草鱼hepcidin基因cDNA克隆、序列分析与表达

运用RT-PCR和快速扩增cDNA末端(rapid amplication ofcDNA Ends,RACE)技术获得草鱼(Ctenopharyngodon idellus)hepcidin基因全长cDNA,为774 bp,包括ORF 282 bp、5’UTR 117 bp和3’UTR 383 bp,3’UTR存在1个多聚腺苷酸加尾信号(AATAAA)和1个mRNA不稳定基序(ATTTA)。推定编码93个氨基酸,与其它鱼类hepcidin的序列同一性为27.9%～51.6%;SignalP 4.0软件预测信号肽位于1～24位。在邻接(neighbor-joining,NJ)法构建的系统进化树中,草鱼hepcidin前体肽和其他已报导的鱼类hepcidin前体肽聚为一枝。实时定量PCR(quantitative real-time polymerasechain reaction,qPCR)检测结果显示hepcidin基因mRNA主要表达于肝脏、脾脏、头肾和眼等组织;柱状黄杆菌注射后4～48 h,hepcidin基因在肝脏、脾脏和头肾中表达均显著上调。研究亮点:克隆到草鱼抗菌肽hepcidin一个新基因的全长cDNA,阐明了其所编码的hepcidin与其它脊椎动物hepcidin具有类似的结构与功能;证明其广泛分布于各组织中,参与了对细菌的免疫应答,是固有免疫的重要组成部分。     

黄鳝抗菌肽hepcidin基因cDNA的克隆及表达分析

根据已知鱼类抗菌肽hepcidin的同源性设计简并引物,利用同源克隆结合RACE法从黄鳝(Monopterus albus)肝脏中扩增得到了黄鳝hepcidin基因全长cDNA序列(GenBank accession number FJ436808).结果表明,黄鳝hepcidin基因cDNA全长712 bp,5′端非翻译区有133 bp,3′端非翻译区有306 bp,包含1个273 bp的开放阅读框,编码1个长90氨基酸的前体肽.同源性分析表明,黄鳝hepcidin推测的氨基酸序列与其他鱼类报道的hepcidin具有较高的同源性,并具有8个半胱氨酸这一典型特征,是hepcidin家族的1个新成员.采用半定量PCR法对该基因在健康成体不同组织的转录本和脂多糖(LPS)对该基因表达的影响进行了分析.结果发现,该基因在肝脏中表达量最高,其次是肾脏,在心脏、皮肤、脑、血液、小肠、脾脏和胃中的表达量较低,而在肌肉中没有检测到该基因的转录本;LPS注射24 h后,各组织的hepcidin基因表达量都有明显升高.     

甘蓝型油菜BnClo1基因克隆、表达载体的构建及原核表达

【目的】克隆甘蓝型油菜(Brassica napus)油体钙蛋白(caleosin)基因BnClo1,并进行原核表达研究。【方法】在获得甘蓝型油菜BnClo1基因全长cDNA的基础上,根据BnClo1基因编码区设计1对特异引物,以甘蓝型油菜种子总RNA为模板,通过RT-PCR获得了约750bp的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定。随后将该蛋白成熟肽cDNA片段克隆到原核表达载体pTYB12中,构建融合表达载体pTYB12-BnClo1,转化到Escherichia coli ER2566(DE3)中进行表达。【结果】测序结果显示,RT-PCR获得的cDNA全长768bp,包含完整的开放阅读框738bp,编码245个氨基酸残基,caleosin分子量为28.1kD。原核表达产物经SDS-PAGE分析表明,以20℃、4mmol·L-1IPTG诱导该基因表达效果最好,诱导产物为一个与理论值相符的83.1kD的融合蛋白intein-caleosin。【结论】克隆了油菜BnClo1基因,并在大肠杆菌中进行了优化表达。为进一步纯化和鉴定目的蛋白,及研究其功能奠定了试验基础。     

革胡子鲶生长激素成熟肽cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达

[目的]构建革胡子鲶生长激素基因原核表达体系。[方法]采用PCR方法,扩增得到了革胡子鲶生长激素基因成熟肽的cDNA序列,将该序列克隆至原核表达载体pRSET-A,构建重组质粒pRSET-mGH,并在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行表达。[结果]革胡子鲶生长激素成熟肽cDNA序列全长534 bp,编码1个由178个氨基酸残基组成的生长激素成熟肽,分子量为20.28 kDa,等电点为5.93。SDS-PAGE和Western blot分析表明,表达的目的融合蛋白分子量为27.41 kDa,主要以非可溶性的包涵体形式存在于菌体沉淀中。目的融合蛋白的表达量高达细菌沉淀蛋白总量的36.8%。[结论]该研究为革胡子鲶生长激素的产业化开发和应用奠定了基础。     

