猪细小病毒重组酶聚合酶扩增快速检测方法的建立

试验旨在建立一种简单、快速检测猪细小病毒（porcine parvovirus,PPV）的重组酶聚合酶（recombinase polymerase amplification,RPA）检测方法,为中国PPV的防控和诊断提供一种新的、可靠的技术支持。本研究基于PPV VP2基因的保守序列,设计合成1对RPA引物探针,通过对反应时间的优化,建立38℃恒温水浴锅检测PPV的RPA方法。结果表明,所建立的RPA方法在38℃水浴锅中恒温反应30 min,能够特异性的检测PPV;以重组质粒pPPV-VP2作为模板,RPA的检测限为10²拷贝,同本研究中应用的实时荧光定量PCR方法检测限一致,比普通PCR方法高100倍;RPA方法对疑似PPV感染临床样品的阳性检出率为82.6%,略低于实时荧光定量PCR的检出率（86.9%）,明显高于普通PCR的阳性检出率（66.7%）。本研究建立的RPA方法操作简单、反应快速,结果确实可靠,适用于PPV的快速检测。     

炭疽杆菌双重荧光定量PCR检测技术的建立和应用

为快速和准确检测炭疽杆菌,本研究以炭疽杆菌染色体上的BA5345基因和pXO1质粒上的PA基因为靶基因设计特异性引物和探针,建立了炭疽杆菌双重荧光定量PCR检测方法,对其反应的特异性、敏感性和重复性进行了分析,并与常规PCR方法一起对临床样品进行检测。结果显示,所建立方法特异性强,与蜡样芽胞杆菌群中其他芽胞杆菌无交叉反应;对BA5345基因和PA基因的最低检测限分别为8.0和7.8拷贝·μL~(-1),标准曲线相关系数大于0.99,组内和组间CV均小于1.5%。对35份污染皮毛样品检测显示BA5345基因和PA基因的检出率分别为80.0%和82.9%,与常规PCR检测方法相比,敏感性更高。本研究为炭疽杆菌的检测和流行病学调查提供了一种快速、准确的检测方法。     

伪狂犬病病毒野毒和疫苗毒双重RPA鉴别检测方法的建立和应用

为建立伪狂犬病病毒(PRV)野毒和疫苗毒的快速鉴别检测方法,本研究基于PRV gB和gE基因保守区域设计引物,建立了一种双重重组酶聚合酶扩增方法(RPA)。本研究所建立的双重RPA方法在38℃水浴锅中恒温反应20min,能够在同一个反应体系中实现对PRV野毒和疫苗毒的特异性鉴别检测,而与其它常见的猪病毒没有交叉反应。所建立的双重RPA方法对PRV gB和gE基因的检测限均为102拷贝,并且与荧光定量PCR方法检测限一致。通过对4株不同PRV株和37份临床样品的检测,结果表明双重RPA方法能够实现对不同PRV株的检测,对临床样品中PRV gB和gE基因的检出率均为45.9%(17/37),与荧光定量PCR方法检测的符合率为100%。本研究所建立的双重RPA方法反应快速、操作简便、结果可靠,可有效应用于对PRV野毒和疫苗毒的快速鉴别检测。     

基于重组酶聚合酶扩增技术的犬细小病毒快速检测方法的建立

为建立一种快速、简便检测犬细小病毒(CPV)的方法,本研究基于CPV VP2基因的保守序列,设计合成引物,通过对反应条件的优化,建立了CPV的重组酶聚合酶(RPA)检测方法。该方法在38℃恒温反应15 min即可快速、特异性的检测出CPV。特异性试验结果显示,除CPV (BJ-2b株、BJ-2c株)外,犬瘟热病毒、犬冠状病毒、犬腺病毒、犬副流感病毒等检测均为阴性;敏感性试验结果显示,以重组质粒pEASY-CPV-VP2为模板,RPA的检测下限为1×10~1拷贝/μL,其敏感度比普通PCR方法高10倍。利用建立的RPA方法对疑似CPV感染的临床样品的阳性检出率为88%,高于普通PCR的检出率(82%)和胶体金的检出率(76%)。本研究建立的CPV RPA检测方法操作简单,反应灵敏,结果确实可靠,适用于CPV的快速检测。     

