播娘蒿油酸脱氢酶基因(DsFAD6)的克隆和表达分析

采用RACE-PCR的技术克隆了播娘蒿的油酸脱氢酶基因(DsFAD6),它是催化油酸转化为亚油酸的一个关键酶基因.DsFAD6 cDNA全长序列的开放阅读框长1 344 bp,编码一个由447个氨基酸残基组成的蛋白质,推测的蛋白质相对分子质量为51.16 kD,等电点为9.27.序列分析表明DsFAD6的氨基酸序列具有3个高度保守的组氨酸盒子,该结构在去饱和酶中是高度保守的,且在N端预测到信号肽,初步认定该酶定位于质体.序列比对和系统发生分析显示DsFAD6与十字花科植物FAD6基因具有较高一致性.RT-PCR分析表明,DsFAD6在根、茎、叶、花蕾、花及幼嫩角果中均表达,但在茎、叶和幼嫩角果中表达较高.胁迫诱导表达中,DsFAD6在播娘蒿叶片中表达明显受伤害胁迫诱导,但在冷胁迫下呈负相关.     

向日葵甜菜碱醛脱氢酶的电子克隆与分析

采用电子克隆技术获得了向日葵甜菜碱醛脱氢酶基因的cDNA序列(HaBADH)。该序列长1901bp,编码一个由503个氨基酸残基组成的蛋白质。HaBADH与其他物种的BADHs在蛋白质水平上表现较高的相似性,在进化上与同科的甘菊BADH蛋白距离较近。HaBADH蛋白具有醛脱氢酶家族高度保守的十肽和与酶功能有关的氨基酸残基Cys。     

甘蓝型油菜甜菜碱醛脱氢酶基因(BnBADH-1)的克隆与真核表达载体的构建

根据已知的拟南芥甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH1)序列设计特异性引物,利用RT-PCR技术从甘蓝型油菜中克隆出油菜甜菜碱醛脱氢酶基因(BnBADH-1)全长。测序和分析结果表明,BnBADH-1的cDNA全长1506bp,编码一个包含501个氨基酸残基、分子量为55kD、等电点(pI)为5.16的假定蛋白质;核酸序列和氨基酸序列与拟南芥的同源性分别为90.24%和93.41%。利用片段两端的粘性末端酶切位点BamHⅠ和SacⅠ将cDNA片段连接在真核表达载体pBI121上;PCR鉴定表明,过量表达载体pBI121-BnBADH-1已成功构建,为下一步的基因功能分析做好了准备。     

播娘蒿蛋白酶抑制剂基因DsTI2转化油菜的研究

通过播娘蒿角果的cDNA文库克隆测序,得到1个蛋白酶抑制剂基因序列,命名为DsTI2.该基因编码一个含有100个氨基酸残基肽链,含有保守活性位点环"CAPRIFPSFC".利用农杆菌介导,将DsTI2导入甘蓝型油菜品系NJ5424中.PCR和RT-PCR检测证明外源基因已导入到油菜基因组中,且能正常表达.酶活性分析表明,转基因油菜叶片蛋白酶抑制剂对胰蛋白酶和糜蛋白酶的抑制活性明显高于对照.初步抗虫实验表明,喂食转基因油菜叶片的菜青虫幼虫生长缓慢、死亡率升高.     

朝鲜碱茅甜菜碱醛脱氢酶cDNA 5′末端序列的克隆及植物表达载体的构建

采用改良的RT-PCR及5′RACE法,成功地克隆了朝鲜碱茅甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因cDNA 5′端序列,与已知序列拼接,获得了BADHcDNA全长1781bp,包含一个完整的开放阅读框(ORF),编码506个氨基酸。其含有醛脱氢酶高度保守序列VT/SLELGGKSP,及其后29位与酶功能有关的Cys。多序列比对和系统进化分析表明,朝鲜碱茅BADH与大麦BBD1同源性最高,并构建了PBI121-BADH植物表达载体。     

干旱胁迫下不同抗旱性小麦BADH表达及甜菜碱含量的变化

根据已发表的几种植物的甜菜碱醛脱氢酶（BADH）基因的AA同源保守区设计了1对简并引物,通过RT-PCR方法从小麦叶片中扩增出BADH cDNA的中间序列,共723 bp,编码240个氨基酸。Northern杂交表明,扬花期遭受轻度水分胁迫时,抗旱性较强（旱丰9703）与抗旱性较弱（山农215953）的2小麦品种叶片中BADH基因的表达没有明显差异;灌     

