甘蓝型油菜透明种皮12（TT12）基因家族反义抑制植物表达载体的构建

【研究目的】构建一个同时反义共抑制甘蓝型油菜(Brassica napus)透明种皮12基因家族(BnTT12)转录的植物表达载体。【方法】通过PCR扩增得到BnTT12家族一段503bp的特异保守片段TT12A,通过亚克隆整合到中间载体pCambia2301G,构建TT12反义植物表达载体pCambi-a2301G-TT12A。采用液氮冻融法将其转化到根癌农杆菌。【结果】经过PCR鉴定、酶切鉴定和DNA测序证实载体构建成功,并转化到根癌农杆菌LBA4404菌株中形成TT12反义表达载体的工程菌株。【结论】pCambia2301G-TT12A的成功构建为利用此反义载体通过遗传转化获得转基因新型黄籽油菜和进一步探明TT12基因在甘蓝型油菜种皮色素合成途径中的分子生物学机理奠定了基础。     

普通烟草IRL基因反义植物表达载体的构建

异黄酮还原酶相似蛋白(IRL)是与异黄酮还原酶具有高度序列同源一致性而功能不同的一类蛋白.通过PCR扩增普通烟草(Nicotiama tabacum)品种龙里红花烟IRL基因的一段特异保守片段NtIRLA,并将其亚克隆到中间载体pCAMBIA2301G中,构建了IRL反义植物表达载体pCAMBIA2301G-IRLA.通过PCR鉴定、酶切鉴定证实载体构建成功,并转化到根癌农杆菌LBA4404菌株中形成工程菌株,为进一步利用转基因手段明确IRL基因在烟草次生代谢中的功能奠定了基础.     

芸薹属DFR基因家族RNA干扰载体的构建

二氢黄酮醇-4-还原酶(dihydroflavonol-4-reductase,DFR)是类黄酮途径的一个关键酶,对种皮色泽和花色的形成具有重要作用。本研究从甘蓝型油菜克隆了600 bp(不计人工酶切位点)的芸薹属DFR基因家族的RNA干扰片段BDFRI,将其反义片段和正义片段分别插入到本课题组新近改造的植物RNAi平台载体pFGC5941M的启动子与间隔区之间、间隔区与终止子之间,构建了11 400 bp的RNAi干扰载体pFGC5941M-BDFRI,通过多重PCR鉴定证实载体构建成功,并转化到根癌农杆菌菌株LBA4404中形成了工程菌株。此载体的构建为进一步研究DFR基因参与决定芸薹属种皮色素和茎叶彩色性状的分子机理和代谢调控奠定了基础。     

橡胶树乳管表达HbHMGR1基因双元表达载体构建与鉴定

[目的]克隆橡胶树乳管特异性强启动子HEV2.1(PHEV2.1),构建天然橡胶生物合成途径关键限速酶基因(HbHMGR1)的乳管特异性植物表达载体,为橡胶树遗传转化奠定基础.[方法]根据已报道的HEV2.1序列(GenBank登录号AY247789.1)设计1对特异引物,采用PCR从橡胶树热研7-33-97基因组DNA中克隆PHEV2.1,与HbHMGR1基因融合构建橡胶树乳管特异性植物表达载体,并以PCR和限制性内切酶酶切进行鉴定.[结果]用特异引物可从热研7-33-97基因组DNA中扩增获得1852bp的PHEV2.1片段,其与AY247789.1启动子序列的同源性为98.6%.将PHEV2.1与HbHMGR1基因融合构建乳管特异性植物表达载体pCAMBIA230 1-PHEV2.1-HbHMGR1,经PCR和限制性内切酶酶切鉴定证明植物表达载体构建成功.[结论]将PHEV2.1和HbHMGR1基因先构建到pCAMBIA3301载体上再克隆至pCAMBIA2301载体上,能有效解决直接克隆至pCAMBIA2301载体上出现PstⅠ突变、阻碍载体构建的难题,成功构建获得乳管特异性植物表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR.     

