对柔嫩艾美耳球虫敏感株与抗药株ATP酶活性的检测

采用ATP酶试剂盒对柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)11种敏感株与抗药株的4种ATP酶活性进行了检测。结果表明,鸡球虫不仅具有活跃的ATP酶系统,而且其活性因球虫对药物敏感性的不同而表现强弱不同。敏感株的ATP酶活性最强,而各抗药株的ATP酶活性均有不同程度的降低,尤其是氯化锂(Na -K -ATP酶抑制剂)和利多卡因(Na 通道阻断剂)参与诱导产生的马杜霉素诱导抗药株和盐霉素诱导抗药株的Na -K -ATP酶,Mg2 -ATP酶,Ca2 -ATP酶和Ca2 -Mg2 -ATP酶的活性极显著低于相同来源的抗药株和敏感株的活性。本文研究表明,虫株对药物的敏感性可能与ATP酶活性有关,检测ATP酶活性可作为判别柔嫩艾美耳球虫对离子载体类抗球虫药物敏感性或抗药性的指标之一。     

柔嫩艾美耳球虫敏感株与耐药株成熟卵囊中葡萄糖含量的检测

建立了一种采用比色测定中性糖的硫酸-酚法测定柔嫩艾美耳球虫成熟卵囊中葡萄糖含量的方法,并对柔嫩艾美耳球虫(Eimeria.tenella)的敏感株和各种耐药株共9个球虫株的成熟卵囊中葡萄糖含量进行了测定。结果表明,敏感株成熟卵囊中的葡萄糖含量较低,而耐药株成熟卵囊中葡萄糖含量则相对较高,二者比较呈现极显著相关性(P<0.01)。由此可见,柔嫩艾美耳球虫对抗球虫药物的敏感性可能与成熟卵囊中葡萄糖含量有关,通过对成熟卵囊中葡萄糖含量的测定可作为判别柔嫩艾美耳球虫是否耐药的指标之一。     

不同地理株及其杂交株柔嫩艾美耳球虫免疫保护性研究

将不同地理株及其杂交株的柔嫩艾美耳球虫的孢子化卵囊饲喂肉鸡,选择12日龄的AA肉鸡进行免疫,首免的剂量为1×104。免疫10d后攻虫,剂量为1×103。攻虫后以排卵数、增重、粪便记分、盲肠病变记分等指标测定其免疫功能,并计算各株的保护率。结果表明:杂交株的柔嫩艾美耳球虫的免疫保护率明显高于亲本株。     

鸡柔嫩艾美耳球虫西宁株的分离与鉴定

[目的]鉴定鸡柔嫩艾美耳球虫西宁株。[方法]采用单卵囊分离技术从西宁当地鸡粪便中获得1株纯种球虫,经鸡体传代增殖,对该虫体的寄生部位、潜伏期、孢子化时间、形态结构等指标进行观察和测定。[结果]该虫株寄生于鸡的盲肠,卵形指数为1．22,最短孢子化时间为18h,潜伏期为114h。卵囊为卵圆形,卵囊壁光滑,呈黄绿色,孢子化卵囊未见卵膜孔和卵囊残体;孢子化卵囊平均为20．08μm×16．55μm。孢子囊纺锤形,有一斯氏体,其平均大小为8．65μm×4．90μm。综合鉴定该球虫为柔嫩艾美耳球虫,并暂命名为柔嫩史美耳球虫西宁株。[结论]该研究为进一步研究球虫的致病性和药物效应奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫长春株的抗药性试验研究

对柔嫩艾美耳球虫长春株的抗药性进行试验研究。用最适抗球虫活性百分率、病变记分减少率、相对卵囊产量和抗球虫指数4项指标进行综合判定,观察柔嫩艾美耳球虫长春分离株对氯苯胍、克球粉、地克珠利、马杜拉霉素、氨丙啉、盐霉素、莫能菌素和常山酮的抗药性。表明:柔嫩艾美耳球虫长春分离株对地克珠利和马杜拉霉素敏感,对莫能菌素轻度耐药,对克球粉和常山酮中度耐药,对氯苯胍、氨丙啉和盐霉素重度耐药。本地区防治柔嫩艾美耳球虫可合理使用地克珠利、马杜拉霉素和莫能菌素,对克球粉、常山酮慎用,氯苯胍、氨丙啉和盐霉素暂停使用。     