烟草3个甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆及序列分析

为从烟草中克隆到与植物抗逆相关的甜菜碱醛脱氢酶(EADH)基因,以枸杞BADH基因为探针,通过电子克隆的方法从烟草栽培品种K326中克隆到3个BADH基因(NtBADH1、NtBADH2、NtBADH3),并对其进行了序列分析。结果表明:3个BADH基因的cDNA序列均包含完整的开放读码框,分别编码504个氨基酸,具有醛脱氢酶家族高度保守的十肽(VTLELGGKSP)以及与酶功能有关的半胱氨酸残基(C)。烟草3个BADH与其他物种在蛋白质水平上表现较高的相似性,NtBADH1和NtBADH2在进化上与同科的番茄BADH蛋白距离较近,NtBADH3在进化上与同科的枸杞BADH蛋白距离较近。这些结果为进一步分析该类蛋白的性质和功能,并为植物抗逆基因工程研究提供了基础资料。     

菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因同源片段的克隆与序列分析

在盐和干旱等渗透胁迫条件下,一些植物会积累甘氨酸甜菜碱(简称甜菜碱)作为渗透调节物质,甜菜碱在植物体内由胆碱经两步氧化形成,催化这两步反应的酶分别是胆碱单氧化物酶(cholinemonooxyge-nase,CMO)和甜菜碱醛脱氢酶(betainealdehydedehydrogenase,BADH)。由于甜菜碱的合成途径简单,进行遗传操作方便,在诸多抗逆性基因中甜菜碱合成酶基因被看作是最有希望的胁迫抗性基因。其中,BADH基因的全长cDNA序列首先被从藜科植物菠菜(Spinaciaoleracea)中克隆到,此后人们相继以该基因为参照,研究其它植物中的BADH基因。本文作者在以菠菜BADH基因为对照研究菊科植物的BADH基因时,根据已发表BADH基因的保守区序列设计了一对PCR兼并引物,以菠菜基因组DNA为模板,采用PCR法扩增出长分别为825bp(seq1)和822bp(seq2)的两个DNA片段,经测序和序列分析,seq1与GenBank中登录的菠菜BADH基因的基因组序列(U69142)一致,其外显子区与已发表的该基因的cDNA序列(M31480)一致,seq2与U69142序列的同源性为68%,其外显子区与M31480序列的同源性为83.93%。而且,在由该核苷酸序列推导的氨基酸序列中,含有醛脱氢酶高度保守的十肽VTLELGGKSP,说明该基因为菠菜BADH基因的同源基因。根据现有文献分析,菠菜中可能存在两个BADH的同工酶,作者所克隆基因片段所属的基因可能编码菠菜BADH的另一个同工酶。该序列已在GenBank中登录,登录号:DQ070842。     

一个陆地棉类烯醇酶基因的克隆及其表达分析

 采用改良的CTAB法提取陆地棉总RNA,运用RT-PCR技术首次克隆了陆地棉类烯醇酶基因的CDS序列,该基因已经在GenBank上登录,登录号为 EU169604,其开放阅读框为1338 bp,编码445个氨基酸残基。对其序列和进化分析表明,陆地棉烯醇酶基因与其它植物中的烯醇酶基因有较高的相似性,该基因在进化过程中是相当保守的。半定量RT-PCR表达分析结果显示该基因在陆地棉的叶、根、茎中均有表达,但在根中的表达量高于叶和茎。     

西藏青稞LEA3蛋白新抗旱基因的克隆与序列分析

以强抗旱青稞冬青8号和弱抗旱青稞品比14为材料,将幼苗经干旱诱导处理12 h提取总RNA,RT-PCR同源克隆到2个有差异的LEA3蛋白抗旱基因的全编码框序列。冬青8号、品比14的LEA3蛋白基因序列全长分别为661 bp和694 bp,其中,来源于品比14的LEA3蛋白基因编码框全长639 bp,编码含213个氨基酸残基的蛋白质,该多肽含有9个重复的、由11个氨基酸残基组成的保守基元序列。而来源冬青8号的LEA3蛋白基因与之相比较除缺少33 bp核苷酸外,另有6个碱基的差异,所编码的蛋白质也相应地缺少第4个保守基元序列,由8个重复的保守基元序列组成。二者在DNA与氨基酸序列上的同源性分别为94.38%和92.02%。结果证实抗旱性不同的青稞品种之间LEA3抗旱蛋白保守基元拷贝数有差异,推测抗旱蛋白结构的差异可能对植物的抗旱性有影响。     