非洲猪瘟病毒RPA等温检测方法的建立

为建立一种简单、快速的非洲猪瘟病毒(ASFV)分子检测方法,基于ASFV P72基因保守序列,设计并合成引物,建立了一种ASFV重组酶聚合酶扩增(RPA)等温检测方法。结果表明,所建立的RPA方法在38℃水浴锅中恒温反应30 min,即可实现对目的片段的有效扩增;以包含ASFV P72基因的ORF质粒为模板,RPA的检测限达到10~2 copies,同世界动物卫生组织(OIE)推荐的实时荧光PCR方法检测限一致,但比OIE推荐方法的检测限高10倍;RPA仅特异性扩增ASFV P72基因,对FMDV、CSFV、PRRSV、PRV和PCV-2基因组c DNA或DNA没有扩增。本研究所建立的RPA方法操作简单、反应快速、检测成本低、结果确实可靠,为非洲猪瘟的一线防控提供了一种新的、可靠的技术支持。     

羊源多杀性巴氏杆菌重组酶聚合酶扩增诊断方法的建立

为建立适用于羊源多杀性巴氏杆菌的重组酶聚合酶扩增（RPA）诊断方法,本研究依据前期测序鉴定的羊源多杀性巴氏杆菌KMT1基因序列构建pET-28a （＋）-KMT1质粒标准品。设计基于RPA技术的特异性引物及RPA荧光探针,建立实时荧光RPA方法的最适反应体系。采用10倍梯度连续稀释的质粒标准品检测该RPA方法的敏感性并绘制相关性曲线;以10种不同菌株的基因组DNA为模板验证方法的特异性;用感染多杀性巴氏杆菌的山羊及小鼠组织样品对方法的可靠性进行验证。结果显示,本试验建立的实时荧光RPA方法最适反应温度为39 ℃,最佳引物为KMT1-Fe1,灵敏度达100拷贝/μL,检测下限为10拷贝/μL。与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副伤寒沙门氏菌、副溶血弧菌、绿脓杆菌、产酸克雷伯菌、布鲁氏菌S2株和鲍曼不动杆菌均无交叉反应。对13个组织样本进行检测,阳性率为76.9%,与实时荧光定量PCR检测结果的符合率达92.3%。综上所述,本研究建立的羊源多杀性巴氏杆菌实时荧光RPA方法具有特异性强、灵敏度高、可靠、快速便捷等特点,适用于多杀性巴氏杆菌的临床分子诊断。     

鲤浮肿病毒荧光RAA快速检测方法的建立

为建立一种简单、快速的鲤浮肿病毒(CEV)重组酶介导的链替换扩增(RAA)检测方法,本研究通过比较分析CEVP4a基因序列,设计引物与探针,经过筛选优化,建立了实时荧光RAA检测方法。结果显示,该方法在39℃恒温反应20min即可快速、特异性地检测出CEV,与常见的鱼类病毒不发生交叉反应,其对质粒标准品的检测下限为2.8×10^1拷贝/μL,组内和组间变异系数均小于5%。利用本研究建立的方法对35份临床鲤科鱼类样品进行检测,检测结果与荧光定量PCR方法结果一致。本研究建立的检测方法操作简单,特异性强、敏感性高,结果可靠,不依赖于复杂的仪器,适用于现场对CEV的快速检测。     

Taqman-MGB探针法检测炭疽杆菌

根据GenBank中炭疽杆菌的主基因组上gyrA基因,毒力因子px01上pagA基因和侵袭因子px02上的CapA基因分别设计引物和对应Taqman-MGB探针,建立了检测炭疽杆菌的实时定量PCR方法。该方法具有良好特异性,仅对炭疽杆菌检测结果为阳性,而与蜡样芽孢杆菌、苏云金杆菌、巨大芽孢杆菌、沙门菌、大肠杆菌、链球菌、铜绿假单孢杆菌无交叉反应,检测灵敏度最低可达100copies/μL。对24份皮毛盲样和120份送检样品检测结果表明建立的定量PCR方法与商业化定量PCR试剂盒的符合率为100%。Taqman-MGB探针方法灵敏、特异、重复性好,可应用于炭疽杆菌的快速诊断与监测。     