秦皇岛株柔嫩艾美耳球虫对7种常用抗球虫药的耐药性

【目的】研究秦皇岛株柔嫩艾美耳球虫对克球粉、氨丙啉、马杜霉素、瑞冠球、金三特、球敌和尼卡巴嗪7种抗球虫药的耐药性。【方法】试验设7个感染药物组、1个感染球虫卵囊不给药组(阳性组)和1个未感染球虫卵囊不给药组(阴性组),采用最适抗球虫活性百分率(POAA)、病变记分减少率(RLS)、相对卵囊产量(ROP)和抗球虫指数(ACI)综合评定秦皇岛株柔嫩艾美耳球虫对以上7种抗球虫药物的抗药性。【结果】秦皇岛株柔嫩艾美耳球虫对7种抗球虫药物均产生不同程度的抗药性,其中对马杜霉素、尼卡巴嗪和氨丙啉呈现轻度抗药,对克球粉、瑞冠球和金三特呈现中度抗药,对球敌呈现完全抗药性。【结论】目前在秦皇岛地区可合理使用马杜霉素、尼卡巴嗪和氨丙啉,对克球粉、瑞冠球和金三特应慎用,对球敌应减少或暂停使用。     

鸡柔嫩艾美耳球虫田间分离株对抗球虫药物的敏感性试验

分别从辽宁省沈阳市新立堡和新民地区肉鸡场分离到2株柔嫩艾美耳球虫(Eimena tenella).经雏鸡增殖后.选用地克珠利、马度霉素、三宝盐霉素和三宝球精对虫株进行药物敏感性试验,并以抗球虫指数、最适抗球虫活性百分率、病变记分减少率、相对卵囊产量为试验指标进行综合评定.结果表明,柔嫩艾美耳球虫新立堡株除对三宝球精中度敏感之外,对其他3种药物均不敏感.而新民株则对三宝球精中度敏感.对地克珠利轻度敏感,而对其他的2种药物均不敏感.     

河北秦皇岛柔嫩艾美耳分离株对常用抗球虫药的抗药性研究

检测了河北秦皇岛柔嫩艾美耳球虫株对球敌、力克球和氨丙啉3种常用抗球虫药的抗药性。根据抗球虫活性百分率(POAA)、病变记分减少率(RLS)、相对卵囊产量(ROP)和抗球虫指数(ACI)综合判定,结果表明,该虫株对氨丙啉无抗药性;对球敌轻度抗药;对力克球中度抗药。尽管对球敌存在轻度抗药,在增重及ACI方面优于氨丙啉。     

艾美耳球虫弱毒虫株的返祖性

将柔嫩艾美耳球虫鸡胚及药物适应株（Ｐ２５、Ｐ３０）和巨型艾美耳球虫早熟选育株（Ｐ２２、Ｐ２８），分别连续回鸡６代，测定试验鸡的肠道病变及肠道内容物的卵囊密度。结果显示，试验鸡的肠道平均病变程度（１．０以下）明显低于对照组，而肠道内容物的卵囊密度则基本相似，表明弱毒虫株无返祖现象。     

安徽3株柔嫩艾美耳球虫cox1基因部分序列的比对分析

为研究柔嫩艾美耳球虫不同地理株的线粒体细胞色素c氧化酶第1亚基(cox1)基因与球虫种群之间的遗传关系,以安徽3个地区的3株柔嫩艾美耳球虫为研究对象,通过卵囊的分离与纯化获得纯种虫株,然后应用PCR技术对柔嫩艾美球虫3个地理株的cox1序列进行扩增,并与GenBank上登录的鸡柔嫩艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、布氏艾美耳球虫和堆形艾美耳球虫虫株的相应序列进行比对分析。结果显示,每个虫株都成功扩增出800 bp左右的cox1部分有效序列(pcox1),与柔嫩艾美耳球虫pcox1序列种内无差异,pcox1相应序列种间的差异程度为9.9%～14.9%。表明柔嫩艾美耳球虫的cox1序列可作为艾美耳球虫种间遗传变异研究的标记,为进一步研究艾美耳球虫的群体遗传学特性和耐药性奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫抗马杜拉霉素、地克珠利虫株特异消减文库的构建