青稞HvBADH1基因的克隆及其转化烟草的初步研究

应用RT-PCR结合RACE技术, 从青稞总RNA中扩增得长度为1 512 bp的甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因cDNA全长编码序列。通过氨基酸同源性比对, 发现该序列的推定表达产物与大麦BADH同工酶BBD2的同源性为98.4%, 而与小麦、玉米和水稻等禾本科作物的BADH同源性分别为97.0%、84.7%和85.1%。将克隆到的青稞cDNA序列命名为HvBADH1, 投递到GenBank, 获得收录号EF492983。HvBADH1可以在原核表达系统TB1-pMAL c2x中正常表达出分子量为54.2 kD的多肽链。将HvBADH1的编码ORF, 插入到添加了植物表达CaMV 35S启动子和Nos polyA终止子调控元件的植物表达载体pCAMBIA1301质粒相应的克隆位点中, 构建了HvBADH1基因的农杆菌植物转化系统LBA4404(pCAM-ba)。进而采用农杆菌介导法, 将HvBADH1基因导入烟草中, 对所获得的潮霉素抗性烟草株系进行PCR、Southern blot和RT-PCR等分子生物学检测, 结果表明, 在得到的2个转基因株系中, HvBADH1基因已整合到受体植物基因组中, 并且可以在mRNA水平上进行转录。     

绒毛白蜡NADH还原酶第二亚基基因(ndhB)的克隆及同源性分析

采用RT-PCR 技术克隆了绒毛白蜡NADH还原酶第二亚基cDNA 序列(FvndhB)。 FvndhB cDNA序列长893bp,由288个氨基酸残基组成,推测该序列编码的蛋白质相对分子质量为32.3kD,pI 为10.17。序列比对结果表明FvndhB与参考的8个物种的ndhBs在核酸水平上表现出较高的同源性,表明ndhB基因家族具有较高的保守性。其中与桑树的同源性最高,其次是银白杨,最后是日本柳杉。利用DNAMAN软件构建的系统进化树表明绒毛白蜡与其他植物亲缘关系较远。本研究首次从绒毛白蜡中克隆了ndhB基因,并对其进行了同源性分析,为进一步克隆绒毛白蜡ndhB全长基因及分析其表达特性奠定了基础。     

Aspergillus niger 乳糖酶基因的克隆及序列分析

利用PCR及RT-PCR技术从黑曲霉(Aspergillus niger)菌株DL116中克隆到了乳糖酶基因组DNA，cDNA序列(GENBANK ACCESSION No.EF103141)。序列分析表明，乳糖酶基因组DNA序列长3368bp，其中含有8个内含子，cDNA编码区长2967bp，共编码988个氨基酸，氨基酸序列中共含有12个潜在的糖基化位点。并将此基因与不同来源的乳糖酶基因进行了同源性比较     

大白菜低温胁迫转录因子BcICE1的克隆及表达分析

本研究采用RT-PCR结合SON-PCR技术从大白菜(Brassica pekinens)中分离了BcICE1基因的cDNA序列(GenBank登录号为HQ902162).该基因全长1 591 by,含有一个1494 by长的开放阅读框,编码497个氨基酸.序列比对表明,该蛋白C端含有一个典型的bHLH结构域,与其他植...     

水稻胆碱单加氧酶基因的克隆与表达分析

高等植物中甜菜碱由胆碱经两步氧化反应合成,其中由胆碱单加氧酶(CMO)催化第一步氧化反应,甜菜碱醛脱氢酶(BADH)催化第二步氧化反应.采用生物信息学技术和RT-PCR的方法从水稻幼苗组织中分离得到了水稻CMO基因的cDNA克隆,将其命名为OsCMO.该基因含有10个外显子和9个内含子,其开放阅读框编码一条长为410个氨基酸残基的多肽,与拟南芥、山菠菜、苋、碱蓬和甜菜等植物的胆碱单加氧酶的氨基酸序列的一致性50%～62%.mRNA分析表明OsCMO基因在水稻幼苗组织中的表达受高盐、低温和干旱等胁迫的上调诱导表达,表明该基因可能在抵御非生物胁迫中发挥重要作用.     