柑橘黄龙病菌的重组酶聚合酶扩增(RPA)检测

【目的】本研究旨在建立黄龙病菌的重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)快速检测体系,丰富柑橘黄龙病的高效简便检测方法。【方法】以黄龙病菌株psy62的保守基因序列设计并筛选特异性引物,经灵敏度比较和检测特异性验证,建立该病的RPA检测体系。经PCR、RPA和实时荧光PCR对87份柑橘样品的黄龙病菌检测,验证RPA检测体系的适用性。【结果】建立了黄龙病菌的RPA检测方法。(1)特异性：能特异性检测柑橘黄龙病。(2)灵敏度：RPA是PCR的100倍,与实时荧光PCR相当。(3)检测体系：只需20min,大幅提高检测效率。(4)适用性：RPA与实时荧光PCR检出率均为35.63%,比PCR的31.03%略高。【结论】建立了黄龙病菌的RPA检测方法,具有特异性强、灵敏度高、检测快速、无需特殊仪器设备和操作简便等特点,为柑橘黄龙病提供了高效简便的快速检测手段。     

鸭腺病毒3型荧光RPA恒温快速检测方法的建立与应用

鸭腺病毒3型(Duck adenovirus type 3,DAdV-3)是我国近年来新发的禽腺病毒，致病力较强，已经严重影响到鸭养殖业。为实现对DAdV-3的快速检测，以DAdV-3的Hexon基因为靶基因，设计特异性重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification, RPA)引物和探针，并构建重组标准质粒命名为DAdV-H-18T,优化RPA反应条件后，建立DAdV-3的荧光RPA恒温快速检测方法。结果显示，该检测方法最佳反应条件为38℃、18 min;特异性强，与其他常见鸭病病原如鸭肝炎病毒、鸭坦不苏病毒等均无交叉反应。对重组质粒DAdV-H-18T的最低检测限为1 copy/μL;采用建立的RPA检测方法和qPCR对55份鸭组织临床样本进行检测，阳性率分别为65.4%、50.9%,检测符合率为92.7%。研究建立的DAdV-3荧光RPA方法，检测速度快，敏感性高，特异性强，为该病临床快速检测提供了有力工具。     

快速检测炭疽杆菌的实时荧光定量PCR方法的建立及评价

为建立一种能快速鉴定炭疽杆菌的检测技术,本研究根据炭疽杆菌染色体上的TJHP和BA5345 2个靶点,分别设计4对引物和2个探针,对10份已知浓度的炭疽杆菌DNA和阴性对照菌株DNA进行检测,将浓度最大的炭疽杆菌DNA进行10倍倍比稀释,用于检测4对引物及其探针的灵敏度,并选出2个针对TJHP和BA5345靶点的特异性强及灵敏度高的引物和探针进行重复性实验。结果显示,4对引物及其探针特异性较强,FP2/RP2和FP4/RP4 2对引物的灵敏度为4.513×10^-5 ng/μL;该荧光定量PCR方法重复性好(t=1.178,P=0.332)。FP2/RP2和FP4/RP4 2对引物及其探针可用于炭疽杆菌感染初期的快速筛查以及临床辅助诊断。     

非洲猪瘟病毒多基因家族成员MGF360-12L RPA检测方法的建立

为建立一种简便、快速的针对非洲猪瘟病毒(ASFV)多基因家族成员MGF360-12L的分子检测方法,基于MGF360-12L基因序列,设计并合成引物,建立重组酶聚合酶扩增(RPA)等温检测方法。结果表明,于35℃恒温反应30 min,即可实现对目的片段的稳定扩增;以含有MGF360-12L基因的重组质粒为模板,RPA反应的检测限达到10~3个拷贝,同普通PCR方法检测限一致;此外,该RPA方法仅特异性扩增非洲猪瘟病毒MGF360-12L基因,对PEDV、FMDV、CSFV、PRRSV、PRV 和 PCV-2基因组cDNA或DNA没有扩增。本研究建立的RPA方法操作简单、反应快速、检测成本低,能够为ASFV相关基因缺失毒株的鉴别诊断提供一定技术支持。     

