抑制泛素结合酶改变猪卵母细胞透明带泛素化状态及精-卵结合能力

本研究旨在探究猪卵母细胞体外成熟过程中添加泛素结合酶(E2)抑制剂对卵母细胞透明带蛋白泛素化水平及精-卵结合能力的影响。试验分为6组:对照组、DMSO组、5、10、15和20μmol·L^-1 NSC697923处理组。采用Western blot方法分析体外成熟培养液中添加不同浓度泛素结合酶抑制剂NSC697923对猪卵母细胞透明带泛素化水平表达的影响。通过Hoechst染色检测不同组别的精卵结合能力。结果表明:1)猪卵母细胞体外成熟培养液中,添加10、15和20μmol·L^-1 NSC697923显著降低卵母细胞成熟率(P<0.05),透明带硬化时间(P<0.05)以及精卵结合率(P<0.05)。2)对照组和各处理组的透明带蛋白在61、81、106 ku处发生不同程度的泛素化标记,而添加15和20μmol·L^-1 NSC697923显著地降低透明带蛋白泛素化水平(P<0.05)。综上表明,猪卵母细胞体外成熟过程中泛素结合酶(E2)改变成熟卵母细胞透明带泛素化水平以及精卵结合能力。     

猪卵母细胞体外成熟中添加PPi改变透明带泛素化水平及精卵结合能力

本研究主要目的是评价猪卵母细胞成熟培养中添加无机磷酸盐焦磷酸(PPi)对卵母细胞成熟、透明带泛素化水平及精卵结合能力的影响。试验设置对照组及0.1、1、5μg/m L 3个添加PPi处理组,检测卵母细胞成熟率、透明带泛素化水平及精卵结合情况。结果显示:1μg/m L PPi处理组卵母细胞成熟率为75.06%,显著高于对照组(P0.05);1μg/m L PPi处理组透明带泛素化水平显著高于其他各组(P0.05);1μg/m L PPi处理组透明带酶解时间为278.93 s,显著低于对照组(P0.05);1μg/m L PPi处理组精子黏附率为83.24,显著低于对照组(P0.05)。结论:PPi显著提高卵母细胞体外成熟率和透明带泛素化水平,降低透明带溶解时间和精子黏附率。     

不同处理对猪精子蛋白泛素化影响的研究

本研究旨在探究猪精子不同处理对精子泛素化蛋白表达量的影响。利用SDS-PAGE、Western blot技术,分析鲜精、冷休克、获能、顶体反应总蛋白种类以及猪精子泛素化蛋白表达量的变化。结果显示:约在41 ku、30 ku、12 ku处的蛋白发生了泛素化;冷休克处理组蛋白泛素化的程度较其他三组明显下降;获能和顶体反应处理组要比鲜精处理组蛋白泛素化水平高。结论:低温处理精子可能导致泛素化蛋白降解或改变,使泛素-蛋白酶体通路可能受阻;获能和顶体反应处理组泛素化程度比鲜精和冷休克处理组高,精子获能后可能泛素-蛋白酶体通路加强。     

抑制UCHL1对猪卵母细胞体外成熟、透明带泛素化及多精入卵的影响

试验旨在研究抑制泛素羧基末端水解酶-1（UCHL1）对猪卵母细胞体外成熟、透明带泛素化及多精入卵的影响。利用DAPI染色、Hoechst染色及SDS-PAGE等方法检测猪卵母细胞体外成熟率、透明带泛素化水平及多精入卵等情况。结果表明,添加不同浓度UCHL1抑制剂（10、20、25、30 μmol/L,二甲基亚砜（DMSO）及对照组）体外培养猪卵母细胞46 h后,对照组成熟率为86.22%,而30 μmol/L UCHL1抑制剂组的成熟率为15.30%,且各处理组间成熟率差异显著（P<0.05）;经Western blotting检测,各处理组的透明带在约61、80、106 ku处均发生不同程度的泛素标记,通过灰度值分析差异显著（P<0.05）;进行体外受精试验后,发现对照组透明带精子黏附数最多,精子入卵数较少,添加30 μmol/L UCHL1抑制剂组的透明带精子黏附数最少,几乎没有精子入卵。结果显示,UCHL1抑制剂对猪卵母细胞的体外成熟有一定影响,随着UCHL1抑制剂浓度的增加,透明带发生泛素化的程度逐渐降低,且UCHL1可调节透明带精子黏附及多精入卵。     

