弓形虫微线体蛋白MIC3基因的克隆及原核表达

根据编码MIC3的已知基因序列设计并合成一对引物,应用PCR技术从弓形虫RH株的基因组DNA中扩增编码MIC3的全长基因,克隆入pGEX-KG表达载体,转化入E.coli DH5α感受态细胞,经含氨苄青霉素琼脂平板筛选,小量抽提质粒进行酶切、PCR及DNA测序鉴定.然后阳性重组质粒转化入E.coli BL21-CodonPlus,IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot分析鉴定.结果显示,扩增的MIC3基因与GenBank中相应基因序列（AJ132530）的同源性达99.6 %,表达的MIC3融合蛋白表观分子量约为66 ku,且可被兔抗弓形虫免疫血清识别.说明所获得的表达蛋白质具有一定的反应原性,为下一步利用重组蛋白建立弓形虫的诊断方法和研制弓形虫的亚单位疫苗奠定了基础.     

弓形虫ROP2基因的克隆及原核表达

应用PCR技术从刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）RH株的基因组DNA中扩增编码棒状体蛋白ROP2（rh—potryprotein2）的部分基因，构建pGEX—KG—ROP2重组表达质粒，经酶切、PCR及DNA测序鉴定后，将阳性质粒转入E．coli BL21CodonPlus中，在IPTG诱导下表达，表达产物用SDS—PAGE和Western—blot分析鉴定。结果表明，扩增的ROP2基因与GenBank上发表的相应基因序列的同源性达99.9％，该基因可以在大肠杆菌中高效表达，表达的ROP2融合蛋白表观相对分子质量约为64000，可被兔抗弓形虫免疫血清识别。     

山羊IL-2基因真核表达质粒构建及在MDBK细胞中的表达

本实验成功构建了真核表达质粒pVAX1-IL-2,并对质粒进行PCR,双酶切及测序鉴定,RT-PCR成功验证了目的基因在MDBK细胞中能够转录,同时ELISA验证目的基因在MDBK细胞中能表达.研究结果为pVAX1-IL-2作为核酸疫苗的细胞因子佐剂的应用研究提供生物材料.     

DINH与C3d3融合基因真核表达质粒的构建

为了构建DINH和mC3d基因融合的分泌型真核表达载体,试验将含有INHα(1～32)基因的pMD19-INH构建含有双拷贝INHα(1～32)基因的真核表达载体pcDNA-DPPISS-DINH,然后将鼠源C3d基因引入DINH基因3′端构建 了一种基于DINH-C3d3的抑制素基因疫苗pcDNA-DPPIS-DINH-C3d3.酶切及测序结果表明,pcDNA-DPPIS-DINH、pcDNA-DPPIS-DINH-sC3d3构建正确.     

弓形虫微线体蛋白MIC3及其构建的核酸疫苗研究进展

弓形虫病（Toxoplasmosis）又称弓浆虫病或弓形体病,是由刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）引起的一种严重人兽共患机会性原虫病。弓形虫属于真球目弓形虫科,是一种专性细胞内寄生原虫,几乎可感染包括人类在内的所有哺乳动物、鸟类和爬行类动物。该病的感染率极为普遍,     

猪食欲肽受体2基因真核表达质粒的构建及其表达

构建带有myc标签和Kozak序列的猪食欲肽受体2(OX2R)基因的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-myc/OX2R,观察在HEK293T真核细胞中的表达。设计带有酶切位点(HindⅢ和XbaⅠ)的特异性引物,采用RT-PCR技术从猪的下丘脑中扩增OX2R基因,并克隆入pcDNA3.1(+)质粒中。用限制性内切酶酶切分析及测序分析证明构建成功后,用脂质体法转染HEK293T细胞,蛋白质印迹法检测OX2R基因的表达。结果,成功构建了带有myc标签和Kozak序列的pcDNA3.1(+)-myc/OX2R重组质粒,蛋白质印迹法检测该质粒可在真核细胞中表达。本研究为将来研究猪食欲肽受体2的功能奠定基础。     

大肠杆菌植酸酶appA2基因真核表达载体的构建及在细胞中的表达

根据已经公布的植酸酶appA2基因序列,设计合成了1对特异性引物,应用RT-PCR技术从大肠杆菌中扩增得到植酸酶appA2基因,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建了重组真核表达质粒pcDNA-appA2,对重组表达质粒鉴定正确后,转染猪PK15细胞,经G418筛选后,通过实时荧光定量PCR检测细胞内appA2表达,同时测定细胞内植酸酶的活性,检测结果表明,本试验成功构建了pcDNA-appA2重组真核表达载体,转染细胞后appA2的表达量是对照组的1 686.55倍,同时具有较好的植酸酶活性,为通过生物反应器制备植酸酶研究奠定了基础。     