猪流行性腹泻病毒实时荧光RPA等温检测方法的建立

为建立一种简单、快速的猪流行性腹泻病毒（PEDV）分子检测方法,本研究基于PEDV病毒M基因保守序列,设计一系列扩增引物及其荧光探针,以包含PEDV病毒M基因片段的pUC57质粒为模板,同时以包含猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒2型（PCV2）及古典猪瘟病毒（CSFV）等病毒膜蛋白或核衣壳蛋白基因序列的质粒作为对照,建立了一种PEDV实时荧光重组酶聚合酶扩增（RPA）等温检测方法,测定了方法的特异性与敏感性。结果表明,该实时荧光RPA方法可在39℃恒温反应20 min特异性扩增PEDV病毒M基因,与TGEV、PRRSV等对照病毒基因无交叉反应,其检测限为10拷贝/μL。应用该实时荧光RPA方法可有效检测出血浆及血浆蛋白粉中的PEDV核酸。本研究建立的实时荧光RPA检测方法简单、快速、灵敏度高,可为PEDV的检测防控提供一种新的、可靠的技术支持。     

基于重组酶聚合酶扩增技术的犬冠状病毒快速检测方法的建立

为建立一种快速、简便检测犬冠状病毒(CCoV)的方法,本试验基于犬冠状病毒M基因的保守区域设计特异性引物,通过优化反应条件,建立了CCoV的重组酶聚合酶扩增检测方法(RT-RPA)。试验结果表明,所建立的RT-RPA方法在35℃恒温反应15 min即可检测出100个拷贝的体外转录RNA,且与犬的其他常见病毒,如犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬副流感病毒等,无非交叉反应,表明所建立的CCoV RT-RPA具有良好的特异性及较高的敏感性。使用RT-RPA对25份临床样品的检测结果显示,CCoV的检出率为48%(12/25),该结果与荧光定量PCR的检测结果完全一致。表明本试验所建立的CCoV RT-RPA检测方法操作简单、反应快速灵敏,适用于CCoV的快速检测。     

单核细胞增生李斯特菌重组酶聚合酶恒温扩增快速检测方法的建立

为建立基于重组酶聚合酶等温扩增(RPA)技术的单核细胞增生李斯特菌快速检测方法,本研究针对单增李斯特菌的基因组序列设计特异性引物,通过对反应体系的优化确定最佳反应温度为42℃和最佳反应时间为15 min。特异性试验结果显示:本研究建立的RPA方法与伊氏李斯特菌、无害李斯特菌、斯氏李斯特菌、格氏李斯特菌、肠致病性大肠埃希菌O157、沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌均无交叉反应;敏感性试验结果显示:该方法对单增李斯特菌基因组DNA和菌液的最低检出限分别为3×10~2拷贝/μL和10~3cfu/mL。利用本研究建立的RPA快速检测方法分别对50份人工污染的牛奶、牛肉和鱼肉样品进行检测,并与荧光定量PCR检测结果进行对比,结果一致。本研究建立的单增李斯特菌RPA检测方法具有反应快速、灵敏度高、特异性强、操作简便的特点,适用于基层实验室和现场快速检测。     

狂犬病病毒实时荧光RT-RPA等温检测方法的建立

为了建立一种灵敏、特异、快捷的实时荧光重组酶聚合酶扩增(RPA)检测狂犬病病毒的方法,依据狂犬病病毒不分节段单股负链中N基因相对保守的核苷酸序列,设计了4条引物及1条探针,筛选出一套可用于RPA引物与探针组合,建立了狂犬病病毒的荧光RT-RPA检测方法,测试了该方法灵敏度和特异性,并进行了临床验证。结果显示,本研究建立的RPA方法在39℃恒温反应仅需20 min,能够特异的检测狂犬病病毒,最低检测限为1.83×10~1 Copies/μL,临床样品测试与标准方法结果一致。表明本研究建立的检测狂犬病病毒的荧光RT-RPA方法具有特异,灵敏,快速,简便的特点,适用于现场检测以及在基层实验室推广应用。     

