犊牛轮状病毒的分离鉴定

将犊牛腹泻粪便经轮状病毒酶标诊断试剂盒检测阳性者,应用Marc145细胞培养,从河北省奶牛场分离出1株牛轮状病毒。分离毒株在Marc145细胞上产生明显的细胞病变,测其TCID50=10-4.70/0.1mL;提取该分离毒株的RNA,经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测其电泳型为4∶2∶3∶2型,属于A群轮状病毒;RT-PCR方法扩增出342bp的目的条带,特异性检测均未见目的条带,进一步证实为轮状病毒。     

G6P[5]型牛轮状病毒的分离鉴定

轮状病毒(Rotavirus,RV)是全世界范围内引发多种幼龄动物及婴幼儿病毒性腹泻的最主要病原之一,给畜牧业发展和人类健康造成严重危害。通过RT-PCR对来自宁夏犊牛腹泻粪样进行检测,选取阳性样品经MA104细胞进行病毒分离。细胞盲传4代后出现CPE,至7代后细胞CPE现象明显,获得1株牛轮状病毒,扩增VP7、VP4基因并测序分析,结果表明该分离株属于G6P[5]型轮状病毒,命名为NX28。研究明确了G6P[5]型在国内牛群中的存在及流行,并为下一步的牛轮状病毒的分子流行病学研究奠定基础。     

牛轮状病毒的分离及其RT-PCR鉴定

采用MAl04细胞从疑似轮状病毒腹泻犊牛粪样中进行轮状病毒分离，盲传4代后接种细胞出现明显细胞病变（CPE），对分离病毒进行核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳条带为4：2：3：2型，具备典型A群轮状病毒特征。依据NCBI等登录的牛轮状病毒的VPl基因序列设计一对引物，对其VPl基因进行克隆及序列分析，结果分离毒与国外牛轮状病毒分离株RF的核苷酸同源性为98．9％，与UK的核苷酸同源性为91．5％，证明分离毒株是一株牛轮状病毒。     

新生牛轮状病毒的分离及其基因型鉴定

为了解轮状病毒在腹泻奶牛中的流行情况,从2008年12月到2009年6月,我们在大庆某牛场共收集117份小于7日龄新生牛的腹泻标本,用A群轮状病毒抗原诊断试剂盒对腹泻标本进行检测;应用MA104细胞对阳性标本进行分离,扩增细胞分离株保护性抗原VP7基因,并对该基因进行序列分析。腹泻标本中有10份标本(8.5%)经A群轮状病毒抗原检测试剂盒确认为阳性,成功的分离出一株轮状病毒,命名为:DQ-75,分离株DQ-75VP7基因的基因型是G10,该分离株中VP7基因与现有G10型轮状病毒毒株的VP7编码区氨基酸的系统进化树分析提示其可能是随着奶牛的购入而进入我国。     

四株猪轮状病毒对不同细胞的感染性试验

测定了４株狸轮状病毒对７株传代细胞和１１种原代细胞的感染敏感性。结果是：四株猪轮状病毒，都能迅速适应于ＭＡ１０４传代细胞株上生长敏殖，并能连续传至数十代以上，耐对其他的传代细胞和原代细胞均不适应。     

猪轮状病毒DN30209株VP4全长蛋白表达及多抗制备和鉴定

为开展猪轮状病毒（PRV）及其VP4蛋白相关特性研究,参照GenBank所收录的猪轮状病毒JL94、OSU等株序列设计一对特异性引物,从实验室分离鉴定的猪轮状病毒DN30209株扩增约2330 bp VP4全长基因,并成功构建重组质粒VP4-pMD18-T。重组质粒经测序、序列比对及分析。结果表明,DN30209株VP4全基因长2331 bp,与参考株JL94的核苷酸同源性为99.7%,氨基酸同源性为99.5%。将VP4基因连接到pGEX-6P-1原核表达载体中,构建并筛选出阳性原核表达载体重组质粒VP4-pGEX-6P-1。阳性重组质粒转化Rosetta宿主菌感受态细胞中,经IPTG诱导,获得以包涵体形式表达的重组蛋白,融合蛋白大小约为112 ku,与预期大小相符。回收、纯化并复性该蛋白,将其作为免疫原免疫大白兔,制备兔抗PRV VP4全长蛋白多克隆抗体,间接ELISA测定多抗效价到1??105,间接免疫荧光（IFA）和免疫印迹（Western blot）检测表明该多抗均可与PRV具有很好的抗原抗体反应性,为猪轮状病毒研究提供有效实验材料。     