弓形虫GJS株pcDNA3-MIC3核酸疫苗的研究

根据GenBank中MIC3基因序列设计1对引物,采用PCR技术从弓形虫GJS株基因组DNA中扩增微线体蛋白3(MIC3)基因片段,克隆到pMD18-T载体,经PCR、酶切及测序鉴定后,阳性重组质粒酶切并亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)后进行PCR、酶切及测序鉴定.重组质粒pcDNA3-MIC3肌肉注射免疫BALB/c小鼠,通过ELISA检测血清特异抗体;经腹腔攻击感染弓形虫GJS株速殖子,观察小鼠的生存时间.结果成功构建了pcD-NA3-MIC3质粒;免疫组小鼠血清检测到特异性抗体;攻击感染后免疫组小鼠平均存活时间较对照组明显延长.表明该核酸疫苗具有较好的免疫原性,能诱导小鼠产生良好的免疫保护作用.     

犬新孢子虫SRS9基因真核重组质粒的构建及在Vero细胞中表达

为构建犬新孢子虫NcSRS9基因真核表达重组质粒,了解NcSRS9表面蛋白基因的生物学特性及其体外表达情况。本试验应用PCR技术获得目片段,构建克隆质粒pMD18-NcSRS9,经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后构建真核表达重组质粒pVAX1-NcSRS9,利用脂质体介导法转染至Vero细胞,以间接免疫荧光方法(IFAT)检测NcSRS9基因在Vero细胞中的表达。结果显示,犬新孢子虫表面蛋白基因NcSRS9基因长度为1 191bp,与GenBank中(EF440644.1)发表的基因核苷酸序列同源性为99%,IFAT检测NcSRS9基因在Vero细胞中获得瞬时表达,为核酸疫苗研究奠定了基础。     

鸡降钙素真核表达质粒pCEP4-CT的构建及细胞表达

构建重组鸡降钙素真核表达载体pCEP4-CT,转染非洲绿猴肾细胞(COS-1)并检测其表达。通过酶切方法自含鸡降钙素(CT)基因的克隆质粒pGEM-T-CT中扩增CT基因,并将其克隆到真核表达载体pCEP4中。阳性克隆鉴定后,在PEI介导下转染非洲绿猴转化肾细胞(COS-1),通过间接免疫荧光试验(IFA)检测CT在COS-1中的表达状况。结果表明,所获重组质粒经过酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确;在COS-1细胞中检测到了CT的表达,为进一步探讨该基因在动物机体中调控钙代谢奠定了基础。     

弓形虫MIC10基因敲除株的构建及鉴定

为了解弓形虫MIC10基因特性,利用CRISPR/Cas9技术构建了弓形虫MIC10基因敲除虫株,通过乙胺嘧啶药物筛选、GFP绿色荧光观察及96孔板筛选阳性敲除虫株,并进行体外和小鼠体内PCR鉴定MIC10基因进一步确定单克隆敲除虫株。结果表明,加入乙胺嘧啶后MIC10基因敲除株能够正常生长,在荧光显微镜下观察敲除株呈现绿色荧光,在96孔板的单孔中筛选出唯一绿色荧光虫体;经体外和小鼠体内PCR鉴定MIC10基因,敲除虫株扩增出1 000 bp的外源片段,未扩增出MIC10基因片段,而在对照组RH虫株扩增出263 bp MIC10基因片段,未扩增出1 000 bp外源片段;说明本试验成功构建并筛选出MIC10基因敲除的单克隆虫株,暂命名为弓形虫KO-MIC10-RH。本试验为弓形虫MIC10基因敲除株的致病性研究奠定基础。     

刚地弓形虫GRA3基因的克隆与表达

采用PCR方法扩增弓形虫GRA3基因,将扩增产物与pMD18-T Simple载体连接,重组质粒经PCR、双酶切鉴定后测序;构建pGEX-4T-1／GRA3表达载体,经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、Western blot分析。结果显示,克隆的GRA3基因片段长687bp,含有1个669bp的开放阅读框,编码222个氨基酸,与GenBank中UK株（AF414079）的同源性为99．8％;表达的融合蛋白为50Ku,能被弓形虫阳性血清识别;表明该融合蛋白具有较好的免疫反应活性。     