大菱鲆抗菌肽基因酵母表达载体的构建及表达

将大菱鲆（Scophthalmus maxinus）hepcidin基因成熟肽序列经过部分改造后采用PCR方法克隆到毕赤酵母胞内表达载体pGAPZB中,构建了重组胞内表达载体pGAPZB—tbhep6his。用BlnI线性化重组质粒后,电击转化毕赤酵母SMD1168。经过Zeocin筛选和PCR扩增转化子基因组筛选,得到了数株基因工程酵母菌。通过SDS—PAGE和Western blot鉴定,发现目的蛋白与预期蛋白的分子量相吻合,并能与特异抗体antihis特异性结合,表明大菱鲆抗菌肽hepcidin基因在酵母菌中进行了表达。大菱鲆抗菌肽酵母表达载体的构建和表达为进一步研究该抗菌肽的功能并开发新型鱼类饵料奠定了理论基础。     

杜仲Fls基因的克隆及原核表达

【目的】克隆杜仲黄酮醇合成酶基因(Fls)全长,对其开放阅读框(ORF)进行原核表达分析。【方法】以杜仲叶片为材料提取总RNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆杜仲Fls基因;Fls基因的ORF经限制性内切酶酶切,构建其原核表达载体pET-28a-Fls;最后利用IPTG诱导Fls基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。【结果】获得了黄酮醇合成酶基因全长序列,长度为1 220bp,ORF为1 011bp,编码336个氨基酸;成功构建了原核表达载体pET-28a-Fls;利用IPTG诱导Fls在BL21(DE3)中表达,SDS-PAGE电泳结果显示,在约44ku处有特异性的蛋白条带出现。【结论】获得了杜仲Fls基因的全长和ORF,并成功对其进行了原核表达。     

斑点叉尾鮰hepcidin抗菌肽在大肠杆菌中的融合表达

通过RT-PCR从斑点叉尾鮰肝脏中克隆编码hepcidin原前体肽的基因"pIH"。与参考序列相比,显示两个氨基酸残基的变异。通过对编码hepcidin原前体肽的基因添加EcoR I和HindⅢ酶切位点,选择含"trxA"融合头的pET32a(+)作为表达质粒、E.coliBL21(DE3)作为工程菌,成功构建"pET32a-pIH"原核表达系统。阳性克隆经1 mmol.L-1IPTG诱导、在37℃培养12 h后,表达的"trxA-pIH"融合蛋白70%以上可溶。Tricine-SDS-PAGE分析表明,细胞经超声破碎后的上清通过固化金属离子亲和层析(IMAC)纯化后,可获得高纯度的目的蛋白。     

金线莲呋甾皂苷26-O-β-葡萄糖苷酶基因克隆与表达分析

【目的】克隆金线莲(Anoectochilus roxburhii)ArF26G基因的cDNA全长,分析该基因在金线莲茎、叶中的表达模式,以期为进一步了解金线莲甾体皂苷的生物合成代谢调控机制提供参考。【方法】利用RACE技术克隆金线莲ArF26G基因cDNA全长,以pET-28a(+)为载体构建原核表达载体并诱导表达,采用荧光定量PCR方法分析不同温度(5、15、25、35℃)和种植时间(1–6个月)ArF26G基因在茎和叶中的表达水平。【结果】ArF26G基因的cDNA全长1 982 bp,含有1个1 764 bp的ORF,编码587个氨基酸,编码蛋白具有Glycosyl hydrolase1(GH1)superfamily蛋白保守区,定位于叶绿体,N端33个氨基酸残基为叶绿体转运肽,分子量为66.48 kD,理论等电点(pI)为5.31,不稳定系数为37.92,属稳定蛋白。构建了pET-28a-ArF26G原核表达载体,并在大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中成功诱导表达。荧光定量PCR分析结果显示,ArF26G基因在茎中的表达量极显著高于叶,25℃处理表达量最高。金线莲种植时间达4个月时,ArF26G基因在茎中的表达量是25℃处理组培苗茎的11.9倍,种植5个月达到23.3倍。【结论】本研究克隆了金线莲ArF26G基因cDNA全长,其表达量在25℃以及种植5个月时表达量最高。     