牛病毒性腹泻病毒RT—PCR检测方法研究

【目的】建立快速、简便、特异的检测牛病毒性腹泻病毒抗原的RT-PCR方法;【方法】根据已发表的牛病毒性腹泻病毒株(BVDV)5’端非编码区保守序列设计合成了两条引物,应用RT-PCR技术对两株BVDV标准株(OregonC24V and NADL)进行基因扩增,对扩增产物进行酶切鉴定。同时设猪瘟兔化弱毒疫苗株、轮状病毒株、MDBK细胞作对照;【结果】两株BVDV标准株均扩增出了长度为325bp的片段,扩增产物经酶切后形成长度为111bp和214bp两条片段,而对猪瘟兔化弱毒疫苗株、轮状病毒株、MDBK正常细胞扩增均为阴性,与预期结果一致。【结论】PCR检测方法可以快速准确地对牛病毒性腹泻-黏膜病作出诊断。该方法的敏感性可高达10-1TCID50。     

抗腺病毒五邻体单克隆抗体的制备及双抗夹心ELISA方法的建立

为获得稳定性好、特异性强、效价高的抗腺病毒五邻体单克隆抗体,用腺病毒五邻体基因工程表达抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,以腺病毒五邻体为筛选抗原对融合后的杂交瘤细胞间接ELISA进行筛选.结果表明:试验获得5株杂交瘤细胞,标记为3C4、4C4、4D7、4F2和4H3,4D7免疫球蛋白亚类为IgG2a,其余4株为IgG1;对5株细胞连续3个月体外传代试验和小鼠腹水连续传代试验,5株细胞都能持续稳定分泌单克隆抗体,对细胞上清和腹水采用间接ELISA进行效价测定,细胞上清效价稳定维持在2 000左右,腹水效价稳定维持在200 000以上,且与引起腹泻的鼠伤寒沙门氏菌和轮状病毒无交叉反应;对其中可以配对的2株单抗4D7、4F2建立双抗夹心ELISA,可以应用于临床检测腺病毒.     

兔轮状病毒致病性研究

 以云南腹泻死亡幼兔肠内容物分离到的AN₁和AN₂两株兔轮状病毒对40～50日龄日本大耳兔口服接种.于接种后2～4天,有4/7只接种兔出现轻度至中等程度的腹泻,而阴性对照兔和接种异种SA—11病毒株的兔均正常,无腹泻.收集实验患兔肠内容物,经电镜、斑点酶联免疫吸附试验,病毒空斑试验,核酸聚丙稀酰胺凝胶电泳检测及感染小肠超微结构观察,均为轮状病毒阳性,病毒滴价为10⁵～10⁸PFU/ml,持续排毒2～7天.     

大熊猫轮状病毒可视化LAMP检测技术的建立及应用

根据大熊猫轮状病毒CH-1株VP4基因设计3对引物,建立大熊猫轮状病毒可视化环介导等温扩增(LAMP)检测技术,对其反应条件进行优化及特异性和灵敏度进行验证.结果 表明:用可视化LAMP方法检测大熊猫轮状病毒时,在62℃条件下,反应体系中加入终浓度为8 mmol/L Mg2+、0.6 mol/L甜菜碱、12 U Bst...     

单稀释法间接ELISA和终点法中和试验检测犊牛轮状病毒疫苗抗体效价比较

用NCDV标准毒株接种恒河猴肾细胞(MA-104),制备病毒抗原液,制成油乳佐剂灭活疫苗进行3月龄以内的犊牛田间免疫试验.结果表明,免疫组的OD492 nm平均值为0.6,免疫40 d后达到峰值1.5,免疫后60、90 d仍维持较高的抗体效价,OD492 nm平均值分别是1.4和0.9.中和抗体效价在二次免疫时、二次免疫40、60、90 d平均值分别为56.668、413.025、314.9、104.64.实验评价OD492 nm值和血清中和抗体效价关系,相关性很大,并证明这种疫苗对预防轮状病毒引起犊牛腹泻是安全有效的.     