获能处理对猪精子质量及泛素对顶体酶抑制剂水平调控的影响

【目的】探究猪精子体外获能前后顶体酶抑制剂(AI)表达量以及AI的泛素化水平的变化,了解AI与泛素-蛋白酶体系统(UPS)间的联系,为深入研究泛素-蛋白酶体途径(UPP)在猪精子获能过程中的作用提供参考。【方法】选择18～24月龄的成年健康长白公猪,使用手握法采集公猪精液,将一部分精子进行获能处理,一部分作为对照(鲜精),使用计算机辅助精子分析系统(CASA)、低渗肿胀法(HOST)、考马斯亮蓝染色、Western blotting和锌离子(Zn²⁺)标记检测获能前后精子的动力学参数、质量参数、酪氨酸磷酸化水平和Zn²⁺含量;Western blotting检测获能前后精子中AI和泛素(Ub)的表达量;免疫荧光法检测AI和Ub在精子中的定位;免疫共沉淀分析AI和Ub的结合情况。【结果】与新鲜精子相比,获能精子动力学参数VSL和BCF极显著升高(P<0.01),获能精子的活力、质膜完整性、顶体膜完整性、活率均极显著降低(P<0.01);获能精子蛋白酪氨酸磷酸化水平极显著升高(P<0.01),Zn²⁺极显著...     

CLC对冻融牛精子体外获能及抗氧化、抗凋亡能力的影响

本研究目的是评价CLC对牛冻融精子获能、抗氧化及抗凋亡能力的影响。试验分对照组和CLC处理组(0.5、1.0、1.5及2.0 mg/mL),检测冻融牛精子体外获能后的酪氨酸磷酸化水平以及冻融牛精子抗氧化基因和细胞凋亡基因的表达。结果:1)在0.5 mg/mL CLC处理组冷冻效果最好,与对照组和1.0 mg/mL CLC处理组相比无显著差异;2)冻融牛精子获能处理后,在1.0 mg/mL CLC处理组精子蛋白酪氨酸磷酸化水平最高,与对照组相比无显著差异;3)在0.5 mg/mL CLC处理组冻融牛精子抗氧化基因CAT、GPX和SOD的表达量与对照组相比显著升高(P<0.05);4)在0.5和1.0 mg/mL CLC处理组凋亡基因Caspase-3、Caspase-8和BAX的表达量与对照组相比显著降低(P<0.05)。结论:添加CLC可以改进冻融牛精子获能和抗氧化、抗凋亡能力。     

肝素浓度对辽宁绒山羊精子体外获能的影响

在TALP液中添加不同浓度(25、50、100μg/mL)的肝素对辽宁绒山羊精子进行获能处理,在显微镜下检测处理1、2、3、4、5h后的精子活力,用考马斯亮蓝染色法检测获能处理0.5、1、2、4h后的精子获能状况,探讨肝素浓度对绒山羊精子活力、存活时间、获能率的影响。结果发现,在38.5℃、5%CO2、饱和湿度条件下,精子活力随肝素浓度升高而下降,3 h以后25μg/mL肝素组精子活力显著高于其它肝素组(P<0.05)。添加肝素组获能率显著高于对照组(P<0.05),各肝素组精子获能率差异不显著(P>0.05)。对照组精子存活时间最长,25μg/mL肝素组精子存活时间为10.12 h,显著高于其它两组(P<0.05)。表明25μg/mL肝素处理辽宁绒山羊精子体外获能较为适宜。     