玉米磷酸丙糖异构酶基因的克隆及原核表达

为克隆玉米(Zea mays L.)磷酸丙糖异构酶基因ZmTPI,并进行序列分析和原核表达研究,根据玉米TPI基因的cDNA全长序列设计特异引物,以玉米叶片总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增得到了约750bp的基因编码区cDNA片段,T/A克隆后进行了序列测定及序列分析,随后将克隆到的该基因片段构建到原核表达载体PGEX-4T-1上,得到的重组表达质粒GST-ZmTPI转化Bl21进行融合蛋白的诱导表达及纯化。结果显示,玉米ZmTPI(GenBank:EU959275)cDNA全长1 216bp,753bp开放阅读框编码250个氨基酸,推测分子量26.7205kDa,理论等电点为5.12;该蛋白具有高度保守的TIM结构域,与其它高等植物的同源蛋白有很高的相似性;进化树分析表明,玉米TPI与甘蔗亲缘关系最近,处于同一进化支;SDS-PAGE检测结果显示,成功诱导表达并且纯化了与预期大小一致的融合蛋白。玉米ZmTPI蛋白的基因克隆和原核表达及纯化的成功,为进一步研究目的蛋白的酶活性质及生物学功能奠定了基础。     

甘蔗B家族蔗糖磷酸合成酶基因SofSPSB的克隆及原核表达

[目的]克隆甘蔗B家族SofSPSB基因并进行原核表达,为进一步研究甘蔗SPS酶学特性及SPS活性调控机制奠定基础.[方法]在进化分析的基础上,通过同源克隆获得甘蔗SofSPSB基因部分序列,再结合RACE技术获得全长cDNA序列.扩增SofSPSB基因ORF并连到原核表达载体pETBlue-2上,导入大肠杆菌BL21(DE3)中表达.[结果]通过比对B家族中进化关系很近的玉米(Zea mays)ZmSPS1和水稻(Oryza sativa) OsSPS1基因序列,并在保守区设计一对引物扩增获得甘蔗B家族SPS基因(SofSPSB) 2330 bp序列.结合5'-RACE和3'-RACE技术获得3481 bp SofSPSB基因全长cDNA序列,该序列包含一个3225 bp的开放阅读框(ORF);起始密码子(ATG)位于转录起始位点后56 bp处,终止密码子(TGA)后有一段201 bp的非编码序列,并带有真核生物典型的polyA尾巴;编码1074个氨基酸,SofSPSB与Zm-SPS1、OsSPS1的核苷酸序列同源性分别为94.7%和81.3%,氨基酸序列同源性分别为96.0%和83.9%;其理论分子量Mw=118.96 kDa,等电点pI=6.30.经原核表达后纯化获得带6×His标签的融合蛋白.[结论]克隆获得甘蔗B家族Sof-SPSB基因全长cDNA序列,成功构建了SofSPSB基因原核表达载体,使其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达.     

猪hepcidin基因质粒载体的构建及其在毕赤酵母中的表达

为构建猪hepcidin毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌型表达载体,实现其真核表达,本文采用RT-PCR方法获得猪肝脏中的铁代谢调节基因hepcidin,通过连接酶使其与真核表达载体pGAPZaA相连构建重组表达质粒pGAPZaA-hepcidin。利用高压电击处理,使质粒载体转入到毕赤酵母中,用含Zeocin抗生素的YPD平板筛选阳性转化子,并做PCR鉴定。结果表明:hepcidin基因准确地插入表达载体pGAPZaA,并已整合到酵母基因组中,并成功构建了酵母重组表达质粒。     

马属抗菌肽hepcidin在酵母系统中的表达与鉴定

根据GenBank上马属抗菌肽hepcidin的氨基酸序列,设计并合成全长279 bp的hepcidin基因,将该基因插入pPICZαA中构建真核表达载体,PCR鉴定的阳性质粒电转化毕赤酵母菌X-33,用不同浓度Zeocin筛选高拷贝阳性重组菌,甲醇诱导表达,表达上清液经超滤膜纯化后,利用SDS-PAGE电泳和抑菌试验...     