青稞HvBADH1基因的克隆及其转化烟草的初步研究

应用RT-PCR结合RACE技术, 从青稞总RNA中扩增得长度为1 512 bp的甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因cDNA全长编码序列。通过氨基酸同源性比对, 发现该序列的推定表达产物与大麦BADH同工酶BBD2的同源性为98.4%, 而与小麦、玉米和水稻等禾本科作物的BADH同源性分别为97.0%、84.7%和85.1%。将克隆到的青稞cDNA序列命名为HvBADH1, 投递到GenBank, 获得收录号EF492983。HvBADH1可以在原核表达系统TB1-pMAL c2x中正常表达出分子量为54.2 kD的多肽链。将HvBADH1的编码ORF, 插入到添加了植物表达CaMV 35S启动子和Nos polyA终止子调控元件的植物表达载体pCAMBIA1301质粒相应的克隆位点中, 构建了HvBADH1基因的农杆菌植物转化系统LBA4404(pCAM-ba)。进而采用农杆菌介导法, 将HvBADH1基因导入烟草中, 对所获得的潮霉素抗性烟草株系进行PCR、Southern blot和RT-PCR等分子生物学检测, 结果表明, 在得到的2个转基因株系中, HvBADH1基因已整合到受体植物基因组中, 并且可以在mRNA水平上进行转录。     

玉米BADH基因的克隆与序列分析

Betaine was accumulated as a nontoxic and protective osmolyte in water-dificit and salt-stressed plants. Betaine aldehyde dehydrogenase for glycine betaine synthesis is an important enzyme. The BADH gene of Maize was cloned by RT-PCR and RACE. The gene is 1 762 bp in length, including an open reading frame of 1 515 bp.Its nucleotide sequence shares 95% with the the partial cDNA of BADHI from Sorghum bicolor. Its deduced amino acid sequence contains the conserved domain sequence “VTLELGGKSP“ of ALDH, and a tripeptide SKL at its C-terminal, a signal targetting to the microbodies. The phylogenetic tree of 20 BADHs was constructed,which corresponds to the classical botanical division of plant, the BADH of maize is closest to the one of Oryza Sativa.     

烟夜蛾幼虫中肠类钙粘蛋白基因cDNA片段的克隆与序列分析

类钙粘蛋白位于昆虫中肠刷状缘膜囊泡上,该蛋白作为Bt毒素的受体可以与其结合导致昆虫死亡,因此,昆虫对Bt毒素的抗性与类钙粘蛋白有密切关系。本研究以烟夜蛾五龄幼虫中肠的总RNA为模板,根据已经克隆的其他昆虫的类钙粘蛋白基因序列设计引物,利用RT-PCR技术扩增出了烟夜蛾类钙粘蛋白基因的cDNA片段,将其连接到pMD18-T载体,转化大肠杆菌后筛选阳性克隆并进行序列测定,测序得到的1 335 bp的片断编码444个氨基酸残基。序列分析表明,该氨基酸序列与棉铃虫和烟芽夜蛾类钙粘蛋白的一致性分别为95%和86%。研究结果对进一步研究昆虫对Bt毒素产生抗性的机制以及发展分子技术快速检测并监测田间昆虫抗性基因的产生奠定了基础。     

油木奈果实β-tubulin cDNA的克隆及表达

以油木奈果实为材料,应用RT-PCR和RACE技术克隆其β-tubulin cDNA,并采用半定量的方法对该基因进行表达量分析。结果表明,油果实β-tubulin的cDNA全长1606 bp,包含一个1341 bp的开放阅读框,共编码446个氨基酸。对其推导氨基酸序列进行比对分析,表明油果实β-tubulin与众多植物来源的β-tubulin具有很高的相似度。通过设计特异性引物,对果实11个发育时期β-tubulin表达量分析的结果表明,该β-tubulin基因表达量稳定,说明该β-tubulin可作为油果实整个生长发育时期内参基因使用,可以在为进一步应用实时荧光定量PCR技术研究油果实发育相关基因的表达奠定了试验基础。