 以遗传背景一致的柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）敏感株孢子化卵囊为驱动组，马杜拉霉素抗药株和地克珠利抗药株孢子化卵囊为试验组，利用抑制消减杂交（SSH）方法，通过两轮杂交和两次PCR分别构建了富含两个抗药株孢子化卵囊与敏感株孢子化卵囊之间差异表达基因的消减cDNA文库。随机从两个消减文库中分别挑取50个克隆，经PCR鉴定马杜拉霉素抗药株和地克珠利抗药株孢子化卵囊的消减文库重组率分别为96%和98%，差异基因片段大小分布在250 bp～1.0 kb之间。从每个文库中随机挑取65个阳性克隆经斑点杂交试验，分别选择表达量上调的6个克隆进行序列分析和同源性比较。结果发现，有4个cDNA片段可能是新基因片段，与地克珠利抗药株的产生有关；有3个新的cDNA片段可能与马杜拉霉素抗药株的产生有关。这些结果将为克隆全长cDNA和探索球虫抗药性产生及发展的分子机理奠定了一定的基础。     

抑制钙信号转导对柔嫩艾美耳球虫入侵细胞的影响

 【目的】探讨柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）入侵细胞与钙信号转导之间的关系,揭示鸡柔嫩艾美耳球虫病的发生机制。【方法】采用体外狗肾细胞（madin-darby canine kidney cell,MDCK细胞）培养技术,检测了细胞外缺钙、Ca2+内流阻断剂（硝苯地平）和钙调蛋白抑制剂（三氟拉嗪）对E. tenella子孢子入侵率的影响,并测定了培养细胞上清液中乳酸脱氢酶（LDH）和细胞活性。【结果】E. tenella子孢子入侵细胞的抑制率随着细胞外Ca2+浓度的降低而升高。钙离子浓度降低到600 μmol•L-1时,入侵率（23.33%）均极显著低于对照组（P＜0.01）;细胞外无钙时,入侵抑制率高达53.18%;硝苯地平和三氟拉嗪均能极显著抑制子孢子的入侵（P＜0.01）,其中10 μmol•L-1的硝苯地平和50 μmol•L-1三氟拉嗪分别对子孢子的入侵抑制率达71.41%和97.13%,二者合用入侵抑制率可达98.59%。在E. tenella子孢子入侵细胞的过程中,MDCK细胞的活性均在90%以上,与对照组差异不显著（P＞0.05）,接种E. tenella子孢子的MDCK细胞培养液中LDH的活性与未接种的活性差异不显著（P＞0.05）。【结论】细胞外钙缺乏、钙通道阻断剂硝苯地平和钙调蛋白抑制剂三氟拉嗪对E.tenella子孢子入侵MDCK细胞均有抑制作用,但子孢子入侵对MDCK细胞的活性无明显影响。     

两种鸡艾美耳球虫冰箱保存后的毒力观察

鸡艾美耳球虫（柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫）卵囊分成两部分处理,一部分常规冰箱保存6个月,到期后增殖1次;另一部分每月繁殖1次,为新鲜对照虫株。之后,进行致病性试验。结果显示：冰箱保存6个月后,虫株毒力明显下降,仅增殖1次不能达到新鲜虫株毒力水平。如果两种球虫卵囊冰箱保存6个月后,用于试验研究前需至少继代繁殖2次。     