尼罗罗非鱼Hepcidin抗菌肽在大肠杆菌中的融合表达及其抗菌活性

Hepcidin是一类分子量较小、富含半胱氨酸的阳离子抗菌肽,TH1-5则是从莫桑比克罗非鱼(Oreochromis mossambicus)中分离到的3种hepcidin cDNA序列中的1种;虽然化学合成的TH1-5的成熟肽显示了对若干细菌的抑菌活性,但通过重组DNA表达的此肽是否也具生物学活性则是未知的。本文参考莫桑比克罗非鱼hepcidin TH1-5的核苷酸序列,以尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)的肝脏为基因克隆的材料,对其类似于hepcidin TH1-5的成熟肽(mTH)进行了重组DNA表达。在构建的重组表达质粒"pET-32a-mTH"中,mTH基因与携带有6×His-tag标签和肠激酶识别位点的trxA基因融合,25℃下,经1mmol/L IPTG诱导培养8h后,在E.coli BL21(DE3)中成功表达了"trxA-mTH"融合蛋白。经固化金属离子亲和层析(IMAC)纯化后的融合蛋白并不显示抑菌活性,但经肠激酶消化处理后,释放出的重组mTH显示了对革兰氏阳性的单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌以及革兰氏阴性的大肠杆菌和铜绿假单胞菌的抑菌活性。     

Hepcidin regulates cellular iron efflux by binding to ferroportin and inducing its internalization

Hepcidin is a peptide hormone secreted by the liver in response to iron loading and inflammation. Decreased hepcidin leads to tissue iron overload, whereas hepcidin overproduction leads to hypoferremia and the anemia of inflammation. Ferroportin is an iron exporter present on the surface of absorptive enterocytes, macrophages, hepatocytes, and placental cells. Here we report that hepcidin bound to ferroportin in tissue culture cells. After binding, ferroportin was internalized and degraded, leading to decreased export of cellular iron. The posttranslational regulation of ferroportin by hepcidin may thus complete a homeostatic loop: Iron regulates the secretion of hepcidin, which in turn controls the concentration of ferroportin on the cell surface.     

广西巴马小型猪GHRH成熟肽真核表达质粒对小鼠生长效应的影响

【目的】探讨广西巴马小型猪促生长激素释放激素（GHRH）成熟肽真核表达质粒对小鼠生长效应的影响,为进一步研究广西巴马小型猪GHRH成熟肽的促生长作用及GHRH基因疫苗的高效制备与安全使用提供参考依据。【方法】利用基因重组技术将广西巴马小型猪GHRH成熟肽序列与p EGFP-N1质粒连接构建重组真核表达质粒,然后按0.5μg/g的剂量肌肉注射经25%蔗糖溶液预处理的小鼠,观察记录小鼠体重变化情况,并分别提取重组质粒注射组小鼠的心脏、肝脏、肾脏及注射部位肌肉DNA,再以PCR检测是否存在基因质粒残留。【结果】以构建的p EGFP-GHRH重组质粒注射小鼠后,其外源GHRH成熟肽DNA可在肌肉中获得表达,但并未整合入小鼠基因组中。虽然重组质粒注射组小鼠的末重与空质粒注射组小鼠的差异不显著（P〉0.05）,但在注射后的10-25 d,重组质粒注射组小鼠体重均显著高于空质粒注射组（P〈0.05）。在相对日增重率方面,注射后的前15 d内,重组质粒注射组小鼠的相对日增重率均高于空质粒注射组。【结论】构建的广西巴马小型猪p EGFP-GHRH重组质粒能在一定时间内促进小鼠生长,即GHRH种属差异性小,在动物中有较高的保守性。     

黄鳝抗菌肽hepcidin基因大肠杆菌表达载体的构建

[目的]构建黄鳝抗菌肽hepcidin基因大肠杆菌表达载体。[方法]根据Genbank中黄鳝hepcidin基因序列设计引物进行PCR扩增,将测序正确的基因片段连接入载体pET-28a中。[结果]以黄鳝cDNA为模板,扩增出hepcidin基因片段,长度为291 bp,连接到pET-28a上。经PCR扩增、双酶切验证,证实成功构建原核表达载体。[结论]成功构建了黄鳝hepcidin基因大肠杆菌表达载体。