现上升,其中P300和HAT1的表达水平显著高于对照组(P0.05)。结果表明,适宜浓度的Scriptaid(0.05μmol/L)和5-Aza-CdR(0.02μmol/L)联合处理AFs,对细胞形态和生长无显著影响,但可以有效降低细胞甲基化水平并提高组蛋白H3K18位点的乙酰化水平。     

曲古抑菌素A处理克隆胚对囊胚发育率的影响

[目的]探讨曲古抑菌素A（Trichostatin A,TSA）处理对囊胚发育率的影响。[方法]以牛胎儿成纤维细胞作为供体核,以牛卵母细胞作为受体胞质进行体细胞核移植,用80 nmol/L TSA处理供体细胞12 h,核移植后继续处理克隆胚胎0、6、12和24 h,应用激光共聚焦显微镜检测供体细胞组蛋白H4K12乙酰化水平,并通过核移植检测TSA不同时间处理的克隆胚胎囊胚发育率。[结果]TSA处理12 h的供体细胞组蛋白H4K12乙酰化水平显著增高（P〈0.05）;80 nmol/LTSA处理12 h的克隆胚的囊胚发育率（21.9%）高于未处理组（16.5%）,差异显著（P〈0.05）。[结论]供体细胞和克隆胚胎经TSA处理的12 h的克隆胚胎,显著提高了体外发育能力。     

不同年龄水牛成纤维细胞DNA甲基化与组蛋白乙酰化水平分析

实验旨在探讨不同年龄水牛成纤维细胞的增殖能力、DNA甲基化和组蛋白乙酰化水平,为水牛体细胞克隆中供体细胞的选择提供理论依据。利用细胞组织块培养法分离培养3月龄胎儿水牛、新生水牛、10岁龄水牛的耳部成纤维细胞,通过绘制细胞生长曲线、细胞免疫荧光和qRT-PCR方法分析细胞增殖能力和DNA甲基化、组蛋白乙酰化水平。结果表明:随着水牛年龄增长,原代成纤维细胞扩展速度不断下降,P2代细胞的生长曲线呈典型的S型,3月龄胎儿水牛成纤维细胞的增殖能力均高于新生水牛和10岁龄水牛(P0.05);3月龄胎儿水牛与新生水牛的DNA甲基化水平低于10岁龄水牛(P0.01),3月龄胎儿水牛成纤维细胞的DNA甲基化转移酶基因DNMT1、DNMT3A低于新生水牛和10岁龄水牛(P0.01);随着年龄增长,水牛成纤维细胞组蛋白乙酰化转移酶HAT1基因的表达降低(P0.01),组蛋白去乙酰化酶HDAC1基因的表达升高(P0.01)。以上结果说明,水牛胎儿成纤维细胞处于低DNA甲基化高组蛋白乙酰化状态,可能更适合作为供体细胞用于水牛体细胞克隆研究。     

DNA甲基化、组蛋白修饰与基因沉默

DNA甲基化、组蛋白去乙酰化和H3K9甲基化是3种最典型的与染色质凝聚状态有关的共价修饰方式，它们都与基因的沉默存在着联系，近年来的研究主要集中于DNA甲基化与各种组蛋白修饰之间的关系，以及染色质阻遏状态的自身强化循环关系上。组蛋白去乙酰化和H3K9甲基化可能有助于DNA甲基化模式的建立，此外，研究结果还显示CpG甲基化和其它组蛋白修饰存在相互作用。     

短链脂肪酸介导的肠上皮和抗炎调节研究进展

哺乳动物体中的肠道菌群是细菌生态系统的组成部分,从动物出生时起,这些微生物就对免疫系统的发育、功能和调节起着非常重要的作用。当前,越来越多的研究集中在微生物对宿主细胞代谢的影响上。短链脂肪酸(SCFA)作为肠道菌群的一种代谢产物,对肠道稳态的维持具有重要作用。SCFA是肠道上皮细胞的重要燃料,能增强肠屏障功能。作为信号分子,SCFA可以通过细胞表面G蛋白偶联受体(GPCR)发出信号,从而激活控制免疫功能的信号级联反应;还可以通过底物转运蛋白进入细胞,抑制组蛋白脱乙酰化酶(HDAC),最终达到降低肠道炎症反应。本文综述了微生物SCFA的产生及其对肠道黏膜的影响,并通过激活细胞表面GPCR以及抑制组蛋白去乙酰化酶(HDACs)来调节免疫反应的作用。     

丁酸对亚急性瘤胃酸中毒的影响机制研究进展

亚急性瘤胃酸中毒(SARA)作为反刍动物饲养中因营养代谢紊乱而高发的疾病,严重影响了反刍动物的健康和生产。近年来研究发现,丁酸作为瘤胃中主要的挥发性脂肪酸(VFA),具有调控细胞增殖以及抗炎等作用。本文结合近年研究,从SARA破坏瘤胃屏障功能、诱发炎症反应的机制,重点阐述了丁酸作为信号分子和组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACIs)识别G蛋白偶联受体(GPRs),促进组蛋白乙酰化、调控下游信号通路改善瘤胃上皮屏障功能和缓解炎症反应的生理过程,为更进一步研究丁酸对反刍动物SARA中的影响提供参考。     

单胚胎RT-qPCR对猪体细胞核移植囊胚全能性的分析

为了检测猪体细胞核移植囊胚的质量和全能性基因表达量,采用体细胞核移植技术制备克隆胚胎并于体外培养5 d后获得囊胚,对照组为从人工授精5 d后的长白母猪体内获取的体内囊胚。在高倍镜下检测两组囊胚的形态,用Hoechest 33342染色细胞核DNA,记录囊胚细胞总数;建立单胚胎cDNA的制备方法,并用qPCR检测囊胚中全能性基因(Oct4、Nanog、Sox2)的表达量。结果表明,与体内囊胚相比,猪体细胞核移植囊胚质量较差,细胞数目显著降低(分别为110±10.3和54±12.6);并且全能性基因表达量显著下降(P<0.05)。由此可见,全能性基因表达量偏低是影响猪体细胞核移植囊胚发育能力的因素之一。