泛素激活酶抑制剂对猪精子获能状态、膜重构及体外受精的影响

【目的】评估泛素激活酶(E1)对猪精子获能、膜重构和体外受精的影响。【方法】选取5头长白猪采集精液,以硫醇酯法评估泛素激活酶(ubiquitin activating enzyme, E1)抑制剂(TAK-243)对精子中泛素(ubiquitin, Ub)与E1结合的影响;将精子分为鲜精组(Fresh)、DMSO组(DMSO)、获能组(Capacitated)及2.4、4.8和7.2 nmol/L TAK-243组,鲜精组用2 mL PBS重悬精子沉淀;获能组用2 mL获能液重悬精子沉淀;DMSO组及2.4、4.8和7.2 nmol/L TAK-243组分别用2 mL含0.07%DMSO及2.4、4.8和7.2 nmol/L TAK-243的获能液重悬精子沉淀,使用微生物动(静)态图像检测系统检测精子的动力学参数;以Western blotting法检测精子的酪氨酸磷酸化水平;Zn²⁺荧光探针检测精子的Zn²⁺含量;花生凝集素染色检测精子的顶体膜重构;免疫荧光法检测顶体表面精子黏附蛋白(AQN-1、AWN)的表达;体外受精法检测TAK-243...     

枸杞多糖对获能新鲜和冻后猪精子抗氧化能力的影响

为探究枸杞多糖(LBP)对猪精子获能过程中抗氧化功能的影响,用不同浓度LBP(2、4、8和16 mg/mL)处理获能过程中的猪精子,测定精子活率、线粒体活性、顶体完整率和质膜完整性,筛选出最适LBP浓度,进一步测定最适浓度下的抗氧化指标。另外,以氧化激动剂氯化镉孵育猪精子后,用RT-qPCR方法分析SOD-1和Caspase-8处理前后的相对表达量。结果表明:LBP浓度分别为2 mg/mL和8 mg/mL时,鲜精和冻精质量较空白组显著提高(P0.05)。鲜精和冻精获能试验组总抗氧化能力和超氧化物歧化酶活性较获能空白组显著增加(P0.05),丙二醛含量差异不显著(P0.05)。加氯化镉诱导氧化应激后,新鲜精子和冻后精子获能试验组较获能空白组SOD-1 mRNA表达量均显著上调(P0.05),Caspase-8 mRNA表达量显著下调(P0.05)。结论:添加LBP能够在一定程度上提高获能新鲜和冻后猪精子抗氧化能力。     

猪精子获能、顶体反应及冷休克对顶体酶抑制剂的影响

为了探究猪精子在获能、顶体反应及冷休克处理后对精子顶体酶抑制剂表达量的影响,以及顶体酶抑制剂在精子中何时被降解,低温是否会损伤顶体酶抑制剂,利用SDS-PAGE、Western blot分析射精精子、获能精子、顶体反应精子和冷休克精子组的总蛋白种类及猪精子顶体酶抑制剂表达量的变化。结果显示:射精精子处理组与获能精子、顶体反应精子处理组的顶体酶抑制剂表达量差异显著(P<0.05),且获能和顶体反应处理组间的差异不明显(P>0.05);射精精子与冷休克精子处理组的顶体酶抑制剂表达量差异极显著(P<0.01),且冷休克处理组的顶体酶抑制剂出现异常表达。推测:精子在获能或顶体反应期间,顶体酶抑制剂可能通过泛素-蛋白酶体途径被降解,释放出有活性的顶体酶;低温可能导致顶体酶抑制剂蛋白结构的改变或损坏,导致其表达量异常。     

水苏糖对猪精液冷冻保存效果的影响

为了提高猪精液冷冻保存效果．试验采用在传统的ZO稀释液基础上分别添加1％、2％、4％、8％的水苏糖的方法．研究不同浓度水苏糖对猪精液冷冻后精子质量的影响。结果表明,水苏糖相对于ZO稀释液能够显著改善和提高猪精液的冷冻效果,其最佳添加浓度为4％,冷冻一解冻后猪精子活力、活率、质膜完整性以及顶体完整率均显著提高,水苏糖可以明显抑制精子获能,获能处理前精子获能率仅为32．4％,而获能处理后降为28．6％。有利于抑制精子获能,精液稀释液中甘油的适宜添加浓度为3％,说明水苏糖与甘油共同作用能在冷冻一解冻过程更加有效地保护精子。     