甘蓝型油菜丙酮酸激酶基因RNA干扰载体的构建(英文)

采用基因芯片技术,从油菜中鉴定了一个油分积累优势表达基因即丙酮酸激酶(Pyruvate kinase,PK)基因。为构建甘蓝型油菜PK基因的RNA干扰(RNAi)载体,通过设计引物克隆了PK基因长498 bp的siRNA靶序列,连接到pEASY-T1载体上,采用NotI和XhoI酶切,酶切产物连接到本课题组新近改造的RNAi平台载体pHurricane的NotI和XhoI位点,通过多重PCR鉴定证实载体构建成功,然后将上述PK基因反向重复框克隆到加入napin启动子的pCAMBIA1390表达载体相应的酶切位点上,构建具有种子特异性表达的PK基因的RNAi载体。限制性内切酶酶切证实载体构建成功,为进一步研究PK基因参与决定油菜油分积累的分子机理和代谢调控奠定了基础。     

甘蓝型油菜丙酮酸激酶基因RNA干扰载体的构建

采用基因芯片技术,从油菜中鉴定了一个油分积累优势表达基因即丙酮酸激酶(Pyruvate kinase,PK)基因。为构建甘蓝型油菜PK基因的RNA干扰(RNAi)载体,通过设计引物克隆了PK基因长498 bp的siRNA靶序列,连接到pEASY-T1载体上,采用Not I和Xho I酶切,酶切产物连接到RNAi平台载体pHurricane的Not I和Xho I位点,通过多重PCR鉴定证实载体构建成功,然后将上述PK基因反向重复框克隆到加入napin启动子的pCAMBIA1390表达载体相应的酶切位点上,构建具有种子特异性表达的PK基因的RNAi载体。限制性内切酶酶切证实载体构建成功,为进一步研究PK基因参与决定油菜油分积累的分子机理和代谢调控奠定了基础。     

甘蓝型油菜丙酮酸激酶基因RNA干扰载体的构建

采用基因芯片技术,从油菜中鉴定了一个油分积累优势表达基因即丙酮酸激酶（Pyruvate kinase, PK）基因。为构建甘蓝型油菜PK基因的RNA干扰（RNAi）载体,通过设计引物克隆了 PK基因长498 bp的 siRNA靶序列,连接到 pEASY-T1载体上,采用 NotI和XhoI酶切,酶切产物连接到本课题组新近改造的 RNAi 平台载体 pHurricane 的 NotI 和XhoI位点,通过多重 PCR 鉴定证实载体构建成功,然后将上述 PK基因反向重复框克隆到加入 napin启动子的 pCAMBIA1390表达载体相应的酶切位点上,构建具有种子特异性表达的PK基因的RNAi载体。限制性内切酶酶切证实载体构建成功,为进一步研究 PK基因参与决定油菜油分积累的分子机理和代谢调控奠定了基础。     

非洲菊f3h基因的克隆及反义表达载体的构建

黄烷酮3-羟化酶(F3H)是植物花青素合成代谢中早期重要关键酶之一,对花色起着重要的调控作用.根据其它物种的f3h基因设计简并引物,通过RT-PCR技术,从非洲菊中克隆到500 bp的片段,经Blast N比时,证实该片段为非洲菊f3h基因保守片段.将其反向插入到高效表达载体pCAMBIA1304+CaMV 35S启动子下游,通过PCR鉴定和双酶切鉴定表明成功构建高效反义表达栽体pCAMBIA1304+-antif3h,并转化到根癌农杆菌LBA4404形成工程菌株,作为今后研究非洲菊花色调控机制以及培育新品种的有力工具.     

芸薹属查尔酮合酶基因家族RNA干扰载体的构建

采用PCR法克隆芸薹属CHS基因家族的RNAi片段,经T-载体克隆并测序后,用特定的双酶切方案将其反义片段、正义片段分别亚克隆到平台载体pFGC5941M的启动子与间隔区、间隔区与终止子之间,形成RNAi载体,转化大肠杆菌,完成复合PCR鉴定,然后转化根癌农杆菌。结果表明:经测序,以甘蓝型油菜BnCHS1基因为模板克隆的芸薹属CHS基因家族的RNAi片段BCHSI为831 bp,采用Nco+Aat和BamH+Xba分别将其反义和正义片段亚克隆到pFGC5941M中;经复合PCR鉴定,11 814 bp的RNAi载体pFGC 5941M-BCHSI(简称pBCHSI)构建成功,并获得了根癌农杆菌LBA4404的工程菌株。芸薹属CHS基因家族RNAi载体的成功构建,将促进甘蓝型油菜、白菜、甘蓝等芸薹属物种类黄酮性状的研究与修饰。     