猪轮状病毒与猪传染性胃肠炎病毒混合感染的实验室诊断

[目的]对海南省某猪场腹泻病死仔猪病原进行实验室诊断。[方法]通过临床症状观察与病理剖检,结合RT-PCR方法和病毒的分离培养进行病原鉴定。[结果]经过RT-PCR扩增,获得了PRV和TGEV阳性目的片段;应用MA-104细胞与PK-15细胞分别进行PRV与TGEV的分离培养后,可见典型的细胞病变,经过RT-PCR进一步鉴定最终确诊为PRV和TEGV混合感染。[结论]通过采用紧急接种和保守治疗等综合防治措施,获得了较好的防控效果。     

犊牛腹泻轮状病毒在3个传代细胞上培养特性的研究

对犊牛腹泻轮状病毒（ＮＣＤＶ）在３种传代细胞系上进行了培养，并将其培养特性进行了比较研究。结果表明：犊牛腹泻轮状病毒在ＭＡ－１０４细胞上生长，其病毒抗原的生长部位在细胞浆，培养后可出现细胞病变；犊牛腹泻轮状病毒在ＬＬｃ－ｍｋ２细胞上也生长，且随着培养代次的增加，病毒抗原的滴度相应增加，增长到一定滴定后即较稳定。     

广东6株纤维堆囊菌的分离与鉴定

采用滤纸片富集法对采自广东省信宜的土壤样品进行了粘细菌的分离和纯化,共获得6个菌株(Soce M1~So ce M6)。利用体视显微镜、倒置显微镜和扫描电镜对这些菌株的子实体、菌落及营养细胞等进行了形态学的观察和特征描述。同时,还测定了6个菌株的16SrRNA基因序列,应用blast程序与GenBank中已知的纤维堆囊菌及其他粘细菌序列进行比对,并采用邻位相连法(Neighbor-Joining,NJ)构建了分离菌株与相关菌株的系统发育树。结果表明:6个菌株均为纤维堆囊菌(Sorangiumcellulose),但这些菌株在形态特征和16SrRNA基因进化距离上存在着一定的差异,表现出纤维堆囊菌菌株的形态多样性和遗传多样性。     

鸡致病性大肠埃希氏菌的菌毛血清型检测

使用透射电镜对3株鸡致病性大肠埃希氏菌(E.coii)的菌型进行了形态观察,发现其中2株菌具有纤细、中空、挺直的菌毛,另外1株未见菌毛。有菌毛的2株菌与K88、K99、987P和F41单因子兔高免血清的玻片凝集反应阴性,而与2株兔源的具菌毛的E.coli菌的兔高免血清呈强阳性。未见菌毛的那株菌与上述所有血清的玻片凝集反应均呈阴性。     

H1亚型猪流感病毒的分离鉴定

从山东、浙江、湖南、广西等地区各猪场采集30份疑似猪流感病猪的病料,通过鸡胚培养、血凝及血凝抑制试验、电镜观察、RT-PCR和测序分析进行了分离鉴定。结果从山东和湖南两地分离到4株有血凝活性的病毒,其中山东的2株病毒与新城疫病毒阳性血清的血凝抑制试验为阳性,通过电镜观察湖南的2株病毒具有猪流感病毒的特征,且与抗H1亚型猪流感病毒阳性血清的血凝抑制试验为阳性;根据H1亚型猪流感病毒HA基因设计引物,利用RT-PCR扩增出543bp片段,经序列分析证实该病毒为H1亚型猪流感病毒。     

青枯假单胞杆菌产生细菌素的研究

测定来自全国不同寄主和地区的211个青枯病细菌(Pseudomonassolanacearum)菌株产生细菌素的能力,结果表明,有80％分属于不同小种和生物型的8个指示菌能产生细菌素,其中能产生细菌素的桑菌株占其总数的94.2％。 用7个拮抗作用强而稳定的菌株测定对211个供试菌株的拮抗作用,结果表明,不同菌株产生细菌素的能力和拮抗范围有差异。其中油橄榄菌株(OE-104)和桑菌株(MA-1、MA-701)拮抗能力最强,拮抗范围最广。不同小种、生物型及寄主来源的菌株间的桔抗作用大于来源相同菌株间的拮抗作用。此外,试验证明培养温度、培养基成分和培养时间对菌株产生抑制圈的大小有影响。这些结果对筛选青枯病细菌的产细菌素拮抗菌有参考价值。     

中国东北地区3株日本脑炎病毒株的分离鉴定及基因分型

从黑龙江省某3个猪场采集疑似为日本脑炎病毒感染的病、死猪的脏器以及全血,进行病毒的细胞培养,蚀斑纯化,间接免疫荧光试验,电镜下观察病毒粒子的形态,及RT-PCR检测。结果显示,盲传三代后,出现明显的细胞病变(CPE+~CPE+++);荧光显微镜下细胞胞质内呈现不同强度的绿色荧光信号;电镜下的病毒粒子为40~60nm的球型粒子;PCR检测为日本脑炎病毒阳性。通过对3株分离株Prm扩增序列比较,此3株分离株为基因Ⅲ型。