不同浓度肝素对塔里木马鹿精子体外获能效果的影响

为了探讨不同浓度肝素对塔里木马鹿精子体外获能的影响,试验随机取塔里木马鹿冻融精子,添加到SP-TALIP获能液中并添加不同浓度(0,10,20,50,100μg/m L)的肝素,在显微镜下检测0,2,4,6,8小时时的精子活力,试验采用金霉素(CTC)染色法检测精子获能率及顶体反应率等指标,探讨不同浓度肝素对塔里木马鹿精子活力、存活时间、获能率、顶体反应率的影响。结果表明:精子活力随肝素浓度升高而呈下降趋势,4 h后10μg/m L和20μg/m L肝素组精子活力显著高于其他组(P0.05),其中20μg/m L肝素组精子存活时间最长,显著高于其他组(P0.05)。随着培养时间的延长,各试验组精子获能率与对照组相比明显提高,2小时、4小时时20μg/m L肝素组精子获能率显著高于其他组(P0.05);各试验组精子顶体反应率与对照组相比有升高趋势。说明获能液中添加20μg/m L肝素可有效诱导塔里木马鹿精子体外获能。     

甲基-β-环化糊精对猪体外受精及早期胚胎发育的影响

为了优化猪体外受精技术体系,本试验探索了甲基-β-环化糊精(methyl-beta-cyclic dextrin,MBCD)对猪体外受精以及早期胚胎发育的影响。在体外受精0和4 h向受精液(modified Tris-buffered medium,mTBM)中添加不同浓度(0,0.5,1,2,5,10,15,20μmol/mL)的MBCD,受精孵育结束后转至PZM-3培养液中进行胚胎培养。对各处理组卵母细胞的受精情况以及胚胎发育能力进行了系统的检测,并用金霉素(chlortetracycline,CTC)染色法评估了MBCD处理后精子获能状态。结果显示:1)体外受精0 h添加5μmol/mL MBCD组的卵裂率、囊胚率、囊胚细胞数显著高于(P<0.05)对照组和除10μmol/mL MBCD组之外的其他试验组。2)体外受精0 h添加5和10μmol/mL MBCD组、单精入卵率显著高于(P<0.05)对照组和其他试验组,而多精入卵率显著低于(P<0.05)对照组和其他试验组。3)添加5μmol/mL MBCD组,0～1 h,F型精子迅速减少(78.56～19.43),B型精子迅速增加(10.79～69.86);1～4 h,F型精子和B型精子基本保持不变(B型:69.86～78.78,F型:19.43～9.11)。上述结果表明在体外受精0 h向mTBM中加入5μmol/mL MBCD可以显著提高获能精子比例,减少多精受精发生,提高早期胚胎发育潜能。     

β-谷甾醇、淫羊藿苷对猪精子体外获能效果的影响

探讨中药单体成分β-谷甾醇(β-sitosterol)、淫羊藿苷(Icariin,Ica)对猪精子体外获能的影响,以期提高体外受精效果.以mTBM+肝素获能液为对照组,分别添加β-谷甾醇、淫羊藿苷的低、中、高3个剂量为试验组,利用金霉素荧光染色(chlortetracycline,CTC)法结合体外受精检验体外获能效果.在mTBM+肝素中添加β-谷甾醇2(中剂量0.08 mg/L)、淫羊藿苷2(中剂量17 mg/L)的B型精子率(获能精子)显著高于对照组和其他剂量组(P＜0.05),F型精子率(未获能精子)显著低于对照组和其他剂量组(P＜0.05),AR型精子率(发生顶体反应精子)与对照组和其他剂量组差异不显著(P0.05),卵裂率和囊胚率均极显著高于对照组和其他剂量组(P＜0.01);表明中药单体成分β-谷甾醇、淫羊藿苷能够显著促进猪精子体外获能效果.     