黄瓜(Cucumis sativus L.)果瘤基因Tu表达载体构建及遗传转化

为了进一步优化黄瓜遗传转化体系,提高遗传转化效率,构建含有自身启动子的黄瓜果瘤基因(Tu)表达载体pCAMBIA2301-Tu,将表达载体通过电击法导入农杆菌菌株GV3101中,进行农杆菌介导的黄瓜遗传转化的研究。使用限制性内切酶KpnI和BamHI对质粒pCAMBIA2301和Tu基因PCR产物进行双酶切,回收目的片段,连接后成功构建Tu基因表达载体。通过优化遗传转化的生根条件以及抑制农杆菌生长条件,一定程度上提高了遗传转化的效率。580个外植体通过抗生素筛选获得的18株再生苗进行PCR检测和测序鉴定,最终获得8株阳性转化苗,转化效率为1.37%。     

紫茎泽兰类黄酮3′-羟化酶在烟草中的表达

 【目的】研究紫茎泽兰F3′H在次生代谢途径中的功能。【方法】构建了F3′H过表达载体,并将其转入烟草体内,进一步通过半定量RT-PCR和Real-time PCR检测F3′H的表达情况。【结果】F3′H在烟草体内能正常表达,但在开花后则受到抑制,表现为转F3′H烟草花色较野生型变淡,F3′H表达量低于野生型表达量。【结论】F3′H与次生代谢途径中花色素的形成密切相关,且转入烟草体内时,其表达与烟草内源基因表达相互影响,导致烟草的花色变淡。     

橡胶树HbHMGR1基因克隆及其愈伤组织转化

[目的]克隆橡胶树HbHMGR1基因,转化橡胶树易碎愈伤组织,为橡胶树遗传转化和品种改良打下基础.[方法]根据已经报道的HbHMGR1基因序列（NCBI登录号X54659.1）设计特异引物,通过RT-PCR克隆HbHMGR1基因,构建pCAMBIA2301-35 S-HbHMGR1植物表达载体.再用EHA105（携带pCAMBIA2301-35 S-HbHMGR1,内含NPTⅡ和uidA基因）侵染橡胶树易碎愈伤组织,数月筛选后对抗性易碎愈伤组织系进行GUS染色和分子检测.[结果]成功克隆了HbHMGR1基因,双酶切重组质粒、重组质粒的PCR扩增结果证明成功地构建了该基因的植物表达载体pCAMBI-A2301-35S-HbHMGR1.侵染后抗性橡胶树易碎胚性愈伤组织GUS检测为蓝色,且分子检测呈现阳性,共获得15个抗性易碎愈伤组织系.[结论]橡胶树HbHMGR1基因在愈伤组织阶段开始表达,有效提高了HbHMGR1基因在橡胶中的表达量.     

核糖体失活蛋白(RIP)基因克隆及其表达载体的构建

以按玉米RIP基因(M83927)序列设计合成的特异性引物,用提取的玉米基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增目的片段,测定并克隆玉米的RIP基因。序列分析表明,它们的核苷酸和氨基酸序列与GenBank中登录的CRIP(M83927)的同源性分别为99.90%和100%。RIP与植物表达载体pCAMBIA2301相连构建成为带有35S启动子和polyA终止子的植物表达载体p2301-RIP。     