炭疽杆菌双毒力因子荧光PCR检测方法的建立及应用

由炭疽杆菌（Bacillus anthracis）引起的炭疽（anthrax）是严重危害人类和家畜健康的重大传染病。为了提高出入境口岸对不明粉未快件样品的查验效率,防范通过包裹夹带生化武器,本研究使用Taq Man探针技术,建立了针对炭疽杆菌两种毒力质粒pOX1和pOX2的双重荧光PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏性和稳定性进行了试验。结果显示：本研究建立的炭疽杆菌双重荧光PCR检测方法具有较强的特异性,只特异性检出炭疽杆菌pOX1和pOX2,而与金黄色葡萄球菌等19种对照病原菌均无交叉反应;灵敏度与单重荧光PCR方法相近,最低检测限可达10 copies/μL;稳定性好,反应体系低温保存2、4、6、8个月后,检测阳性质粒的Ct值和峰值相差不大。应用该方法检测600份猪牛羊组织样本,均未检出炭疽杆菌阳性核酸。本研究建立的双重荧光PCR检测方法为炭疽杆菌的快速检测提供了技术支撑。     

副猪嗜血杆菌及巴氏杆菌双重荧光定量PCR检测方法的建立

为建立副猪嗜血杆菌(Hps)、多杀性巴氏杆菌(Pm)的双重荧光定量PCR检测方法,本研究基于Hps的Omp P2基因,Pm的PlpE基因设计两对特异性引物及探针,通过对反应条件优化,建立了一种同时检测Hps及Pm的双重荧光定量PCR方法。该方法能够特异性地检测Hps和Pm,其对重组质粒标准品的最低检测浓度分别为5.60×10^2拷贝/μL、7.58×10^2拷贝/μL。双重与单一荧光定量PCR最低检测限相同,且均是常规PCR的100倍。重复性试验结果显示,该方法的组内和组间变异系数均小于2.5%。临床应用结果显示:该方法对阳性样品的检出率为53.57%,明显优于常规PCR和细菌分离鉴定。该方法能够用于两种疾病的同时检测和快速排查疾病。为两种疾病的防治提供有效检测工具。     

梅迪-维斯纳病毒实时荧光RPA检测方法的建立

为实现对梅迪-维斯纳病毒(MVV)的快速检测，根据MVV gag基因保守序列设计特异性引物和探针，通过优化反应条件和反应体系，建立了MVV的实时荧光RPA检测方法，并通过灵敏度、特异性、重复性试验及样品复核检测进行评价。结果显示：该方法最佳反应温度为39℃，用时短，20 min即可完成检测；灵敏度高，检测下限可达10^-1 pg/μL，比常规PCR检测结果灵敏约10⁴倍；特异性强，与小反刍兽疫病毒、羊败血性链球菌、牛肠道病毒、传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型、肺炎支原体等继发呼吸系统症状病原无交叉反应；重复性好，对于相同质量浓度的模板DNA检测变异系数均小于10%；可有效检测出MVV，与PCR结果一致。综上所述，本研究建立的MVV荧光RPA检测方法适用于MVV的临床快速检测，可为该病的诊断及防控提供依据。     

A型猪塞内卡病毒TaqMan荧光定量PCR方法的建立

本研究针对A型猪塞内卡病毒(Senecavirus A, SVA)基因组保守区域设计了特异性引物及探针,建立了快速检测SVA的Taq Man荧光定量PCR方法。结果显示,以构建的重组质粒为标准品建立的Taq Man荧光定量PCR方法,标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数达0.9974;特异性良好,与口蹄疫病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒不存在交叉反应;对SVA核酸最低检测下限为3.75 copies/μL,而普通PCR最低检测下限为3.75×103 copies/μL;批内和批间的变异系数为均小于5%,重复性良好。本研究建立的SVA TaqMan荧光定量PCR方法为检测猪水疱性疾病病原提供了一种快速、灵敏的检测方法,为开展SVA流行病学调查提供了技术支持。