添加咖啡因、亚牛磺酸对牛精子功能的影响

为研究获能液中添加咖啡因和亚牛磺酸对牛精子功能的影响,本研究将荷斯坦牛冻精解冻后分别添加在含不同浓度咖啡因(0、2.5、5.0、7.5mmol/L)或亚牛磺酸(0、5、10、20、40μmol/L)的获能处理液中,且每个处理组加入约200μL的精液,在CO_2培养箱里经上游处理45min,以评估咖啡因和亚牛磺酸对牛精子活力、顶体及质膜完整性的影响,进而探讨在获能液中亚牛磺酸替代咖啡因的效果。结果显示,添加2.5、5.0mmol/L咖啡因组经上游法获能处理后的牛精子活力和顶体完整率均显著高于对照组(P0.05),且2.5mmol/L咖啡因组精子活力最高;添加10、20μmol/L亚牛磺酸组经上游法获能处理后的牛精子活力、顶体完整率和质膜完整率均显著高于对照组(P0.05),且20μmol/L亚牛磺酸组的精子功能参数值最高;将筛选的最佳浓度2.5 mmol/L咖啡因和20μmol/L亚牛磺酸采用同样的方法处理,发现20μmol/L亚牛磺酸组的精子顶体完整率和质膜完整率均显著高于2.5mmol/L咖啡因组和对照组(P0.05)。因此,20μmol/L亚牛磺酸可以替代2.5mmol/L咖啡因用于体外受精体系中的精子获能处理,有助于提高精子功能参数。     

钙离子对猪精子活力及蛋白磷酸化调节作用研究

钙离子(Ca2+)参与哺乳动物精子获能、超激活运动和顶体反应等多个生理过程,但其作用机理尚未明确。本研究旨在探讨Ca2+在猪精子获能过程中对精子活力和蛋白磷酸化的影响及其作用机制。采用计算机辅助精子活力分析仪(CASA)及蛋白免疫印迹方法测定不同Ca2+浓度处理后精子活力参数及蛋白磷酸化水平变化,同时,利用细胞免疫荧光技术对不同处理组精子样品磷酸化蛋白进行细胞亚组分定位。CASA结果显示,随着Ca2+浓度增加,猪精子活力参数呈现先增加(1.0 mmol/L)后降低(3.0 mmol/L)的趋势;免疫印迹结果发现,低浓度钙离子(0.5 mmol/L)促进精子蛋白磷酸化,而高浓度钙离子(4.0 mmol/L)显著抑制蛋白磷酸化;免疫荧光揭示,4.0 mmol/L钙离子处理组鞭毛处磷酸化蛋白明显少于未获能组和获能组;c AMP-PKA信号通路调节因子c AMP和IBMX以及钙调蛋白抑制剂W7和CZ均能有效缓解高浓度钙离子对猪精子蛋白酪氨酸磷酸化的抑制作用。结果提示,钙离子对猪精子活力及蛋白磷酸化起双重调节作用:即低浓度钙离子(0.5 mmol/L)有助于提高猪精子活力及蛋白磷酸化,高浓度钙离子(4.0 mmol/L)抑制精子活力和蛋白磷酸化;而高浓度钙离子(4.0 mmol/L)可能通过c AMPPKA信号通路和Ca2+/Ca M通路抑制鞭毛处与精子活力有关的蛋白(动力蛋白或轴丝蛋白)磷酸化,进而抑制精子活力。     

肉碱对冻融猪精子总抗氧化能力、抗氧化酶基因及凋亡相关基因表达的影响

试验旨在探究肉碱对冻融猪精子质量、抗氧化、抗凋亡及精卵结合能力的影响。试验分鲜精组和冻融组,冻融组的肉碱浓度分别为0、0.025、0.05、0.075 mg/mL,对冻融后的精子质量、总抗氧化能力、抗氧化酶相关基因及凋亡相关基因mRNA表达、精卵结合能力进行检测。结果显示,在冻融组中,经过肉碱处理的精子存活率、质膜完整率和顶体膜完整率均显著高于0 mg/mL处理组(P0.05),其中肉碱浓度为0.05 mg/mL时改善效果最好;经过冻融处理的精子中丙二醛(MDA)浓度与鲜精组相比显著升高(P0.05),其中肉碱浓度为0.05 mg/mL时显著低于其他肉碱处理组(P0.05);与鲜精组相比,各冻融组精子总抗氧化能力均显著降低(P0.05),肉碱浓度为0.05 mg/mL时总抗氧化能力最高。此外,与鲜精组相比,0 mg/mL肉碱处理组中凋亡相关基因Caspase-3与Bax的相对表达量显著升高(P0.05),抗凋亡基因Bcl-2的相对表达量显著降低(P0.05),抗氧化酶相关基因SOD2、CAT与GPx的相对表达量显著降低(P0.05);冻融组精卵结合能力均下降,但肉碱浓度为0.05 mg/mL时可得到显著改善(P0.05)。结果表明,添加肉碱可以改善冻融猪精子的质量、抗氧化能力、抗凋亡能力及精卵结合能力。     