柑橘衰退病毒基因RNAi载体的构建

基于转化病毒基因介导抗性,通过在植物表达载体p CAMBIA 2301上插入启动子–内含子–终止子的方式,构建一种含有发夹结构的、通用型强的RNAi载体骨架结构;以柑橘衰退病毒(citrus tristeza virus,CTV)的p25、p20和p23基因保守序列为模板设计正向片段和反向片段,先后与骨架载体连接,成功构建了3个RNAi载体(分别命名为ds2301–p25、ds2301–p20和ds2301–p23),并将载体ds2301–p23注射入墨西哥莱蒙叶片。制作p23基因的地高辛标记探针,用Northern杂交检测是否有si RNA产生。结果表明:用Northern杂交可以检测到p23特异的si RNA,在墨西哥莱蒙叶片中瞬时表达的农杆菌ds2301–p23可以发生RNAi,表达有效的si RNA。本研究中构建的骨架载体可以广泛用于RNAi载体的构建,含有柑橘衰退病毒基因片段的3个载体可以用于基因功能分析及具有CTV抗性的柑橘种质资源获得。     

双元植物表达载体pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO的构建及转化

【目的】构建双元植物表达载体,通过遗传转化提高植物的抗逆能力。【方法】将从超旱生、耐盐植物梭梭(Haloxylon ammodendron)中克隆得到的HaBADH基因,定向导入植物表达载体pCAMBIA2300-35S-OCS中,以HaCMO替换pCAMBIA2300-HaBADH中的抗性基因NPT Ⅱ,构建双元植物表达载体pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO,并通过农杆菌介导法将其转入粳稻品种“优引三号”,对所获得的转基因植株进行PCR检验。【结果】成功构建了双元植物表达载体pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO,并获得了携带有pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO的水稻阳性植株5株,经PCR检测,转入成功。【结论】将梭梭抗逆基因HaBADH和HaCMO构建到一个表达载体中,并成功转化水稻,为转入基因后水稻植株内甜菜碱合成和积累过程的深入分析提供了条件。     

过量表达紫茎泽兰类黄酮-3’羟化酶基因对转基因烟草POD、PAL活性的影响

紫茎泽兰具有强烈的化感作用,可抑制周围其他植物生长。类黄酮3’-羟化酶（F3’H）属于细胞色素P450（CYP）单加氧酶,具有催化多种依赖NADPH或NADH的底物氧化反应的功能,在植物化感作用中行使一定的功能。利用转F3’H基因的烟草为实验材料,分别测定转F3’H基因植株、转pBI121空载体植株和野生型植株的过氧化物酶（POD）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性,结果表明,转F3’H基因植株的POD活性分别是野生型植株和转空载体植株的3.8倍和2.0倍,而PAL活性则相应为4.0倍和2.0倍。由此推断F3’H基因在抵御伤害方面具有重要作用。     

无选择标记的甜瓜a-ACO1基因植物表达载体的构建及对烟草的共转化效果

从植物表达载体pCB-aACO1的T-DNA区段上切去nptⅡ基因,构建了无选择标记植物表达载体pCD-aACO1,其T-DNA区段只含有目的基因a-ACO1和GUS基因.从另一植物表达载体pCAMBIA2301的T-DNA区段切去GUS基因,构建了植物表达载体pCAMBIA2302,其T-DNA区段其只含有nptⅡ基因.用这2种新载体共转化烟草,在对40株抗性转基因烟草的PCR检测中,有14株扩增出a-ACO1基因,共转化率为35%.     

拟南芥GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因转化生菜的研究

维生素C是植物体内重要的抗氧化物质,同时也是人体所必需的营养物质。为了提高生菜中维生素C的含量,根据GenBank中拟南芥GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因（GMP）序列设计特异引物,从拟南芥cDNA中扩增出了GMP基因编码区片段,分别连上CaMV 35S启动子、MYC序列和NOS终止子后将含GMP基因的表达盒插入到植物表达载体pCAMBIA2301中,获得含有GMP基因的植物表达载体p2301-GMP-myc。通过农杆菌介导法转化生菜,获得了64株转基因植株,PCR检测以及荧光定量PCR分析证实外源基因已被成功导入生菜基因组中并表达。采用HPLC-ELSD测定转基因生菜中维生素C的含量。结果表明,大多数转基因生菜中维生素C的含量高于对照植株。转基因生菜中维生素C含量最高的约为对照的2.5倍。该研究证明过量表达GMP基因是提高生菜中维生素C含量的有效方法。