5株堆型艾美耳球虫顶质体rpoB基因的扩增及序列分析

以5株堆型艾美耳球虫为研究对象,对其顶质体rpoB基因的部分序列进行了PCR扩增、测序及序列分析,并与GenBank上发表的柔嫩艾美耳球虫及其他顶复门寄生虫相关序列进行比较,研究顶质体的遗传变异情况。结果表明,从堆型艾美耳球虫不同来源虫株均获得了469bp的目的片段,应用DNAStar软件进行序列对比发现,5株堆型艾美耳球虫的顶质体rpoB序列完全一致,与柔嫩艾美耳球虫相应序列的相似性为92.75%,而与刚地弓形虫和疟原虫的相似性分别为67.23%和64.62%。首次报道了堆型艾美耳球虫rpoB序列,显示rpoB基因序列保守,不同来源堆型艾美耳球虫虫株的序列没有差异,为进一步研究艾美耳球虫的群体遗传学奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫杨凌株对几种抗球虫药的抗药性研究

用柔嫩艾美耳球虫杨凌株(YLt)对14日龄雏鸡进行感染,检测了该虫株对几种常用抗球虫药(三九球痢灵、地克珠利、氯苯胍和地克珠利氯苯胍合剂)的敏感性.以最适抗球虫活性百分率、抗球虫指数、相对卵囊产量和病变记分减少率为指标,进行综合评定,其抗药程度分为无抗药性、轻度抗药性、中度抗药性和完全抗药性4个等级.结果表明,该虫株对地克珠利氯苯胍合剂有轻度抗药性,对三九球痢灵和地克珠利有完全抗药性,对氯苯胍无抗药性.     

RAPD技术在鸡球虫虫株鉴定上的应用

采用 RAPD 技术对 E.tenella 早熟株、鸡胚株、亲本毒抹和田间分离的抗药株进行研究,发现本研究选育的 E.tenella 早熟株与亲本毒株间 DNA 多态性存在着差异,证实该早熟侏已发生了遗传变异,但变异程度不大;而鸡胚株及抗药株却比早熟株的变异程度大。建议 RAPD 技术可用于艾美耳球虫株间差异及其球虫株间关系距离的检测.对经细胞培养的 E.acervulina 早熟株及其毒株和抗药株的基因组 DNA 进行多态性比较研究,发现该3株球虫间的变异程度大于 E.tenella 各虫株间的变异,即不同来源的 E.ac-ervulina 各虫株间的相似性小于 E.tenella 各虫株间的相似性,表明不同球虫其种内变异程度不一致。本研究结果表明 RAPD 技术可作为球虫株间变异的分子标记方法及其球虫株间关系距离的检测手段。     

表面活性素体外抗球虫作用研究

[目的]探讨表面活性素体外抗鸡柔嫩艾美耳球虫的效果。[方法]实验前将柔嫩艾美耳球虫活化,配成2.5×106/ml细胞悬液加入细胞培养板,实验组各孔分别加入不同浓度表面活性素,对照组加入等量MEM,采用定量法作柔嫩艾美耳球虫生长曲线,观察其增长速率。用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法,观察表面活性素对柔嫩艾美耳球虫成活率的影响,用乳酸脱氢酶(LDH)测定法测定表面活性素对柔嫩艾美耳球虫的损伤。[结果]在5 mg/ml表面活性素作用下其20~120 h增殖率为0,5 mg/ml表面活性素可使其破裂。[结论]表面活性素具有较强的抗柔嫩艾美耳球虫作用,有可能成为预防的理想药物。     

鸡球虫的同工酶的研究

将三对抗不同药物的 Eimeria tenella 虫株(氯嗪苯乙氰抗性株与盐霉素抗性株、氯嗪苯乙氰抗性株与氯羟吡啶抗性株、氯嗪苯乙氰抗性株与拉沙里菌素抗性株)分别等量混合感染不给药的鸡只,获得各自的杂交一代 F_1.再用 F_1感染饲喂双重药物的鸡只,通过双重药物的筛选,分别获得了各自的 E.tenella抗药性重组株 F_2~(ds),F_2~(de),F_2~(dl).这3株抗药性重组株在 F_2代中所占比例分别为:19.9%,36.5%,26.7%,重组株对相关的两种药产生了完全的抗药性.试验结果还显示,重组株的致病力与 E.tenella 敏感株无明显差异.