LDL对玻璃化冷冻解冻培养MⅡ期猪卵母细胞线粒体膜电位和透明带泛素化水平的影响

本试验旨在探究添加低密度脂蛋白（low density lipoprotein,LDL）对玻璃化冷冻解冻后MⅡ期猪卵母细胞发育率、线粒体膜电位及透明带泛素化水平的影响。采用线粒体膜电位特异性探针JC-1检测各处理组线粒体膜电位,并采用SDS-PAGE及Western blotting方法分析不同处理组MⅡ期猪卵母细胞透明带蛋白泛素化水平。结果显示,玻璃化冷冻法处理中,10 mg/mL LDL处理组MⅡ期卵母细胞正常率和成熟率（71.92%和69.86%）显著高于对照组（58.26%和54.55%）（P<0.05）,最接近未冷冻组。10 mg/mL LDL处理组MⅡ期卵母细胞线粒体膜电位显著高于对照组、1和20 mg/mL LDL组（P<0.05）。免疫印迹结果显示,未冷冻组和LDL处理组MⅡ期卵母细胞ZP1、ZP2及ZP3蛋白分别在61、80、106 ku发生不同程度的泛素化标记;10 mg/mL LDL处理组ZPs（ZP1、ZP2、ZP3）蛋白泛素化水平显著高于1和20 mg/mL LDL组（P<0.05）,但显著低于非冷冻组（P<0.05）。结果表明LDL可改善玻璃化冷冻解冻培养后MⅡ期猪卵母细胞成熟率、线粒体膜电位及透明带泛素化水平。     

纳米氧化锌对17℃保存猪精子质量的影响

为了评价纳米氧化锌颗粒(ZnO NPs)对17℃猪精子保存质量的影响，本试验在17℃保存猪精子稀释液中添加20,50,100,200 mg/L ZnO NPs,对保存精子质量和功能进行分析。结果显示，与对照组比较，添加50 mg/L ZnO NPs可以显著提高保存精子的总抗氧化能力(P<0.05),降低保存精子丙二醛含量(P<0.05)。50,100,200 mg/L ZnO NPs处理组精子膜完整性显著高于对照组(P<0.05),骨架蛋白和膜蛋白磷酸化水平显著上调(P<0.05),100,200 mg/L处理组精子全蛋白磷酸化水平显著上升，且定位于精子鞭毛中段和主段。ZnO NPs添加不影响cAMP/PKA信号通路。推测ZnO NPs可能通过提高抗氧化能力来有效提高猪精子活力，消除过量丙二醛，提高猪精子蛋白磷酸化水平，从而提升膜完整性。     

海藻糖对猪精液冷冻保存效果的影响

在传统的Tris-柠檬酸-葡萄糖稀释液基础上，分别添加25％、50％、75％、100％的海藻糖，研究不同浓度海藻糖对猪精液冷冻后精子质量的影响。结果表明，海藻糖相对于对照TCG稀释液能够显著改善和提高猪精液的冷冻效果，其最佳添加浓度为25％，冷冻-解冻后猪精子活力、活率、线粒体活性、质膜完整性以及顶体完整率均显著提高（P〈0．05），分别达到41．38％、46．34％、44．56％、43．51％和64．09％。海藻糖可以明显抑制精子获能，获能处理前精子获能率仅为3．68％，而获能处理后达到41．82％，有利于促进精子获能。精液稀释液中甘油的适宜添加浓度为2％，海藻糖只有与甘油共同作用，才能在冷冻-解冻过程更加有效地保护精子。猪精子活力、活率、线粒体活性、质膜完整率、顶体完整率等之间存在极显著的正相关关系（P〈0．01），而与获能处理前精子的获能率存在显著的负相关关系（P〈0．05）。