弓形虫胚层发育相关蛋白的原核表达及免疫原性研究

试验旨在研究弓形虫胚层发育相关蛋白（TgERP）的免疫原性,以弓形虫RH株的基因组DNA为模板,扩增TgERP基因,将其连接于表达载体pET-30a(+)后,转化至Escherichia coli BL21（DE3）感受态细胞进行IPTG诱导表达,应用Western blotting对重组蛋白的反应原性进行分析,并用纯化后的TgERP蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。结果显示,在37 ℃条件下用1.0 mmol/L IPTG诱导6 h表达可溶性TgERP蛋白的量最大。SDS-PAGE结果显示,目的蛋白分子质量为16.7 ku,以可溶形式表达,纯化后蛋白条带单一。经Western blotting分析,TgERP蛋白有较好的反应原性;制备的多克隆抗体效价较高,可达1∶51200,表明该蛋白具有较好免疫原性。提示,TgERP蛋白可作为血清学诊断方法的候选抗原和弓形虫病疫苗的候选分子,为建立弓形虫新型诊断方法和研制新型弓形虫疫苗奠定了基础。     

Cloning and Eukaryotic Expression Plasmid Construction of Porcine Interleukin-18 Gene

To obtain recombinant eukaryotic expression plasmid of porcine interleukin-18(IL-18), the whole gene of porcine IL-18 gene was amplified from porcine spleen, lung and lymph nodes by RT-PCR and cloned into eukaryotic expression vector pZJ-1. The recombinant expression plasmid pZJ-IL-18 were identified by enzyme digestion and sequencing analysis, and was transfected into 293T cells.The expression of IL-18 was detected by Real-time PCR and Western blotting in both gene and protein levels. The results showed that the eukaryotic expression plasmid of porcine IL-18 was constructed and could express transiently in 293T cells. Western blotting result confirmed that porcine IL-18 polyclonal antibody could react specifically with approximately 17 ku expression products,and indicated that IL-18 could express correctly and be responsive.This study constructed the eukaryotic expression plasmid of porcine IL-18 gene which could express transiently in 293T cells, and laid the foundation for studying function of IL-18.     

猪白细胞介素18基因的克隆及真核表达重组质粒的构建

为获得表达猪白细胞介素18（interleukin-18,IL-18）的真核表达重组质粒,试验通过RT-PCR从猪脾脏、肺脏和淋巴结组织中扩增猪IL-18全基因并定向克隆到真核表达载体pZJ-1,测序分析和酶切鉴定正确后,转染至293T细胞中,并通过实时荧光定量PCR和Western blotting分别在基因和蛋白水平检测IL-18的表达。结果表明,试验成功构建了真核表达重组质粒pZJ-IL-18,且可以在293T细胞中表达IL-18基因。Western blotting试验证实,猪IL-18多克隆抗体能与约17 ku的表达产物发生特异性反应,表明IL-18能正确表达且具有反应原性。本试验构建了表达猪IL-18基因的真核表达质粒,并在293T细胞中瞬时表达,为进一步研究IL-18的功能奠定基础。     

刚地弓形虫微线体蛋白3的研究进展

微线体蛋白3(MIC3)是刚地弓形虫生活史各个时期均能表达的分泌蛋白,具有较强的免疫反应性,在弓形虫对宿主细胞的识别、黏附及入侵过程中发挥重要作用。深入研究弓形虫MIC3有助于研制弓形虫病诊断制剂及疫苗以防制弓形虫病。文章综述了近年来关于MIC3的分子生物学特征、相关疫苗及其用于弓形虫病诊断方面的研究进展。     

弓形虫SAG1基因在蜥蜴利什曼原虫中的表达

利用PCR扩增技术从弓形虫RH株全基因组中扩增出弓形虫抗原基因SAG1,将其克隆入真核表达载体质粒pLEXSY-neo2,构建真核表达穿梭质粒pLEXSY-neo2-SAG1。利用电穿孔转染技术将外源基因表达盒转入蜥蜴利什曼原虫,经G418筛选阳性克隆。表达的外源重组蛋白经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定,证明SAG1重组蛋白在蜥蜴利什曼原虫中得到表达。     

弓形虫DOC2基因C-端的克隆及序列分析

为研究弓形虫DOC2基因作为弓形虫疫苗候选抗原分子的可行性,本试验用RT-PCR技术扩增DOC2基因编码区的C-端并测序。将该基因片段用生物信息学软件翻译为氨基酸序列后,预测弓形虫DOC2蛋白C-端的生物学特性、高级结构和B细胞抗原表位。结果表明,DOC2基因C-端片段长度为1887 bp。将其翻译成氨基酸序列后预测含有11个亲水区域和7个跨膜区。二级结构中含有19个α-螺旋、1个β-转角和17个无规则卷曲。结合柔性区域等分析,DOC2蛋白C-端共含有12个线性B细胞抗原表位。结果表明DOC2蛋白C-端可作为弓形虫疫苗候选分子,为研制新型弓形虫DNA疫苗或表位肽疫苗提供理论基础。